Name: 从胚胎斑马鱼的毛特纳细胞膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习膜片钳记录技术，用于研究斑马鱼胚胎毛特纳神经元的突触电流与兴奋性特性。该方法可分析发育中神经元的电压门控通道活动及动作电位，为神经发育研究提供可靠电生理手段。

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本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大创新基金会（CFI）向 DWA 提供的资助。

1. 准备与解剖
<ol>
	<li>准备一个内衬Sylgard的解剖皿。使用WPI公司（美国佛罗里达州萨拉索塔；供应商列于表2）的记录室作为解剖皿（图1）。这些记录室设计用于容纳载玻片，并使用小型塑料垫圈作为Sylgard的模具。首先用润滑脂将垫圈固定在载玻片上，然后向垫圈中心加入液态Sylgard。Sylgard将在过夜期间固化，形成位于载玻片上的小型圆形基底，即为解剖皿的底部。将该载玻片放入记录室中，作为固定标本的记录室基底（图1）。</li>
	<li>配制表3中列出的溶液。细胞外溶液应置于室温下，而细胞内溶液应保持无菌状态。也可向细胞内溶液中添加荧光黄（0.1%），以便在实验结束时观察M细胞的形态，从而确认细胞身份（图2）。</li>
	<li>将野生型斑马鱼胚胎在卵水中于28.5 °C条件下培养，并根据Kimmel et al. 10 的方法进行收集和分期。进行解剖时，将胚胎转移至兼作记录室的解剖皿中。使用接近生理盐水成分的麻醉盐溶液（0.02%三卡因；溶液1，表3）麻醉7–10分钟。可通过轻捏尾部观察其反应来判断麻醉是否充分。</li>
	<li>在解剖显微镜下使用25倍放大倍数，用直径0.001&#34;的钨丝（Scientific Instrument Services, Inc.，美国新泽西州Ringoes）穿过胚胎的脊索，将其固定在衬有Sylgard的解剖皿上（图1）。钨丝可使用精细解剖剪轻松剪成小段。</li>
	<li>将解剖显微镜的放大倍数调整至40–50倍以进行解剖操作。胚胎固定后，使用精细镊子（Dumont #5）去除下颌、眼睛和前脑。</li>
	<li>小心地用镊子在脊索与脑组织之间分离，轻轻将后脑从下方的脊索上剥离。随后将后脑轻轻翻转，使腹侧面朝上。此位置可良好暴露M细胞，这些细胞在幼小胚胎中通常位于腹侧面下5–10 μm处，在较老的幼鱼中则约为20–50 μm（图2A）。</li>
	<li>小心地将标本转移至记录装置，以进行膜片钳实验。M细胞可通过诺马尔斯基微分干涉差（DIC）成像进行观察，尽管也可使用其他成像模式（例如德国Luigs和Neumann公司的霍夫曼调制对比或Dodt梯度对比成像）。</li>
</ol>
2. 膜片钳记录（全细胞模式）
<ol>
	<li>所有记录均在全细胞膜片钳模式下进行11。将记录室置于电生理实验装置的显微镜载物台上。我们的载物台是固定的，直立式膜片钳显微镜则固定在可移动的显微镜平台或显微镜位移器上。</li>
	<li>使用水平拉制仪（P-97；Sutter Instruments Co.）从WPI公司提供的薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管拉制膜片钳微电极。经火焰抛光至边缘光滑后，微电极尖端直径约为0.2–0.4 μm，柄部锥形长度约为4 mm。</li>
	<li>将微电极连接至电生理装置的放大器头阶段。保持头阶段与水平轴呈约45°角至关重要，因为这可确保微电极以适合在Mauthner细胞上形成高阻封接的角度进入。</li>
	<li>在即将进入浴液前，向微电极内施加少量正压，以减少污染尖端的可能性。记录微小兴奋性突触电流（mEPSCs）时，浴液中包含1 μM TTX以阻断动作电位，5 μM 番木鳖碱以阻断甘氨酸受体，以及10 μM 荷包牡丹碱或100 μM 印防己毒素以阻断GABAA受体。记录微小抑制性突触电流（mIPSCs）时，浴液中包含1 μM TTX、犬尿酸，以及根据所关注的受体活性选择荷包牡丹碱或番木鳖碱。</li>
	<li>以微电极内施加少量正压的方式接近M细胞。正压可轻柔地使细胞侧向移动，当微电极正对细胞上方时，会在细胞膜上形成一个小凹陷。将微电极停留数秒，以轻柔清洁细胞表面，从而利于微电极与细胞膜之间形成牢固的封接。释放微电极内的正压后开始形成封接，同时施加短暂负压并配合负电极电位，可在数秒内形成吉欧姆（GΩ）级封接。</li>
