使用多光谱成像流式细胞术对碳纳米管在细胞中的定位和相对定量

以下实验的总体目标是提供一种纳米计量学方法，用于监测和量化碳纳米管在统计相关数量的细胞中的细胞摄取。这是通过首先用水分散的碳纳米管处理细胞来实现的，这些碳纳米管以浓度依赖性方式进入细胞。这些碳纳米管最终用荧光标记物标记。

然后在固定后，每个细胞在多光谱成像流的明场、暗场和荧光通道中成像。细胞仪。为了可视化碳纳米管的分布以及光吸收、散射光和荧光的水平，纳米管标记在每个细胞中逐像素诱导。最终，细胞内固有的光吸收和散射允许碳纳米管的定位和定量。

因此，这种方法可以帮助回答纳米毒理学和纳米医学领域的新问题，例如碳基材料在活细胞中的影响和命运，以及碳纳米管作为药物递送系统的电位。首先将碳纳米管最终偶联到细胞培养水中偶联到荧光标记上。然后在 20 摄氏度的浴水中超声处理 20 分钟。接下来，在完全培养基中以 0、10、20 和 50 μg/mL 浓度稀释纳米管，然后在 20 小时后，将每种稀释液的 2 毫升与感兴趣的细胞在 1 25 平方厘米的平板中在 37 摄氏度的平板中孵育，从每个平板中取出孵育培养基，并用 PBS 冲洗碳纳米管标记的细胞。

洗涤后，胰蛋白酶观察每个板上的细胞，然后将它们重悬于完整的 DMEM 培养基中。接下来，将每个样品转移到单独的 einor 15 ml falcon 管中，然后在 200 倍 G 和室温下将细胞离心 5 分钟。将每个沉淀在 4 摄氏度的 4% 对位甲醛中重悬 1 小时。

固定后，再次离心细胞，并在 150 微升 PBS 中以 15 乘以 10 倍重悬每个沉淀样品至第五个细胞。然后通过单独的 50 微米网状过滤器过滤样品，以使用图像流获取细胞图像。多光谱成像流式细胞仪。

首先，选择合适的放大倍率，然后对感兴趣的样品进行成像。使用 685 纳米激光对暗场成像并设置流式细胞仪。6 号通道，用于收集 745 至 800 纳米带通的暗场发射。

在第 1 个明场和第 6 个暗场通道中对样品进行成像，以进行图像分析。首先，创建一个按参数点图，其宽 x 高纵横比与单元格面积的关系。这允许区分具有标准面积和纵横比接近 1 的单细胞与具有大面积和小纵横比的多细胞事件，以及表现出极小面积的碎片。

在使用细胞图像验证单个细胞已被正确选择后，通过绘制对比度与均方根梯度的对比，为高对比度的碳纳米管标记的细胞设置一个双参数点图，以允许排除低根、均方梯度、低对比度未聚焦的细胞，以及在聚焦平面中选择细胞。接下来，使用 find best feature 工具确定在标记和未标记单元格之间提供最佳统计分离的参数。例如，对于此代表性实验，平均像素对象特征是最合适的。

然后将该参数与归一化频率作图，以追踪直方图，以量化细胞在每个实验浓度下吸收的纳米管。现在，为明场上的平均像素对象与暗场上的强度绘制一个 bi 参数图。为了检查这两个参数之间的相关性，还通过在细胞图像上创建碳纳米管显示为强烈的黑点来评估纳米管定量在明场通道中，选择低强度的有限像素范围，例如，在 0 到 533 之间以创建阈值掩码， 一个精确拟合暗纳米管以创建第二个掩模，表示为掩模 2，用于可视化在暗场通道中显得明亮的纳米管。

选择具有高强度的像素范围。例如，本实验选择了 150 到 4， 095 的范围。然后使用明场掩模 1 或暗场掩模 2 的面积，建立一个点图来量化纳米管的相对内化。

