利用多光谱成像流式细胞术对细胞内碳纳米管的定位与相对定量分析

以下实验的总体目标是提供一种纳米计量学方法，用于在具有统计学意义的细胞数量中监测并量化碳纳米管的细胞摄取。该方法首先用可水分散的碳纳米管处理细胞，碳纳米管以浓度依赖的方式进入细胞，随后这些碳纳米管被荧光标记物标记。

固定后，利用多光谱成像流式细胞仪对每种细胞分别进行明场、暗场和荧光通道的成像。通过逐像素分析纳米管标记在每个细胞中诱导的碳纳米管分布、光吸收程度、散射光及荧光信号，最终借助细胞内固有的光吸收和散射特性实现对碳纳米管的定位与定量。

因此，该方法有助于回答纳米毒理学和纳米医学领域的新问题，例如碳基材料在活细胞中的影响与归宿，以及碳纳米管作为药物递送系统的潜在应用。首先，将最终连接荧光标记的碳纳米管分散于细胞培养用水中。随后，在20摄氏度条件下，将碳纳米管置于水浴超声仪中处理20分钟。接着，用完全培养基将碳纳米管稀释为0、10、20和50微克/毫升的浓度梯度，每种稀释液取2毫升，分别加入含有目标细胞的25平方厘米培养皿中，在37摄氏度下孵育。20小时后，从各培养皿中移除孵育培养基，并用PBS清洗标记有碳纳米管的细胞。

洗涤后，用胰蛋白酶观察每个培养板上的细胞，然后将其重悬于完全DMEM培养基中。接着，将每个样品转移至单独的15毫升Falcon离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。将每个沉淀物在4°C的4%多聚甲醛中重悬，固定1小时。

固定后，再次离心细胞，将每个沉淀样品重悬于 150 微升 PBS 中，细胞密度为 15 乘以 10 的 5 次方个细胞。然后将样品分别通过 50 微米的滤网过滤，以使用成像流式细胞仪获取细胞图像。

首先，选择合适的放大倍数，然后对目标样本进行成像。使用685纳米激光器进行暗场成像，并设置流式细胞仪，将第六通道设为通过745至800纳米的带通滤光片收集暗场发射信号。

对样本在明场通道一和暗场通道六中进行成像，以用于图像分析。首先，创建一个参数化散点图，以宽高比（宽度与高度之比）为横坐标，细胞面积为纵坐标。该图能够区分单细胞（具有接近标准的面积且宽高比接近1）、多细胞事件（具有较大面积但较小宽高比）以及碎片（表现出极小面积）。

在利用细胞图像确认单个细胞已被正确选取后，通过绘制对比度与均方根梯度的关系图，建立一个双参数点图，以清晰区分标记了碳纳米管的细胞，从而排除均方根梯度低、对比度低且失焦的细胞，并选择处于聚焦平面上的细胞。接下来，使用“寻找最佳特征”工具确定能够为标记细胞与未标记细胞提供最佳统计学分离效果的参数。例如，在本项代表性实验中，平均像素对象特征是最合适的参数。

然后将该参数对归一化频率作图，以绘制直方图，用于量化各实验浓度下细胞摄取的纳米管。接下来，绘制明场中平均像素对象与暗场中强度的双参数图。为检验这两个参数之间的相关性，还需通过细胞图像进行纳米管定量分析，因为碳纳米管在明场通道中呈现为明显的暗斑。在明场通道中选择强度较低的像素的有限范围（例如，0 至 533 之间），以创建阈值掩膜，该掩膜精确匹配暗色纳米管，从而生成第二个掩膜（记为掩膜二），用于可视化在暗场通道中呈现亮色的纳米管。

选择高强度的像素范围。例如，本实验选择了150至4,095的范围。然后，利用明场掩模一或暗场掩模二中的区域，建立点图以量化纳米管的相对内化程度。

例如，将通道六中对应于使用掩膜二的暗场区域与通道一中对应于使用掩膜一的明场区域进行作图。在确定掩膜一与掩膜二之间的线性相关性后，通过首先创建整个细胞的掩膜并对其进行腐蚀，从而可视化细胞质内的纳米管。现将记为 erode M 0 1 7 的掩膜腐蚀 7 像素，以观察细胞内部。