	<li>将放大器的钳制电位调整至-60 mV。通过一系列短暂的吸力脉冲破裂细胞膜。立即开始记录膜电位，并尽量减少电容伪迹。对细胞电容（Cm）和通路（串联）电阻（Ra）进行70–85%的补偿。应常规每30秒至1分钟监测一次Ra，若变化达20%或以上，应中止实验。</li>
	<li>实验结束后，在已获取足够数据的情况下，使用镊子移除延髓组织以处死标本。此时可开始数据分析。</li>
</ol>

<ol><li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner+cell+half+a+century+later%3A+a+neurobiological+model+for+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li>
<li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li>
<li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S+.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphants%3A+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. 1, 5, University of oregon Press. (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li>
<li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案可用于对M细胞及其同源细胞进行膜片钳记录。该技术具有挑战性，在整个操作过程中需在多个关键环节格外注意。接下来我们将讨论其中一些要点，并提供一些实用建议以确保实验成功。
解剖/记录室的构建是实验中的关键环节。除非使用微分干涉差（DIC）显微技术，否则M细胞很难被观察到。诺马尔斯基（Nomarski）DIC在洁净的玻璃盖玻片上效果最佳，但我们发现，一层非常薄的Sylgard（约1–2 mm）不会显著扭曲DIC图像，以致影响M细胞的识别。因此，我们采用底部带有薄玻璃盖玻片的记录室，并在其上放置一个小型塑料垫圈（直径约5 mm）。在培养皿中混合Sylgard 184后，使用巴斯德移液管将液态Sylgard小心地加入垫圈内部。Sylgard可在室温下固化数天，也可加热以加速固化过程。Sylgard固化后可将垫圈移除，但此步骤并非必需。一旦解剖/记录室制备完成，可在需要更换新的Sylgard包被玻璃片之前持续使用数周。
该实验步骤的下一步是在实验当天配制所有相关溶液（表3）。除ATP和GTP外，含有其余所有成分的细胞内溶液可预先配制，并以5 ml分装液置于-20 °C保存。记录当天，将一份分装液解冻至室温，然后加入新鲜的ATP和GTP。将溶液调节至280 mOsm和pH 7.4。据我们经验，每日新鲜添加ATP和GTP可获得良好的记录结果。所有溶液均需保持无菌，以最大程度确保实验成功。
细胞内液必须通过 0.22 μm 滤器（Sigma）过滤，以去除可能影响记录的小颗粒和碎片。为此，我们首先将细胞内液吸入 1 ml 注射器中，将滤器连接至注射器末端，并在滤器末端连接一个经加热拉制成细尖的塑料移液枪头。这样即可将过滤后的细胞内液直接施加到玻璃膜片钳电极的内部。
溶液配制完成后，即可对胚胎进行麻醉和解剖。在开始解剖前，应仔细评估生物体的发育阶段。同一批次中的每个胚胎发育速度略有差异，因此在判断其发育阶段时，必须依据既定的操作规程10,13，通过体节数量、整体体形以及卵子受精时间等表型特征进行判断。所有解剖操作均使用Dumont #5精细镊子进行。镊子必须保持锋利且处于良好工作状态，否则将难以去除覆盖在后脑上的皮肤以及后脑腹侧表面的结缔组织。我们通常在使用数周后自行使用磨刀石对镊子进行打磨 sharpening。
为了将鱼固定在薄层Sylgard上，我们使用直径为0.001英寸的细钨丝制成的固定针。这些针需在解剖显微镜下用旧的显微解剖剪刀剪制，其尺寸足够小，可直接穿过脊索。若在其他位置固定胚胎，则无法实现有效固定，从而使解剖操作几乎无法进行。初学者在学习记录技术时，可能难以将M细胞与其同源细胞（特别是位于邻近菱脑节——菱脑节5中的MiD2 cm）区分开来。在某些胚胎中，这两对细胞的大小看起来相似。耳石可作为便利的解剖标志，有助于M细胞的识别。在48小时受精后（hpf），M细胞紧邻耳石分布；尽管在解剖过程中耳石会被移除，但它们会在后脑外侧区域留下轻微的损伤痕迹，从而标示其原始位置。表达绿色荧光蛋白（GFP）或其他荧光标记物的转基因鱼，为新手实验者提供了极佳的实验材料。据我们观察，M细胞在48 hpf时的膜电容约为18–24 pF，而较小的同源细胞则接近12–14 pF。与较小的细胞相比，表面积较大的细胞具有更高的膜电容值（以皮法拉（pF）为单位）。因此，膜电容可作为细胞大小的粗略指标：较大的细胞具有更高的电容值。这一电生理特性可作为区分M细胞与其同源细胞的另一依据。最后，我们通常在记录（细胞内）溶液中加入 Lucifer yellow，以便在记录完成后通过荧光成像对所研究的细胞类型进行确切鉴定。
