斑马鱼胚胎Mauthner细胞的膜片钳记录
2013年9月10日
我们开发了一种完整的大脑-脊髓制备方法，可通过膜片钳记录技术从斑马鱼胚胎的Mauthner神经元及其他网状脊髓细胞中记录和监测电活动。因此，我们能够在发育中的胚胎内，对关键神经元的兴奋性和抑制性突触电流、电压门控通道活性以及动作电位进行记录。
本实验的总体目标是记录斑马鱼胚胎口部内侧细胞的突触特性与兴奋性特征。该目标通过以下步骤实现：首先解剖斑马鱼胚胎，暴露其后脑的腹侧表面；第二步是将解剖完成的样本置于膜片钳显微镜载物台上，并识别口部内侧细胞。
下一个记录位点。使用适当的记录模式固定住M细胞，记录突触活动和兴奋性特性。最后一步是分析所记录的数据，以确定突触特性或兴奋性特性。
最终，通过对这些细胞进行膜片钳记录，以揭示发育中生物体突触受体的特性。通常，初次接触该方法的研究人员会在两个主要环节遇到困难。第一个环节是解剖过程。
双电极电压钳实验中的第二次形成吉格场景可能会具有挑战性。当我决定开展一项斑马鱼制备实验，其中后脑与脊髓相连时，我首次产生了此方法的想法。本实验步骤将由我实验室的博士研究生Burrum Roy演示。首先准备一个底部铺有Sylgard的解剖皿。接着，用凡士林将垫圈固定在载玻片上。
然后将液体琼脂糖加到洗涤器的中央。琼脂糖通常在室温下固化过夜，在载玻片上形成一个小的圆形胶床，作为解剖皿的基底。将盖玻片置于载玻片上后，将载玻片放入记录室中，作为解剖操作的基底。
随后，配制所需的溶液。细胞外溶液应置于室温下，而细胞内溶液应保持无菌状态。也可向细胞内溶液中加入0.1%的黄色loose，以便在实验结束时观察M细胞形态，从而确认细胞身份。
接下来，将野生型斑马鱼胚胎置于28.5摄氏度的卵水中培养，参照先前发表的方法进行收集和分期。进行解剖时，将胚胎转移至解剖皿中，该解剖皿同时也作为记录室。随后将其麻醉7到10分钟。
在一种与生理盐水成分相近的麻醉盐溶液中，可通过观察胚胎对轻柔尾部夹捏的反应来判断其是否已充分麻醉。随后，在解剖显微镜下（放大倍数为25倍），使用直径为0.001英寸的钨丝将胚胎穿过其非吻合部位固定于SIL防护线培养皿中。调整解剖显微镜的放大倍数至40至50倍，以进行解剖操作。
现在，使用精细的镊子去除颚眼和前脑。用镊子小心地在索脊与脑组织之间操作，轻轻将后脑从下方的索脊上剥离。然后轻柔地将后脑翻转，使腹面朝上。
这种定位方式能够良好地接近M细胞，这些细胞在幼胚中通常位于腹侧表面以下5至10微米处，在较老的幼虫中则位于20至50微米处。接下来，小心地将样品转移至记录装置，以便进行膜片钳实验。M细胞可通过微分干涉差显微镜观察，尽管也可使用其他成像模式来准备膜片钳实验。
首先，使用薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制一些用于细胞贴附式记录（patch CLA）的玻璃微电极。水平拉制的微电极经火焰抛光至边缘光滑后，尖端直径约为 0.2 至 0.4 微米，柄部锥形部分长度约为 4 毫米。通过将微电极尖端浸入细胞内液中，使尖端充满细胞内溶液。
然后将注射器针头插入移液管，轻轻从注射器中推出细胞内溶液。为完成移液管的填充，将其连接至电生理记录装置中的放大器头部支架。在电生理实验装置中，需将头部支架保持在与水平轴约45度的角度，以确保移液管进入细胞时的角度适合在细胞开口处形成高阻封接。在移液管即将浸入浴液之前，对移液管施加少量正压，以降低尖端堵塞的可能性。持续以少量正压向M细胞靠近。
正压会轻柔地将细胞从一侧推向另一侧，当移液管恰好位于细胞上方时，会在细胞膜上形成一个小凹陷。现在将移液管保持原位数秒钟，以轻柔地清洁细胞表面，从而在移液管与细胞膜之间形成牢固的封接。随后释放移液管内的正压，以启动封接过程。
