Name: 从人类Lipoaspirates脂肪来源干细胞的手动隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解从人类脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞的标准化酶消化方案。该方法通过胶原酶消化和离心收集基质血管组分，获得具有多向分化潜能的贴壁干细胞，适用于再生医学与组织工程研究。

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作者谨向对本方案的开发及脂肪来源干细胞（ASCs）的分离作出贡献的其他研究人员致以感谢，包括：H. Peter Lorenz 博士、Hiroshi Muzuno 博士、Jerry Huang 博士、Adam Katz 博士、William Futrell 博士、Rong Zhang 牙科博士及哲学博士、Larissa Rodriguez 博士、Zeni Alfonso 哲学博士以及 John Fraser 哲学博士。本研究所呈现的结果部分由美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助支持，包括国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所（NIAMS）和国家牙颅面研究所（NIDCR）。

本文所示方案描述了通过美容手术获得的脂肪抽吸物，利用酶消化法和差速离心法手动分离脂肪来源的基质细胞（ASCs）的实验步骤。该方案最初于2001年发表在《组织工程》（Tissue Engineering）期刊上。 1，由于这些细胞是从脂肪抽吸物中分离得到的，因此被称为加工后脂肪抽吸物细胞（Processed Lipoaspirate Cells）或PLA细胞。然而，目前“PLA细胞”这一术语已被“”所取代 脂肪来源的干细胞或ASCs 以使该领域在命名法上具有一定的规范性。通过本方案分离的细胞已被多项研究证实具有中胚层分化潜能 体外 和 体内 （综述详见 4此外，还探索了ASC的外胚层和内胚层分化潜能 4分离技术简单直接，完成整个过程约需一小时。获得的细胞在标准组织培养条件下进行培养。随着培养时间的延长，脂肪源性干细胞（ASC）群体逐渐趋于均一，主要由成纤维样细胞组成，这些细胞易于扩增，并在长期培养中保持良好的活力。

	注意： 本文末尾列出了所需的以下设备。所有玻璃器皿、培养基和试剂均应通过高压灭菌或经0.22 μm滤器过滤进行灭菌。应始终遵循无菌细胞培养技术。为确保无菌操作，所有放入生物安全柜的材料均需用70%乙醇溶液喷洒，并用洁净的纸巾擦拭灭菌。

	1. 收获前，准备以下物品：
<ol>
	<li>
		无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） 用于冲洗脂肪抽吸物。每100 ml脂肪抽吸物准备约1 L的1×PBS。将PBS高压灭菌后，冷却至室温备用。可选：待PBS冷却后，加入抗生素/抗真菌剂，终浓度分别为：100 I.U./ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2.50 μg/ml两性霉素B。</li>
	<li>
		无菌的 0.075-0.1% 胶原酶 IA 型 （来自 Clostridium histolyticum用于脂肪抽吸物的酶消化。胶原酶的浓度取决于其质量和来源。 即 粗品与纯化品。也可使用其他类型的胶原酶（例如 II 型或 IV 型胶原酶）在相似浓度下使用。用 1,000 ml 过滤系统（配备 0.22 μm 滤膜）在 1x PBS 中配制并进行无菌过滤图1A）。然而，也可使用带有瓶顶滤器的无菌玻璃瓶。在室温下配制并使用。胶原酶溶液可短期保存于4 °C，直至使用时。切勿冷冻胶原酶溶液，以免降低其活性。</li>
	<li>
		无菌 对照培养基（CM） 用于胶原酶失活及ASC群体的培养。配制500 ml CM培养基时，混合以下组分：500 ml DMEM（含4.5 g/L葡萄糖，含L-谷氨酰胺）、50 ml胎牛血清（热灭活）、5 ml青霉素/链霉素（10,000 IU青霉素，10,000 μg/ml链霉素）。可选地，也可加入5 ml两性霉素B（250 μg/ml两性霉素B）。若使用非无菌试剂，必须对培养基进行无菌过滤。使用前将CM置于37 °C水浴中预热30分钟。</li>
	<li>
		无菌 用于分离的玻璃器皿和塑料器皿. 高压灭菌一个1,000 ml玻璃烧杯，使用前冷却至室温。此外，准备好以下塑料器皿：无菌血清移液管（5 ml、10 ml和25 ml）、50 ml离心管以及经组织培养处理的培养皿。</li>
</ol>