移液管尖端电阻在 3.5–4.5 MΩ 范围内，是在尖端尺寸与较低接入电阻（通常为 8–15 MΩ）之间取得的最佳平衡。这对于动力学较快的事件尤为重要，其上升时间约为 0.1 毫秒（20–80%），指数衰减时间常数约为 0.5 毫秒12,14,15（图 3A 和 图 3B）。数据采集的数字化频率为 50–100 kHz，并以 5–10 kHz 的低通滤波频率进行滤波。关于膜片钳移液管，我们发现无需进行火焰抛光即可获得记录，但经验表明，与未抛光的移液管相比，抛光后的移液管在形成良好封接方面成功率略高。由于移液管尖端相对较大，在进入溶液前无需向移液管施加过大的正压。施加适当正压需要一定经验，压力过大将导致细胞过度移动，从而阻碍封接形成，还可能因细胞轻微偏离原始位置而损伤突触连接。反之，压力过小则会导致尖端污染，无法充分清洁细胞表面，难以形成良好封接。只有通过大量实践和经验积累，才能掌握合适的压力程度。向移液管施加负电压有助于促进封接形成。我们通常获得的封接电阻为 1.2–2 GΩ，非常适合突破进入全细胞记录模式。
当需要将药理学试剂施加到细胞质中时，我们会在填充移液管之前将其加入细胞内溶液中。在配制移液管溶液时应格外注意，避免试剂因与0.22 μm滤器结合而导致损失。因此，我们首先过滤细胞内液，然后小心地将药理学试剂加入过滤后的溶液中。将化合物施加至细胞内区域具有一系列独特的挑战。例如，将药物加入细胞内液通常会降低形成吉欧姆（GΩ）封接的几率，但一般不会严重阻碍实验的进行。
应当认识到，以这种方式使用药理学试剂无法记录最合适的对照，因为试剂从全细胞记录模式开始时即可立即作用于细胞。因此，尽管我们在整个实验过程中记录数据，但必须意识到次优的对照方法是向细胞内施加该试剂的无活性形式。在许多情况下，这种无活性形式可以是经加热灭活的化合物、随机序列肽段，或由供应商提供的无活性异构体。
我们以突触电流（mPSCs）、电压门控电流和动作电位的形式获取数据。微型电流可由若干优秀的程序进行分析（如pClamp、Axograph等），但我们更倾向于使用Axograph X（John Clements）。Axograph X可在Windows和Macintosh平台上运行，既可用于电生理数据的采集，也可用于数据分析。mEPCs通过实验者自行选择的模板进行采集，该模板来源于记录本身。可对单个事件的特性（如上升时间、幅度、半宽和衰减时间等）进行分析。我们将数据表格导出至Kaleidagraph（Synergy Software），以便生成图表，包括从Axograph X导出的事件轨迹图。
实验中较为困难的一个方面是判断记录是否足够良好，以提供干净且可靠的数据。例如，在从具有粗大轴突和广泛树突结构的M细胞记录微小兴奋性突触电流（mPSCs）时，可能会出现空间钳制问题。在进行电压钳制时，通常可以较好地控制移液管尖端处的电压（特别是当接入电阻（Ra）较低时），但可能无法有效控制远离移液管尖端的树突或轴突部分的膜电位。判断细胞是否实现良好空间钳制的一种方法是绘制所记录mPSCs的上升时间与幅度的散点图。若数据之间存在相关性，则提示空间钳制不充分。换句话说，如果空间钳制效果较差，则发生在移液管附近区域的mPSCs将比远离移液管区域发生的事件具有更快的上升时间和更大的幅度。如果确实存在这种相关性，则说明数据存在问题，不能使用。
需要解决的电生理记录的另一个方面是漏电流问题。当对细胞进行电压钳制以记录电压门控电流（如 Na+ 或 K+ 电流）时，这一点尤为关键。当膜电位偏离静息状态时，漏电流会与电压门控行为同时被记录下来。漏电流（IL）是由通过非电压门控通道的钾离子（IK）、钠离子（INa）和氯离子（ICl）电流共同组成，会掩盖目标电活动，因此必须从记录中扣除。放大器能够在记录过程中在线执行此功能，通常称为 P/N 协议。在 P/N 协议期间，放大器会从静息电位施加多个小幅去极化（或超极化）脉冲，并记录由此产生的漏电流。必须使用足够小的脉冲幅度，以避免激活电压门控通道。这些脉冲期间产生的电流被记录并取平均值，以便从电压门控通道活动中扣除这些漏电流。