为了在细胞膜内可视化碳纳米管，使用布尔方程 M zero one 且非侵蚀 M 0 1 7。该掩膜表示整个细胞，从中减去细胞内部区域，从而生成仅包含细胞膜的掩膜，用于评估膜上的暗像素。将明场掩膜一应用于该膜掩膜。

将这些掩膜同时应用于多个细胞，以确认标记样本与未标记样本之间的区别。然后使用特征区域工具选择膜上的黑色像素，以量化细胞膜上的碳纳米管。最后，区分已内化的碳纳米管与吸附在膜上的碳纳米管。

绘制膜的黑色区域面积与整个细胞的黑色区域面积的比值图。完成一个实验条件下所有图表的绘制后，创建一份统计报告模板。将该模板保存为 A ST 文件，并对所有数据文件进行批量处理。

该图像流式细胞仪设备可对流式细胞仪中的每个细胞生成多幅高分辨率图像，包括明场、暗场和荧光通道图像，此处以三种不同纳米管标记的细胞为例进行展示。图中还显示了这些通道的叠加图像。与未标记细胞相比，碳纳米管的存在会引起标记细胞在对比度和梯度上的变化。

因此，创建双参数点图对于选择聚焦细胞至关重要。无论是否存在纳米管标记，黄色的非聚焦细胞均可通过其低对比度和低均方根梯度加以区分。未标记的聚焦细胞也表现出低对比度，但当聚焦细胞被纳米管标记时，则呈现出高均方根梯度；然而，当细胞表现出高对比度、低均方根梯度特征时，则为已标记的聚焦细胞。

内化的碳纳米管很容易被识别，尤其是在明场通道中，它们呈现为明显的黑色斑点，且这些黑色区域的面积随纳米管浓度的增加而增大。通过分析明场图像的平均像素信号，可对纳米管的摄取量进行相对定量。例如，这些直方图展示了随着纳米管标记浓度的逐步增加，细胞对纳米管的摄取量显著上升。此外，还可通过在明场图像中特定范围的暗像素区域，或暗场图像中对应纳米管所在位置的高亮度像素区域应用掩膜，实现碳纳米管的定量分析。

绘制这些掩膜的面积，可进一步量化碳纳米管的摄取情况。此外，还可通过绘制暗场强度与明场平均像素信号的关系，或绘制明场内掩膜面积与暗场内掩膜面积的关系，来评估明场与暗场图像中斑点之间的相关性。在接下来的两个图中，展示了定位于细胞内部的碳纳米管的分析结果。

这些初始图像展示了所创建的不同掩膜。需要注意的是，基于默认细胞掩膜腐蚀生成的定位掩膜的稳健性，必须通过目视检查标记与未标记细胞的集合来进行验证。正如这些点图所示，已绘制细胞膜上黑斑的总面积与整个细胞面积的比值，以确定内化评分。

与在4摄氏度下孵育2小时的细胞相比，在37摄氏度下孵育20小时的细胞中，碳纳米管主要位于细胞膜上；而在37摄氏度条件下，超过90%的细胞内已将碳纳米管内化。由于荧光信号点与明场和暗场通道中的信号点之间相关性过低，碳纳米管的荧光信号并不能准确反映其内化情况。事实上，荧光强度与明场平均像素值之间的皮尔逊相关系数为-0.2。

如这些图像所示，荧光信号与明场下的黑色斑点、碳纳米管、限域效应以及细胞内溶酶体中的聚集现象并不能可靠对应，部分原因是溶酶体内的聚集导致荧光信号被部分猝灭。相比之下，分散的纳米管在发育后可能产生更可靠的荧光信号。该技术为纳米技术与纳米医学领域的研究人员探索活细胞与碳基纳米材料，或任何具有高吸收性和强光散射能力的纳米材料之间的相互作用，提供了一条新途径，可借助统计性的高通量流式细胞术方法实现。