例如，将通道 6 上对应于蒙版 2 的暗场的区域与通道 1 上的区域（对应于蒙版 1 的明场）作图。在确定掩模 1 和掩模 2 之间的线性相关性后，首先创建整个细胞的掩模，然后侵蚀掩模，从而可视化细胞质内的纳米管。现在表示为 erode M 0 1 7 x 7 像素以查看单元内部。

要可视化细胞膜内的碳纳米管，请使用布尔方程 M 零一，而不是侵蚀 M 0 1 7。即整个细胞的掩码，从细胞内部减去以创建膜的掩码，仅用于评估膜上的暗像素。将明场蒙版应用于膜蒙版。

将所有这些掩模应用于多个细胞，以确认标记和未标记样品之间的区别。然后使用特征面积工具选择膜上的黑色像素，以量化细胞膜上的碳纳米管。最后，区分已经内化的碳纳米管和已经吸收到膜上的碳纳米管。

图，膜的黑色区域与整个细胞的黑色区域相对。为一个实验条件创建所有图后，创建一个统计报告模板。将模板另存为 A ST 文件并批处理所有数据文件。

图像流设备可在流式细胞仪中生成每个细胞的多个高分辨率图像，包括明场、暗场和荧光通道，如此处使用三种不同的纳米管标记细胞进行演示。还会显示这些通道的叠加。与未标记的细胞相比，碳纳米管的存在会诱导标记细胞的对比度和梯度发生变化。

因此，创建 bi 参数点图对于选择焦点单元格非常重要。无论是否存在纳米管标记，都可以通过其低对比度和低均方根梯度来区分黄色未聚焦的细胞。未标记的病灶细胞也表现出低对比度，但当用纳米管标记病灶细胞时，表现出高根均方梯度，但是，细胞表现出高对比度、低根、均方梯度曲线。

内部化的碳纳米管很容易区分，特别是在明场通道中，它们表现为强烈的黑点，其区域随着纳米管的浓度而增加。当分析明场图像的平均像素信号时，可以确定纳米管摄取的相对定量。例如，这些直方图表明，纳米管标记浓度的每次增加都会发生纳米管摄取的显着增加，因为表明碳纳米管定量也可以通过在明场图像中的有限暗像素范围或暗场内的高强度像素内使用掩模来实现， 对应于纳米管所在的区域。

然后绘制这些掩模的面积可以进一步量化碳纳米管的摄取。此外，可以通过绘制暗场强度与明场平均像素信号的关系，或通过绘制明场内掩模区域与暗场内区域来评估明场和暗场图像中斑点之间的相关性。在接下来的两张图中，显示了对位于电池内部的碳纳米管的分析。

这些第一张图像演示了创建的不同掩码。请注意，必须在已标记和未标记单元格的集合上目视检查基于默认单元格掩码侵蚀的本地化掩码的稳健性。正如刚才在这些点图中所示，已经绘制了细胞膜上黑点的总面积与整个细胞的黑点面积，以确定内化分数。

对于在 37 摄氏度下孵育 20 小时的细胞，与在 4 摄氏度下在 4 摄氏度下孵育 2 小时的细胞相比，碳纳米管主要位于膜上，而在 37 摄氏度时，碳纳米管被内化在 90% 以上的细胞中。碳纳米管荧光不是碳纳米管内化的良好指标，因为荧光点与亮场和暗场通道内的点之间的相关性太低。事实上，fitzy 强度和明场平均像素之间的相关性表明 Pearson 相关系数为负 0.2。

如这些图像所示，荧光信号与明场黑点、碳纳米管、限制和细胞内溶酶体内的聚集不可靠匹配，部分淬灭了荧光信号。相比之下，分散的纳米管在显影后可能会产生更可靠的荧光信号。这项技术为纳米技术和纳米医学领域的研究人员使用统计高通量细胞术方法探索活细胞与碳基纳米材料或任何具有高吸收和生命散射能力的纳米材料的相互作用铺平了道路。