最后，需要考虑发生在电极尖端细胞内液与细胞外液交界处的液接电位。细胞内液和细胞外液通常含有不同的离子，其离子活度和迁移率也各不相同。迁移率较低的较大离子相较于较小离子对离子移动具有更高的电阻，这可能在溶液交界处产生虽小但显著的电位差。在确定细胞所经历的适当电压时，必须计入这一液接电位的影响。
本文介绍的技术是本实验室多年来一直使用的方法。然而，记录M细胞活动的方法还有其他替代方案。其中最著名的是Joseph Fetcho及其同事开发的一种优秀制备方法，该方法可通过背侧表面以较本文所述更少侵入性的方式记录较大龄幼鱼（4至5日龄）的M细胞活动16。我们曾尝试过类似技术，但发现从后脑的腹侧接近M细胞更为方便，因为在该位置细胞更靠近脑表面，尤其是在幼龄鱼（i.e. 24小时受精后至72小时受精后）中更为明显。此外，从背侧入路通常需要使用在M细胞中表达荧光标记的转基因品系，这可能为记录引入额外的变量。而使用野生型鱼则不存在这一问题。然而，本文所述技术的局限性在于仅适用于较年轻的动物（24小时受精后至72小时受精后）。因此，每种方法均有其优势与局限性。
学生 t 检验可用于比较两组数据，而方差分析（ANOVA）可用于比较多组数据。必须谨慎选择适用于参数数据与非参数数据的相应事后检验方法。

发育神经生物学领域的一个重要问题涉及突触可塑性现象在突触成熟过程中的作用。我们的研究致力于理解突触发育背后的可塑性机制，最终目标是结合突触发育的背景来阐明动物行为。为了实现这一目标，我们建立了一种在模式生物（斑马鱼，Danio rerio）中基本保持完整的实验体系；该生物自20世纪90年代末以来已被广泛用于发育研究。 
 斑马鱼在神经发育研究中具有多项显著优势。例如，其基因组已被测序，可利用吗啉代寡核苷酸进行基因敲低，或使用锌指核酸酶进行基因敲除，从而抑制基因活性和蛋白表达。此外，也可开展基因过表达研究，并构建转基因品系7-9。斑马鱼胚胎易于获取且数量丰富，其胚胎透明的特性非常适合成像和光遗传学研究。同时，可进行行为学分析，并在基本完整的有机体上对肌纤维、脊髓神经元以及后脑神经元开展电生理实验，从而在活体（in vivo）条件下研究细胞功能。尤为重要的是，我们能够在不同样本制备之间，不仅针对同一类细胞，而且针对完全相同的成对神经元，重复检测其突触活动。换句话说，斑马鱼是少数几种能够在原位（in situ）反复定位同一神经元以研究其发育过程的脊椎动物模型之一。 
 为了尽可能保持神经环路的活性，我们建立了一种实验制备方法，即在对M细胞进行膜片钳记录时，保留延脑和脊髓的完整性。在此制备过程中，轻柔地去除覆盖脑部的眼睛、下颌和皮肤组织，并将延脑从脊索上剥离，从而暴露延脑的腹侧面。网状脊髓神经元位于表面下几微米深处，相对易于接近。在受精后48小时（hpf；部分缩写见表1），这些细胞具有良好的电学紧凑性，能够准确记录其突触活动（包括兴奋性和抑制性电流）、电压门控电流以及动作电位。 
 我们的研究结果表明，突触发育和成熟的许多方面发生在孵化前24小时内，因此我们的大部分关注集中在24 hpf至72 hpf年龄范围内的生物体。然而，到72 hpf时，M细胞的电学结构不再紧凑，难以实现有效的空间钳制。该技术不仅可用于记录M细胞，还可用于记录其同源细胞MiD2 cm和MiD3 cm。理论上，也可同时进行双细胞记录，例如从脊髓中的初级运动神经元和M细胞同时记录，但该操作难度较大，且有人认为，这种高难度技术所带来的益处可能并不值得付出如此巨大的努力。

<table><tbody><tr><td>解剖皿</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0291</td><td></td></tr><tr><td>0.001&quot; 钨丝</td><td>Scientific Instruments Services Inc.</td><td>W406</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige Group</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td> upright 型膜片钳显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLFSA</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Siskiyou Inc.</td><td>MX7500</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>200B</td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp9</td><td></td></tr><tr><td>Axograph X</td><td>Axograph</td><td>Axograph X</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎mauthner细胞的膜片钳记录