施加少量负压并结合负的电极内液电势，可在数秒内形成吉欧封接。随后，将放大器的钳制电位调整至负60毫伏。通过一系列短暂的吸液脉冲破裂细胞膜。
然后立即记录膜电位并尽量减少电容伪迹。将细胞电容和接入电阻补偿70%至85%。应每30秒到1分钟监测一次接入电阻，若变化达到20%或以上，则终止实验。实验结束后，在已获取足够数据的情况下，用镊子移除后脑以处死胚胎。
该图展示了从 48 小时受精后（HPF）胚胎中记录到的兴奋性 AMPA 和 NMDA 受体电流的代表性数据。此处为在 -60 毫伏保持电位下从 M 细胞记录到的自发 AMPA ME PSCs。此图为平均 ME PSCs。
以下是于40毫伏钳制电位下从M细胞记录到的自发AMPA和NMDA介导的微小兴奋性突触后电流（mePSCs）。此图为谷氨酸能mePSCs的平均值，记录时添加1微摩尔河豚毒素（TTX）以阻断动作电位，同时加入5微摩尔士的宁（strychnine）和100微摩尔荷包牡丹碱（ritoxin）以分别阻断甘氨酸受体和GABAA受体活性。下图为于-60毫伏钳制电位下从M细胞记录到的自发抑制性微小突触后电流（mIPSCs）。
在存在1 µM TTX以阻断动作电位、1 mM 氯喹酸以阻断谷氨酸受体活性以及10 µM 裘青（by Qing）以阻断GABA受体活性的条件下，记录了平均MI PSCs MI PSCs。这些是从一个M细胞中记录到的动作电位，针对该特定细胞。
0.48 纳安的 SRA 阈值刺激引发了多个动作电位，但达到阈值的刺激仅产生一个动作电位。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在斑马鱼胚胎中对 M 细胞及其他网状脊髓神经元进行膜片钳记录。
概述
本研究介绍了一种利用完整脑-脊髓制备标本记录斑马鱼胚胎中Mauthner神经元和网状脊髓细胞电活动的方法。该技术可用于分析发育中神经元的突触电流、电压门控通道活性以及动作电位。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 发育生物学
背景
- 斑马鱼胚胎是研究神经元发育的宝贵模型。
- 梅克尔神经元在逃避反应中起关键作用。
- 膜片钳技术对于研究突触特性至关重要。
- 理解突触活动对于揭示神经回路机制具有重要意义。
研究目的
- 建立一种在斑马鱼胚胎中记录神经元活动的可靠方法。
- 研究关键神经元中的兴奋性和抑制性突触电流。
- 分析胚胎发育过程中突触受体的特性。
使用的方法
- 解剖斑马鱼胚胎以暴露后脑。
- 使用膜片钳显微技术记录Mauthner神经元的电活动。
- 应用特定溶液模拟细胞内和细胞外环境。
- 数据分析以确定突触特性和兴奋性特征。
主要结果
- 成功记录兴奋性和抑制性突触电流。
- 对发育中神经元的电压门控通道活性进行表征。
- 鉴定胚胎期斑马鱼中突触受体的特性。
- 展示该方法在未来电生理学研究中的有效性。
结论
- 该方法对研究斑马鱼胚胎中的神经元活动具有良好的效果。
- 所获得的见解有助于加深对神经发育过程的理解。
- 该方法可能促进对突触机制的进一步研究。
常见问题
行业重要性概述
对胚胎期斑马鱼Mauthner细胞进行膜片钳记录，可直接测量发育中脊椎动物神经系统的突触受体功能。该方法通过在神经发育关键期提供兴奋性和抑制性神经传递的定量数据，支持靶点验证。完整保留脑-脊髓的制备方式维持了原有的神经环路，从而增强了突触可塑性及受体药理学机制研究的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量发育中Mauthner细胞内由AMPA和NMDA介导的兴奋性电流以及由GABA/甘氨酸介导的抑制性电流，验证治疗假说。
