活体癌细胞中通过共聚焦成像观察到的异常有丝分裂相关的细胞死亡

以下实验的总体目标是观察 philanthotoxin 衍生物 PJ 34 在多中心体人癌细胞有丝分裂过程中的细胞毒性作用。通过使用 GFP 标记 γ-微管蛋白以标记中心体，并通过转染 H2B-red 标记染色体，实现对该过程的观察。转染的目的是在活体多中心体癌细胞的有丝分裂过程中，实现对中心体迁移与聚集以及染色体排列行为的示踪。

第二步，将部分转染的细胞暴露于PJ 34中，该分子可作为额外中心体的清除剂。随后，利用共聚焦显微镜扫描转染后的活癌细胞，以捕捉有丝分裂过程中与中心体和染色体迁移相关的事件。通过共聚焦成像获得的连续图像显示，在有丝分裂期间，PJ 34处理对癌细胞具有中心体清除和细胞毒性作用。

该技术的应用前景在于靶向性癌症治疗，可在有丝分裂期间特异性清除常染色体癌细胞。本技术的示范操作由来自舍巴医疗中心癌症研究中心的合作者 Asher Castillo 博士，以及来自特拉维夫大学萨科医学学院影像部门的 Leonid Middleman 博士共同完成。为进行活细胞共聚焦成像，将 2 × 10⁵ 个 MDA-MB-231 乳腺癌细胞接种于 35 毫米直径、多聚赖氨酸包被的玻璃底培养皿中，加入 2 毫升完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育。

当细胞融合度达到60%至70%时，即可进行转染。细胞将被转染两种质粒，一种编码γ-微管蛋白和GFP，用于中心体的荧光检测，另一种编码组蛋白红色荧光蛋白，用于染色体的荧光检测。转染操作采用脂质体转染试剂jet PI，并遵循制造商提供的操作步骤。用PBS洗涤细胞一次，然后将细胞培养基更换为两毫升不含添加剂的温热DMEM培养基。轻轻将转染混合物加入含有DMEM的细胞中，随后将细胞放回培养箱中孵育8小时。8小时后继续后续操作。

加入2 mL完全培养基替换DMEM，将细胞在培养箱中孵育24小时。转染24小时后，弃去原培养基，更换为含20 µM PGA 34的2 mL完全培养基。

在进行活细胞共聚焦成像前，将细胞继续培养18小时。以下是活细胞共聚焦成像扫描仪的参数设置：扫描模式为XYZT，针孔为airy 1.00，放大倍数为3.5，分辨率为8位，激光源包括DPSS 561纳米、可见光氩离子激光488纳米和可见光氦氖激光633纳米。

实验目的 H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63次 1.40油镜紫外数值孔径1.4。扫描速度700赫兹，折射率1.52。将细胞置于成像腔室中，在5%二氧化碳和37摄氏度条件下进行至少16小时的活细胞共聚焦成像。

通过荧光显微镜检测转染效率。首先，在六孔板中每孔加入两毫升完全培养基，并在每个孔中放置一个盖玻片，接种 2 × 10⁵ 个 MDA-MB-231 细胞。使用脂质体转染试剂 jetPEI，按照制造商的说明书，以与之前相同的方法对细胞进行转染。

转染后36小时。用PBS洗涤贴有转染细胞的盖玻片后，吸去每孔中的培养基。将细胞置于冰冻的甲醇与丙酮溶液（体积比1:1）中，在负20摄氏度下孵育7分钟以固定细胞。

七分钟后，吸除固定液，将带有贴壁细胞的盖玻片置于化学通风橱中干燥30分钟。接着，加入含DPI的长效金抗淬灭试剂，避光干燥六小时。在荧光显微镜下观察切片，并计算转染细胞中具有红色和绿色信号的细胞百分比。

在总细胞群体中，当计数100至200个细胞时，理想的转染率约为20%至40%。开始该实验步骤时，将2 × 10⁵个M-D-A-M-B-231乳腺癌细胞接种于六孔板中的玻璃盖玻片上，每孔加入2毫升完全培养基。向培养基中加入PJ 34，并将细胞孵育所需的时间。

孵育结束后，用 PBS 清洗盖玻片一次，并将细胞在冰甲醇与丙酮按 1:1 比例配制的溶液中于 -20 °C 固定 7 分钟。随后，吸除固定液，将盖玻片置于化学通风橱中干燥 30 分钟。用 PBST 清洗盖玻片一次，以通透细胞膜，然后在室温下用含 10% 正常驴血清的 PBST 封闭细胞 1 小时。

通过将抗α-微管蛋白（antifa tubulin）和抗γ-微管蛋白（anti gamma tubulin）一抗加入封闭液中并涡旋混匀，制备第一种抗体混合液。然后在六孔板盖上每个盖玻片处加入100 µL抗体混合液。将盖玻片翻转，轻轻放置于抗体液滴上，室温孵育2小时。