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner 细胞（M-细胞）是位于硬骨鱼类后脑中的大型网状脊髓神经元。这类神经元在一种被称为 C 型启动或逃避反应的特征性行为中起关键作用，该行为在生物体感知到威胁时发生。M-细胞在成年金鱼中已被广泛研究，研究表明其可接收多种兴奋性、抑制性及神经调制信号1。我们一直在研究斑马鱼胚胎中的 M-细胞活动，以探讨脊椎动物模型中突触发育的某些方面。在 20 世纪 90 年代末，Ali 及其同事建立了一种斑马鱼胚胎 M-细胞的膜片钳记录模型，其中中枢神经系统基本保持完整2,3,4。当时的目标是在维持脑-脊髓功能连接完整的前提下，记录后脑神经元、脊髓神经元以及躯干骨骼肌的突触活动。这一模型至今仍在我们实验室中使用。为了研究发育过程中突触可塑性的机制，我们记录了发育中 M-细胞的兴奋性（AMPA 和 NMDA 介导的）5,6 以及抑制性（GABA 和甘氨酸介导的）突触电流。重要的是，这种独特的模型使我们能够在不同制备样本之间反复回到同一个细胞（即 M-细胞），从而在胚胎生物体中精细地研究突触可塑性与神经发育。该模型的优势包括：1）M-细胞上保持完整且具有功能的突触连接；2）制备成本相对较低；3）可获得大量易获取的胚胎；4）在每次制备中均可重复定位到同一种细胞类型（i.e. M-细胞），从而可在个体细胞水平上逐条鱼地比较突触发育过程；5）由于胚胎具有透明特性，可对整个制备样本进行成像。

本文介绍了一种在斑马鱼中对网状脊髓神经元（特别是M细胞）进行全细胞模式膜片钳记录的方法。当然，也可采用其他膜片钳模式进行记录，例如细胞贴附式、膜内向外式和膜外向外式。可获取的数据类型不仅限于本文所展示的内容，我们力求提供电压钳模式下突触活动（兴奋性和抑制性）以及电流钳模式下动作电位的示例。随着生物体的发育，M细胞的树突逐渐变得更加复杂和发达，此时充分实现电压钳制和空间钳制的能力会受到影响，因此电流钳模式成为首选的记录方式。
图3展示了在河豚毒素（TTX，1 μM）以及阻断GABA和甘氨酸受体的药理学试剂存在条件下，48小时受精胚胎中记录到的兴奋性AMPA和NMDA受体电流的代表性结果。当M细胞在-60 mV电压钳制时，突触电流主要由AMPA受体激活产生（图3A）。对这些事件的采集与分析可获得上升时间、衰减时间、幅度和频率等参数。AMPA介导的事件通常具有较快的上升时间（20-80%上升时间约为0.1毫秒）和衰减时间（约0.5毫秒），平均幅度约为25 pA。当M细胞钳制在+40 mV时，记录到的外向电流则来源于AMPA和NMDA受体的共同活动（图3C和3D）。NMDA受体电流的时间过程较AMPA受体电流更长，且需在正电位下或无镁溶液中记录，以解除镁离子对NMDA受体的阻断作用2,6。图3D所示的平均mEPSC代表在+40 mV下记录到的AMPA与NMDA受体电流的混合成分。
图4展示了从Mauthner细胞记录微小抑制性突触后电流（mIPSCs）的代表性结果。这些事件在存在河豚毒素（TTX，1 μM）和犬尿烯酸（kynurenic acid，1 mM）的条件下发生，以阻断AMPA和NMDA受体。到48小时受精后（hpf），这些事件表现出相对较快的上升和衰减动力学，并且频率足够高，可在2-3分钟的记录时间内获取大量事件3。图5显示了通过向细胞注入去极化电流所记录到的动作电位。48 hpf胚胎的M细胞通常在刺激下仅产生一个动作电位（图5B），尽管在给予超阈值刺激时，有时也会产生多个动作电位（图5A）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>缩写</td>
			<td>全称</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>mPSC</td>
			<td>微型突触后电流</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>mEPSC</td>
			<td>微型兴奋性突触后电流</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>mIPSC</td>
