从人类Lipoaspirates脂肪来源干细胞的手动隔离
2013年9月26日
在2001年，研究人员在加州大学洛杉矶分校所述的成体干细胞群的分离，称为脂肪来源的干细胞或的ASC，从脂肪组织。本文概述了先进的结构陶瓷的使用手册，酶消化协议使用胶原酶lipoaspirates隔离。
该程序的总体目标是从以脂肪抽吸物形式获得的脂肪中分离脂肪来源的干细胞。这是通过首先去除手术溶液并清洗吸入污染红细胞来实现的。第二步是通过用胶原酶对洗涤后的脂肪抽吸物进行酶消化来释放干细胞。
接下来，通过离心收集基质血管部分或 SVF 形式的释放细胞。最后一步是去除上清液和板，用于选择和培养贴壁 ASC 的 SVF 细胞。最终在体外将这些培养的 ASC 诱导到骨骼、脂肪和软骨。
谱系可用于确认培养物中这些细胞的存在，以及确认它们的多重潜力。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在细胞收获之前处理大量脂肪阿司匹林的后勤工作。准备无菌胶原酶 1 型 a 溶液和无菌对照培养基。
将 lippo 吸液收集在吸液容器中。小心地将 lippo 吸液倒入无菌的 1 升玻璃扬声器中。当 lippo 吸油层因重力分离时，吸出顶部油层（如果存在）。
另外，去掉底部 inate。评估所得脂肪组织层的体积。加入等体积的无菌 1 XPBS，并用用于吸液的移液管搅拌。
当两层沉淀后，使用 10 毫升血清移液管吸出 inate。继续用 PBS 洗涤脂肪组织部分，直到脂肪层呈黄金色。最后一次吸出 inate，留下脂肪组织部分。
在玻璃扬声器中。让 lippo 吸液层在最后一次洗涤后和最后一次吸液之前静置 5 分钟。在过滤装置中，制备无菌胶原酶 1 溶液。
添加与脂肪组分和无菌过滤器相等的体积。然后小心地将洗涤后的脂肪组分倒入胶原酶溶液中，并盖紧瓶子。然后将胶原酶脂肪混合物在 37 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟，每 5 到 10 分钟轻轻旋转一次，随着消化的进行，评估脂肪组织层是否看起来更光滑，如有必要，增加反应时间以溶解任何固体脂肪块。
用 70% 乙醇对含有消化的胶原酶脂肪混合物的过滤装置进行消毒，然后将其放回生物安全柜中。现在将 25 毫升等分试样的含有基质血管部分的 inate 移液到无菌的 50 毫升离心管中。向每管中加入 25 mL 对照培养基，并在室温下孵育 5 分钟以灭活胶原酶。
然后以 1， 200 倍 G 离心 10 分钟，以沉淀形式收集在生物安全柜中。从每个试管中吸出上清液。确保用该上清液吸出顶部油层和任何漂浮的脂肪细胞。
接下来，使用 30 毫升条件培养基将 SVF 沉淀合并到一个离心管中，并在离心后从两个沉淀中吸出上清液，均匀分配到两个新的 50 毫升离心管中。如果需要 RBC 裂解，这两个沉淀可以分别重悬于 10 mL RBC 裂解缓冲液中，并在室温下孵育 10 分钟。离心后，吸出上清液以产生基质血管部分的沉淀。
将这两个沉淀合并到一个新的离心管中。使用 5 至 10 mL 对照培养基，可以使用放置在新的 50 mL离心管顶部的 100 μm 网状过滤器过滤掉大的组织颗粒。现在将含有脂肪干细胞的过滤级分分到组织培养皿上。
然后用适当的控制体积补充每个盘子。媒体文化。细胞在不更换培养基的情况下吸出培养物、培养基并用无菌 PBS 洗涤细胞一次以去除任何污染的红细胞，然后补充培养基并继续培养，同时使用这种手动酶从大量 lippo 抽吸物样品中分离基质血管部分。
所得培养的 A SC 群体在外观上相对同质，由成纤维细胞样细胞组成，是最常用的验证手段。使用确定的培养条件对 A SC 群体进行体外诱导，导致它们分化为中胚层、外胚层和内胚层谱系。虽然体外三胚层的潜力导致 ASC 用于各种再生模型系统。
分化为成脂细胞、成骨细胞和同源细胞通常足以识别 A SC 并确认其多效性。此外，ASCs 还可以分化为外胚层谱系或内胚层肝细胞谱系的骨骼肌源性和平滑肌源性谱系细胞。观看此视频后，您应该对如何从 Lipos 中分离基质血管部分有很好的了解。
就 Turing 而言，它是一个 SC 组件。
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概述
本文描述了使用手动酶消化协议与胶原酶从脂肪吸取物中分离脂肪来源干细胞（ASC）。该过程包括洗涤吸取物、酶消化和培养细胞以进行进一步研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 组织工程
背景
- 脂肪来源干细胞（ASC）是再生治疗的一种有前景的来源。
- ASC可以分化为多种细胞类型，包括骨、脂肪和软骨。
- 从脂肪组织中分离ASC对于其在研究和治疗中的应用至关重要。
- 先前的研究已经建立了ASC分离的方法，但优化仍在进行中。
研究目的
- 提供从脂肪吸取物中分离ASC的详细协议。
- 提高研究目的下ASC分离的效率。
- 促进ASC分化和潜在治疗应用的研究。
使用的方法
- 移除手术溶液并洗涤脂肪吸取物。
- 使用胶原酶对洗涤后的脂肪吸取物进行酶消化。
- 通过离心收集基质血管分数（SVF）。
- 将SVF细胞接种以选择并培养粘附的ASC。
主要结果
- 使用所描述的协议成功从脂肪吸取物中分离出ASC。
- 获得了可生存的ASC并进行进一步分化研究的培养。
- 该方法在去除污染物和最大化细胞产量方面表现出了效率。
- ASC在体外显示出分化为多种细胞谱系的潜力。
结论
- 所描述的酶消化协议对于ASC分离是有效的。
- 分离出的ASC可以用于再生医学中的各种应用。
- 需要进一步研究以探索ASC在治疗情境下的全部潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) from lipoaspirates provides a scalable source of multipotent cells for early-stage regenerative medicine research. This protocol enables target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems by generating adherent ASC populations capable of multi-lineage differentiation. The method supports mechanistic de-risking and predictive confidence in preclinical models by yielding homogeneous stromal vascular fraction-derived cells for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mesenchymal stromal cell heterogeneity and functional validation of ASC multipotency through defined differentiation assays.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate ASCs from human adipose tissue, reducing variability in primary cell sourcing for target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates adherent ASC populations suitable for high-content screening of compounds modulating adipogenic, osteogenic, or chondrogenic pathways.
