从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

本实验的总体目标是从以脂肪抽吸物形式获得的脂肪组织中分离出脂肪来源的干细胞。首先去除手术溶液，并清洗抽吸物中的污染性红细胞；第二步是利用胶原酶对清洗后的脂肪抽吸物进行酶消化，从而释放干细胞。

接下来，通过离心收集以基质血管组分（SVF）形式释放的细胞。最后一步是去除上清液，并将SVF细胞接种，用于筛选和培养贴壁的脂肪源性干细胞（ASCs）。最终对体外培养的这些ASCs进行成骨、成脂和成软骨诱导。

除了确认这些细胞的多向分化潜能外，还可利用细胞系来验证其在培养物中的存在。通常，初次使用该方法的研究人员会因在细胞收获前处理大量脂肪抽吸物的物流问题而遇到困难。请预先准备好无菌的I型胶原酶溶液和无菌对照培养基。

将脂肪抽吸物收集到吸出容器中。小心地将脂肪抽吸物倾倒入一个无菌的一升玻璃烧杯中。当脂肪抽吸物通过重力分层后，若存在上层油相，则吸除上层油层。

同时，去除下层液体。评估所得脂肪组织层的体积。加入与脂肪组织等体积的无菌 1× PBS，并用用于抽吸的移液管进行搅拌。

当两层液体完全分层后，使用10毫升血清移液管吸除上清液。继续用PBS洗涤脂肪组织组分，直至脂肪层呈现黄金色。最后一次吸除上清液，保留脂肪组织组分。

在玻璃容器中。最后一次洗涤后，在最终吸取前，让脂质抽提层静置五分钟。在过滤装置中，配制无菌胶原酶1A溶液。

加入与脂肪部分等体积的无菌过滤液。然后将洗涤后的脂肪部分小心倒入胶原酶溶液中，并 tightly close the bottle。随后将胶原酶与脂肪的混合物置于37°C水浴中孵育30分钟，每5至10分钟轻轻摇晃一次；随着消化过程进行，观察脂肪组织层是否变得更为平滑，如有必要，可延长反应时间以溶解任何残留的固体脂肪块。

用70%乙醇对含有消化后胶原酶脂肪混合物的滤器单元进行灭菌，然后将其放回生物安全柜中。现在将含有基质血管组分的25毫升等分试样移入无菌的50毫升离心管中。向每根离心管中加入25毫升对照培养基，并在室温下孵育5分钟，以灭活胶原酶。

然后在生物安全柜中以1,200 × g离心10分钟，以收集基质血管组分沉淀。吸除每根试管中的上清液，确保将上层油相及任何漂浮的脂肪细胞随上清液一同吸除。

接下来，使用 30 毫升预温培养基将 SVF 沉淀合并至一个离心管中，离心后将沉淀均分至两个新的 50 毫升离心管中，并吸除两个沉淀的上清液。如果需要进行红细胞裂解，可将这两个沉淀分别重悬于 10 毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育 10 分钟。离心后，吸除上清液，得到基质血管组分的沉淀。

将这两个沉淀合并至一个新离心管中。使用5到10毫升对照培养基，可通过置于新50毫升离心管上方的100微米孔径滤网过滤除去较大的组织颗粒。随后将含有脂肪干细胞的滤过部分分装至组织培养皿中。

然后向每块培养皿中加入适量的对照培养基。培养细胞三至四天，期间不更换培养基。吸除培养基，用无菌 PBS 洗涤细胞一次，以去除可能残留的红细胞，随后补充新鲜培养基并继续培养。本操作适用于采用手动酶解法从大体积脂肪抽吸样本中分离基质血管组分时的细胞处理步骤。

所获得的培养后ASC群体在形态上相对均一，主要由成纤维细胞样细胞组成，这是最常用的验证方式。在体外，通过特定的培养条件诱导ASC群体，可使其分化为中胚层、外胚层和内胚层谱系。体外三胚层分化潜能使得ASC被广泛应用于多种再生医学模型系统。

向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化通常足以鉴定间充质干细胞（ASC）并确认其多向分化潜能。此外，ASCs 还可分化为中胚层来源的骨骼肌细胞和血管平滑肌细胞，以及外胚层或内胚层肝细胞谱系的细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何从脂肪组织中分离获得基质血管组分（SVF）。

对于图灵而言，它是 SC 的一个组成部分。