			<td>微型抑制性突触后电流</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>MΩ</td>
			<td>兆欧（电阻单位；106 欧姆）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>GΩ</td>
			<td>吉欧（电阻单位；109 欧姆）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>MOsm</td>
			<td>毫渗（渗透压单位；10-3 渗透摩尔）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>TTX</td>
			<td>河豚毒素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>ATP</td>
			<td>腺苷三磷酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>GTP</td>
			<td>鸟苷三磷酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>GFP</td>
			<td>绿色荧光蛋白</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>设备名称</td>
			<td>公司</td>
			<td>目录编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>解剖皿</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>0.001" 钨丝</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>解剖显微镜</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>拉管仪</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>微电极成型仪</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td> upright 型膜片钳显微镜</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>显微操作器</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.</td>
			<td>放大器</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9.</td>
			<td>数据采集软件</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.</td>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>溶液名称</td>
			<td>试剂及浓度（mM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>解剖溶液</td>
			<td>134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose 和 0.02% Tricaine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>mPSC 细胞外溶液</td>
			<td>134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose 和 0.001 TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>mPSC 细胞内溶液</td>
			<td>134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na2-ATP, 0.4 Li-GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>动作电位细胞外溶液</td>
			<td>137 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES 和 10 Glucose（含 10 μM D-tubocurarine）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>动作电位细胞内溶液</td>