加入室温下的溶液。这将对纺锤体和中心体进行染色。将盖玻片放回孔中，并用 PBST 洗涤细胞三次。

然后向六孔板的每个盖玻片上各加一滴二抗 LOR 488 和 LOR 568。将盖玻片正面朝下放置于抗体液滴上，在室温避光条件下孵育一小时。二抗孵育完成后，将盖玻片放回孔板中，并用 PBST 洗涤细胞三次。

最后，使用抗荧光淬灭封片剂（ProLong Gold）封片，并在室温避光条件下孵育过夜，待干燥后通过共聚焦显微镜对固定细胞进行成像。PJ 34 是一种稳定的水溶性光敏化合物，先前研究发现其可特异性清除具有多个中心体的癌细胞，而对具有两个中心体和双极纺锤体的正常分裂细胞无损伤作用。在本研究中，采用活体人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞检测 PJ 34 的细胞毒性活性，该细胞系具有较高频率的额外中心体。

细胞转染了标记γ微管蛋白的GFP，以标记γ微管蛋白焦点，同时转染了标记染色体的组蛋白H2B红色荧光蛋白。通过共聚焦成像对M-D-A-M-B 231细胞持续扫描至少16小时，结果显示大多数处于有丝分裂期的细胞中存在中心体的双焦点聚集，即额外中心体的双焦点聚集，如下列视频片段所示。第一个视频展示了一个随机选取的处于有丝分裂期的活细胞，其中中心体由γ微管蛋白标记为绿色。

第二个视频中，通过组蛋白H2B红色标记的M-D-A-M-B 231细胞，展示了有丝分裂过程中GFP标记的染色体重排情况。第三个视频显示了一个正在进行有丝分裂的MDA MB 231细胞，其中双焦点聚集的着丝粒灶呈绿色标记，染色体呈红色标记。相比之下，在含有20 µM PJ 34的培养基中孵育的活转染M-D-A-M-B 231细胞中，检测到未聚集的中心体以及染色体排列异常，这些细胞的有丝分裂最终导致细胞死亡，如本视频所示。

在有丝分裂过程中对细胞死亡进行的实时记录，有力地支持了此前定义的人类恶性细胞在有丝分裂中出现多极纺锤体的数量与经 PJ 34 孵育后细胞死亡百分比之间的正相关关系。由于 PJ 34 作为一种强效的 PARP 1 抑制剂，因此研究了 PARP 1 抑制是否会导致与有丝分裂失败相关的细胞死亡。本文展示了在正常及 PARP 1 缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞中，随着 PJ 34 浓度增加所测试的细胞毒性活性结果。

左侧图表显示了在含有指定浓度 PJ 34 的培养基中孵育 48 小时后，正常小鼠胚胎成纤维细胞（黑色线条表示）和 PARP1 缺陷型成纤维细胞（灰色线条表示）中多焦点纺锤体百分比的计算结果。这些百分比数据来自三次不同实验中检测到的共计 20 个纺锤体。右侧图表显示了正常小鼠胚胎成纤维细胞和 PARP1 缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞在 20 微摩尔浓度下孵育 72 小时后的存活率。

PJ 34 对细胞存活率的影响通过检测细胞的ATP生成量来评估。结果显示了三次不同实验中每种细胞系四次测量的平均值。结果表明，PJ 34 以剂量依赖方式导致PARP1缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞出现纺锤体畸形和细胞死亡，但在正常成纤维细胞中未观察到该现象。

PJ 34 能够清除缺乏 PARP1 的甲硫氨酸缺陷细胞，尽管这些细胞本身缺乏 PARP1，且在 PARP1 缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中，多极纺锤体的形成与细胞清除之间的相关性在使用高于 PARP1 抑制所需浓度的 PJ 34 孵育时尤为明显，这一现象与 PARP1 缺陷小鼠胚胎成纤维细胞中中心体去聚集和 PARP1 抑制之间存在因果关联的说法并不一致。这些共聚焦图像显示了处于有丝分裂阶段的正常及 PARP1 缺陷小鼠胚胎成纤维细胞，细胞经固定、通透并用免疫荧光标记 α-微管蛋白和 γ-微管蛋白，分别将纺锤体标记为绿色，中心体标记为红色。染色体则用 DPI 染料标记为蓝色。

细胞未经处理或在指定浓度下与PJ 34孵育48小时。在用PJ 34处理的PARP 1缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞中观察到未聚集的γ-微管蛋白灶、纺锤体畸形以及细胞死亡，而在用PJ 34处理的正常小鼠胚胎成纤维细胞中则未观察到上述现象。部分被检测的细胞培养物用两种强效非芳香族PARP 1抑制剂ABT-888和AG01469处理，这两种抑制剂可抑制PARP 1的酶活性。

两种经测试的PARP1抑制剂在抑制PARP1活性的浓度下，均未对正常的小鼠胚胎成纤维细胞产生损伤。这些PARP1抑制剂在PARP1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中也未影响中心体聚集。这些结果表明，PJ 34对具有多中心体细胞的细胞毒性作用并未被其他强效PARP1抑制剂所共有，一旦掌握。

该技术可用于其他多种活细胞类型，适用于各种研究方案。