- 操作价值：在天然细胞环境中对突触受体的表达与功能活性进行功能验证，从而实现生物学风险的降低。
- 科学价值：通过在不同制备样本中追踪单细胞水平的突触发育过程，提高预测可信度，减少机制解释中的变异性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过建立胚胎神经元中突触电流幅度和动力学的基线，为后续实验流程准备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过保持功能型突触连接的一致解剖、记录和分析方案，解决检测标准化和可重复性问题。
- 科学价值：通过在不同制备样本中重复使用同一种细胞类型（Mauthner细胞），支持长期突触发育研究，凸显平台的筛选就绪性和可重复利用性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将突触电流测量与神经系统疾病模型相关的神经发育过程相联系，探讨疾病的关联性及转化生物标志物的一致性。
- 操作价值：利用胚胎斑马鱼作为与疾病相关的系统，开展早期靶点参与研究，描述从发现到临床前验证的连续性。
- 科学价值：聚焦于预测性降风险价值，通过表征电压门控通道活性和突触受体特性，为基于作用机制的化合物筛选提供依据。
流程与工作流整合
该方法通过提供电生理读出信号，揭示在发育中的神经元系统中靶点结合情况及作用机制，从而整合到从早期发现到先导化合物识别的整个发现流程中。
- 发现生物学：通过在完整的后脑-脊髓制备中记录 Mauthner 细胞的突触和兴奋性特性，说明该方法如何支持假设检验、通路阐明或生物学风险降低。
- 筛选：当文章通过在药理学隔离条件下测量自发性和诱发性兴奋性及抑制性突触后电流提供支持时，描述该检测的可准备性、可重复性或定量输出。
- 分析：突出有助于团队比较不同条件的测量指标、读出结果或统计输出，包括对膜电位、电容、接入电阻以及突触电流幅度和动力学的分析。
- 转化研究：仅当原文支持时，将该方法与临床前连续性或生物标志物一致性相关联，即通过在具有人类神经发育相关性的脊椎动物模型中研究突触发育来实现。
- 企业级复用：强调可在多次制备后重复使用同一种细胞类型（Mauthner 细胞）制备进行持续的纵向分析，从而将该方法定位为一种可复用的能力，而非一次性技术。
运营与企业影响
- 科学价值：预测置信度、靶点验证，以及在发育过程中减少突触受体功能的机制模糊性。
- 操作价值：通过标准化的分离、记录和分析步骤实现标准化、可重复性和可扩展性，同时保持突触连接的完整性。
- 战略价值：通过早期评估化合物对发育中神经元兴奋性和突触传递的影响，实现更优的立项/终止决策、资本利用效率提升，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：利用定量的突触电流数据，对涉及神经发育通路的靶点进行去风险化，从而实现经风险调整后的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备神经解剖、膜片钳电生理以及突触电流药理学分离方面的专业知识。
- 所需的仪器与分析基础设施包括膜片钳显微镜、放大器、灌流系统和微分干涉相差光学系统。
- 为确保不同实验间数据的可比性，需在团队间对胚胎分期、解剖技术及封接形成标准进行统一规范。
- 由于胚胎斑马鱼与其他脊椎动物在神经元大小、可及性及突触组成上的差异，需根据不同的模式系统对实验方法进行相应调整。
- 根据原始资料支持的实际限制，该方法在解剖操作和吉欧封接（gigaseal）形成方面存在技术难度，对初次使用者尤为具有挑战性。