			<td>130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4Mg-ATP 和 0.4 Li-GTP。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 所有细胞外溶液均调节至290 mOsm和pH 7.8。 所有细胞内溶液均调节至280 mOsm和pH 7.4。
<img alt="斑马鱼显微注射装置，标注各组件；显微图像显示斑马鱼胚胎。" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 解剖皿及完整的后脑-脊髓制备。（A） 从WPI获得的解剖和记录用培养皿。在培养皿底部的玻片上小心密封一个薄垫圈，并在孔内涂布Sylgard。（B） 48小时受精后（hpf）的后脑-脊髓制备。后脑的腹侧面朝上，M细胞位于组织表面下方，对应箭头所示水平位置。
<img alt="显微镜下的M细胞鉴定：明场与荧光成像技术的比较。" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. （A）从孵化后不久的2天龄胚胎中获得的M细胞的诺马尔斯基微分干涉差图像。 该图像是在记录M细胞自发兴奋性突触活动后拍摄的。（B） 实验过程中细胞内灌注了荧光黄。经12许可改编。
<img alt="AMPA/NMDA mEPSC 示意图；在 -60 mV/+40 mV 下的离子通道活性，突触传递分析。" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. (A) 在钳制电位为 -60 mV 时记录到的 M 细胞自发 AMPA 介导的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。(B) 由 (A) 中记录得到的平均 mEPSC。(C) 在钳制电位为 +40 mV 时记录到的 M 细胞自发 AMPA 和 NMDA（箭头所示）介导的 mEPSC。(D) 由 (C) 中记录得到的平均 mEPSC。谷氨酸能 mEPSC 的记录是在河豚毒素（TTX，1 μM）存在条件下进行的，以阻断动作电位；同时加入士的宁（strychnine，5 μM）和毕可托xin（picrotoxin，100 μM）以阻断甘氨酸和 GABA 电流。
<img alt="在 -60 mV 下记录的甘氨酸能 mIPSCs 波形图；神经元活性测量；电生理学结果。" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. (A) 在钳制电位为 -60 mV 时记录到的 M 细胞自发性 mIPSCs。(B) 由 (A) 中记录得到的平均 mEPSCs。mIPSCs 的记录是在存在河豚毒素（TTX，1 μM）以阻断动作电位、犬尿酸（kynurenic acid，1 mM）以阻断谷氨酸受体活性以及荷包牡丹碱（bicuculline，10 μM）以阻断 GABA 电流的条件下进行的。
<img alt="神经元动作电位波形与电流分析示意图；电生理学研究。" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 从M细胞记录到的动作电位。 在该特定细胞中，超阈值刺激（0.48 nA）诱发了多个动作电位 (A)，而达到阈值的刺激仅引发单个动作电位 (B)。(C) 对应于 A 和 B 中迹线的电流刺激方案。

我们开发了一种完整的大脑-脊髓制备方法，可通过膜片钳记录技术从斑马鱼胚胎的Mauthner神经元及其他网状脊髓细胞中记录和监测电活动。因此，我们能够在发育中的胚胎内，对关键神经元的兴奋性和抑制性突触电流、电压门控通道活性以及动作电位进行记录。

斑马鱼胚胎Mauthner细胞的膜片钳记录

Mauthner细胞（M细胞）是位于硬骨鱼类后脑中的大型网状脊髓神经元。它们是介导一种特征性……