- Operational Value: Yields stromal vascular fraction (SVF) pellets that can be standardized across lipoaspirate volumes, supporting assay scalability and cross-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages confirms functional potency, enabling use in preclinical models of tissue regeneration.
- Operational Value: Scalable isolation from large-volume lipoaspirates supports consistent cell supply for longitudinal preclinical studies and IND-enabling work.
Pipeline & Workflow Integration
The ASC isolation workflow fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a renewable cell source for mechanistic assays and phenotypic screening prior to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal cell function and pathway modulation in human-derived mesenchymal populations.
- Screening: Delivers adherent ASC monolayers with consistent morphology for compound library screening and dose-response profiling.
- Analytics: Enables quantification of differentiation efficiency via lineage-specific staining (e.g., Oil Red O, Alizarin Red) as a quantitative readout for compound effects.
- Translational Research: Differentiation capacity into mesodermal lineages supports continuity into preclinical models of bone, fat, and cartilage repair.
- Enterprise Reuse: Protocol adaptability to varying lipoaspirate volumes allows reuse across multiple projects and therapeutic areas without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity through validated multi-potency assessment of isolated ASCs.
- Operational Value: Standardization of enzymatic digestion and washing steps minimizes batch-to-batch variability in SVF yield.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on differentiation potential reduce late-stage attrition in regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of ASC-derived therapies enabled by reliable potency metrics from in vitro differentiation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and sterile technique to maintain ASC viability during isolation.
- Dependent on access to sterile collagenase Type I, biosafety cabinets, and refrigerated centrifuges for SVF processing.
- Necessitates standardization of washing protocols to achieve consistent adipose tissue coloration and red blood cell removal.
- Adaptation considerations include adjusting collagenase concentration and incubation time based on lipoaspirate density and donor variability.
- Practical limitations include cell yield variability tied to donor age, BMI, and liposuction technique, as noted in the source material.
