斑马鱼胚胎Mauthner细胞的膜片钳记录

本实验的总体目标是记录斑马鱼胚胎口部内侧细胞的突触特性与兴奋性特征。该目标通过以下步骤实现：首先解剖斑马鱼胚胎，暴露其后脑的腹侧表面；第二步是将解剖完成的样本置于膜片钳显微镜载物台上，并识别口部内侧细胞。

下一个记录位点。使用适当的记录模式固定住M细胞，记录突触活动和兴奋性特性。最后一步是分析所记录的数据，以确定突触特性或兴奋性特性。

最终，通过对这些细胞进行膜片钳记录，以揭示发育中生物体突触受体的特性。通常，初次接触该方法的研究人员会在两个主要环节遇到困难。第一个环节是解剖过程。

双电极电压钳实验中的第二次形成吉格场景可能会具有挑战性。当我决定开展一项斑马鱼制备实验，其中后脑与脊髓相连时，我首次产生了此方法的想法。本实验步骤将由我实验室的博士研究生Burrum Roy演示。首先准备一个底部铺有Sylgard的解剖皿。接着，用凡士林将垫圈固定在载玻片上。

然后将液体琼脂糖加到洗涤器的中央。琼脂糖通常在室温下固化过夜，在载玻片上形成一个小的圆形胶床，作为解剖皿的基底。将盖玻片置于载玻片上后，将载玻片放入记录室中，作为解剖操作的基底。

随后，配制所需的溶液。细胞外溶液应置于室温下，而细胞内溶液应保持无菌状态。也可向细胞内溶液中加入0.1%的黄色loose，以便在实验结束时观察M细胞形态，从而确认细胞身份。

接下来，将野生型斑马鱼胚胎置于28.5摄氏度的卵水中培养，参照先前发表的方法进行收集和分期。进行解剖时，将胚胎转移至解剖皿中，该解剖皿同时也作为记录室。随后将其麻醉7到10分钟。

在一种与生理盐水成分相近的麻醉盐溶液中，可通过观察胚胎对轻柔尾部夹捏的反应来判断其是否已充分麻醉。随后，在解剖显微镜下（放大倍数为25倍），使用直径为0.001英寸的钨丝将胚胎穿过其非吻合部位固定于SIL防护线培养皿中。调整解剖显微镜的放大倍数至40至50倍，以进行解剖操作。

现在，使用精细的镊子去除颚眼和前脑。用镊子小心地在索脊与脑组织之间操作，轻轻将后脑从下方的索脊上剥离。然后轻柔地将后脑翻转，使腹面朝上。

这种定位方式能够良好地接近M细胞，这些细胞在幼胚中通常位于腹侧表面以下5至10微米处，在较老的幼虫中则位于20至50微米处。接下来，小心地将样品转移至记录装置，以便进行膜片钳实验。M细胞可通过微分干涉差显微镜观察，尽管也可使用其他成像模式来准备膜片钳实验。

首先，使用薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制一些用于细胞贴附式记录（patch CLA）的玻璃微电极。水平拉制的微电极经火焰抛光至边缘光滑后，尖端直径约为 0.2 至 0.4 微米，柄部锥形部分长度约为 4 毫米。通过将微电极尖端浸入细胞内液中，使尖端充满细胞内溶液。

然后将注射器针头插入移液管，轻轻从注射器中推出细胞内溶液。为完成移液管的填充，将其连接至电生理记录装置中的放大器头部支架。在电生理实验装置中，需将头部支架保持在与水平轴约45度的角度，以确保移液管进入细胞时的角度适合在细胞开口处形成高阻封接。在移液管即将浸入浴液之前，对移液管施加少量正压，以降低尖端堵塞的可能性。持续以少量正压向M细胞靠近。

正压会轻柔地将细胞从一侧推向另一侧，当移液管恰好位于细胞上方时，会在细胞膜上形成一个小凹陷。现在将移液管保持原位数秒钟，以轻柔地清洁细胞表面，从而在移液管与细胞膜之间形成牢固的封接。随后释放移液管内的正压，以启动封接过程。

施加少量负压并结合负的电极内液电势，可在数秒内形成吉欧封接。随后，将放大器的钳制电位调整至负60毫伏。通过一系列短暂的吸液脉冲破裂细胞膜。

然后立即记录膜电位并尽量减少电容伪迹。将细胞电容和接入电阻补偿70%至85%。应每30秒到1分钟监测一次接入电阻，若变化达到20%或以上，则终止实验。实验结束后，在已获取足够数据的情况下，用镊子移除后脑以处死胚胎。

该图展示了从 48 小时受精后（HPF）胚胎中记录到的兴奋性 AMPA 和 NMDA 受体电流的代表性数据。此处为在 -60 毫伏保持电位下从 M 细胞记录到的自发 AMPA ME PSCs。此图为平均 ME PSCs。

以下是于40毫伏钳制电位下从M细胞记录到的自发AMPA和NMDA介导的微小兴奋性突触后电流（mePSCs）。此图为谷氨酸能mePSCs的平均值，记录时添加1微摩尔河豚毒素（TTX）以阻断动作电位，同时加入5微摩尔士的宁（strychnine）和100微摩尔荷包牡丹碱（ritoxin）以分别阻断甘氨酸受体和GABAA受体活性。下图为于-60毫伏钳制电位下从M细胞记录到的自发抑制性微小突触后电流（mIPSCs）。

在存在1 µM TTX以阻断动作电位、1 mM 氯喹酸以阻断谷氨酸受体活性以及10 µM 裘青（by Qing）以阻断GABA受体活性的条件下，记录了平均MI PSCs MI PSCs。这些是从一个M细胞中记录到的动作电位，针对该特定细胞。

0.48 纳安的 SRA 阈值刺激引发了多个动作电位，但达到阈值的刺激仅产生一个动作电位。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在斑马鱼胚胎中对 M 细胞及其他网状脊髓神经元进行膜片钳记录。