本实验的总体目标是记录斑马鱼胚胎口部神经元的突触特性和兴奋性特征。首先通过解剖斑马鱼胚胎，暴露其后脑的腹侧面；第二步是将解剖完成的样本置于膜片钳显微镜载物台上，识别口部神经元细胞。下一个记录位点。使用适当的记录模式夹住M细胞，记录突触活动和兴奋性特性。最后一步是分析所记录的数据，以确定突触特性或兴奋性特性。最终，通过对这些细胞进行膜片钳记录，可以揭示发育中生物体突触受体的特性。通常，初次接触该方法的研究人员会在两个主要环节遇到困难。第一个是解剖过程。双电极电压钳实验的第二次组装可能会具有挑战性。当我决定开展一项斑马鱼制备实验，其中后脑与脊髓相连时，我首次产生了这种方法的想法。本实验步骤将由我实验室的博士研究生Burr Amroy演示。首先，准备一个底部铺有Sylgard的解剖皿。接着，用凡士林将垫圈固定在载玻片上。然后将液态琼脂糖加到垫圈中央。琼脂糖通常在室温下过夜固化，在载玻片上形成一个小的圆形基底，作为解剖皿的底部。将盖玻片置于载玻片上后，将载玻片放入记录室中，作为解剖操作的基底。随后，配制所需的溶液。细胞外溶液应置于室温下，而细胞内溶液应保持无菌状态。也可向细胞内溶液中加入0.1%的黄色loose，以便在实验结束时观察M细胞形态，从而确认细胞身份。接下来，将野生型斑马鱼胚胎置于28.5摄氏度的养卵水中培养，并根据先前发表的文献进行收集和分期。进行解剖时，将胚胎转移至解剖培养皿中，该培养皿同时用作记录室。随后将其麻醉7至10分钟。在一种与生理盐水成分相近的麻醉盐溶液中，可通过轻捏尾部观察反应来判断胚胎是否已充分麻醉。随后，在解剖显微镜下（放大倍数为25倍），用直径0.001英寸的钨丝将胚胎穿过其吻端固定于SIL防护线培养皿中。调整解剖显微镜的放大倍数至40至50倍，以进行解剖操作。现在，使用精细的镊子去除颚眼和前脑。用镊子小心地在索脊与脑组织之间操作，轻轻将后脑从下方的索脊上剥离。然后轻柔地将后脑翻转，使腹面朝上。这种定位方式能够良好地接近M细胞，这些细胞在幼胚中通常位于腹侧表面以下5至10微米处，在较老的幼虫中则位于20至50微米处。接下来，小心地将样品转移至记录装置，以便进行膜片钳实验。可使用微分干涉差显微镜观察M细胞，尽管也可采用其他成像模式来准备膜片钳操作。首先，使用薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制一些用于细胞贴附式记录（patch CLA）的玻璃微电极。水平拉制的微电极尖端经火焰抛光至光滑边缘后，直径约为 0.2 至 0.4 微米，尖端锥形部分长度约为 4 毫米。通过将微电极尖端浸入细胞内液中，使尖端充满细胞内溶液。然后将注射器针头插入移液管，轻轻将注射器内的细胞内液推出。为完成移液管的填充，将移液管连接至放大器头部支架。在电生理实验装置中，重要的是将头部支架保持在与水平轴约45度的角度，以确保移液管的进入角度适合与细胞膜口形成高阻封接。在移液管即将浸入浴液之前，向移液管内施加少量正压，以降低尖端堵塞的可能性。继续以移液管内保持少量正压的方式接近M细胞。正压会轻柔地将细胞从一侧推向另一侧，当移液管恰好位于细胞正上方时，会在细胞膜上形成一个小凹陷。现在将移液管保持原位数秒钟，以轻柔地清洁细胞表面，从而使移液管与细胞膜之间能够形成牢固的封接。随后释放移液管内的正压，以启动封接过程。施加轻微的负压并结合负的电极内液电位，可在数秒内形成吉欧封接。随后，将放大器的钳制电位调整至负60毫伏。通过一系列短暂的吸液脉冲破裂细胞膜。然后立即记录膜电位并尽量减少电容伪迹。将细胞电容和串联电阻补偿70%至85%。串联电阻应每30秒到1分钟监测一次，若变化达到20%或以上，则终止实验。实验结束后，在获取足够数据后，用镊子移除后脑以处死胚胎。该图展示了从48小时受精后（HPF）胚胎中记录到的兴奋性AMPA受体和NMDA受体电流的代表性结果。此处为在–60毫伏钳制电位下从M细胞记录到的自发性AMPA介导的微型兴奋性突触后电流（MEPSCs）。此图为平均MEPSCs的结果。以下是于 40 毫伏钳制电位下记录到的 M 细胞的自发性 AMPA 和 NMDA 型微小兴奋性突触后电流（mePSCs）。此图为在 1 微摩尔河豚毒素（TTX）存在下记录到的平均微小兴奋性突触后电流（mEPSCs），以阻断动作电位；同时加入 5 微摩尔士的宁（strychnine）和 100 微摩尔荷包牡丹碱（bicuculline），以分别阻断甘氨酸受体和 GABA 受体介导的电流。以下是于 -60 毫伏钳制电位下记录到的 M 细胞的自发性微小抑制性突触后电流（mIPSCs）。在存在1 µM TTX以阻断动作电位、1 mM 氯喹酸以阻断谷氨酸受体活性以及10 µM 薄荷醇以阻断GABA受体活性的条件下，记录了平均的MI PSCs。这些是从一个M细胞中记录到的动作电位，针对该特定细胞。0.48 纳安的 SRA 阈值刺激引发了多个动作电位，但达到阈值的刺激仅产生一个动作电位。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在斑马鱼胚胎中对 M 细胞及其他网状脊髓神经元进行膜片钳记录。

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