	2. 从脂肪抽吸物中分离ASCs

大多数脂肪抽吸物被收集在抽吸容器中（见图1B），通常可分为三个明显层次：1）上层为油脂层，来源于成熟脂肪细胞的裂解；2）中层为脂肪组织层；3）下层为液体状的底层沉淀物，含有生理盐水以及红细胞（RBCs）等污染性细胞类型。上层油脂层可能并不显著。若存在，应予以吸除，因为油脂污染可能影响最终获得的脂肪来源间充质干细胞（ASC）培养物的活力。在处理前应去除下层的底层沉淀物，以尽量减少红细胞对ASC培养物的污染。处理后将保留中间的脂肪组织层，随后对其进行洗涤并进行酶消化，以释放其中的细胞成分——基质血管组分（SVF）。
<ol>
	<li>
		清洗脂肪抽吸物：在组织培养罩内打开脂肪抽吸物容器，小心地将脂肪抽吸物倾倒入一个无菌的1 L玻璃烧杯中。静置使脂肪抽吸物分层，直至脂肪组织层充分分离（图1B）。
		<ol>
			<li>使用无菌玻璃移液管吸除油层（如果存在），并用10 ml血清移液管吸除底部的盐水底层液。此步骤可去除大部分污染的红细胞和盐水。</li>
			<li>评估所得脂肪组织层的体积，并加入等体积的无菌1×PBS。用抽吸所用的移液管搅拌，使脂肪抽吸物与PBS充分混合。静置使两层重新分离。如上所述，1×PBS中可添加抗生素/抗真菌剂。</li>
			<li>使用10 ml血清移液管吸除底层液。</li>
			<li>按照步骤2.1.2和2.1.3所述继续洗涤脂肪组织组分，直至脂肪层呈现黄色/金黄色。最后一次吸除底层液，将脂肪组织组分保留在玻璃烧杯中。为确保充分去除底层液，最后一次洗涤后静置5分钟，再进行最终的吸除操作。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>
		脂肪抽吸物的酶消化： 按照前述方法在滤器单元中配制无菌胶原酶1A溶液，配制体积应与脂肪组分体积相等，并进行无菌过滤。
		<ol>
			<li>
				胶原酶溶液过滤完成后，弃去上层滤器，小心将洗涤后的脂肪组分倒入胶原酶溶液中，并 tightly 封闭瓶口。</li>
			<li>
				将胶原酶/脂肪混合物置于37 °C水浴中，在37 °C下消化30分钟。每5–10分钟轻轻摇动混合物一次，然后放回水浴。随着消化进行，脂肪组织层应变得更为“平滑”（图1B）。如果脂肪组织层中仍可见固体脂肪块，可延长消化时间（例如，最长至2小时）。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>
		ASCs的分离： 将消化后的胶原酶/脂肪混合物重新放回生物安全柜中。在放回柜内前，务必用70%乙醇对滤器单元进行消毒。
		<ol>
			<li>
				用移液管将含有基质血管组分（SVF）的底层液以25 ml等分量转移至无菌50 ml离心管中。</li>
			<li>
				向每根离心管中加入25 ml CM。在生物安全柜中室温孵育5分钟，使CM灭活胶原酶。</li>
			<li>以1,200 × g离心10分钟，收集SVF沉淀。</li>
			<li>
				在生物安全柜中，吸除每根离心管中的上清液。确保将顶层油层及任何漂浮的脂肪细胞一并吸除（图1B）。</li>
			<li>
				使用30 ml CM将SVF沉淀合并至一根离心管中，并均等地分装至两个新的50 ml离心管中。按步骤2.3.3进行离心，并吸除两个SVF沉淀的上清液（图中未显示）。 
				可选步骤： 若需裂解红细胞，将每个SVF沉淀用10 ml红细胞裂解缓冲液（160 mM NH4Cl）重悬，室温孵育10分钟。按步骤2.3.3离心后吸除上清液，获得SVF沉淀（图中未显示）。</li>
			<li>使用5–10 ml CM将两个SVF沉淀合并至一根新的离心管中（图1B）。</li>
			<li>为去除较大的组织颗粒，将重悬的SVF沉淀通过置于新50 ml离心管上方的100 μm孔径滤网进行过滤，依靠重力自然滤过。</li>
			<li>
				将重悬并过滤后的SVF沉淀（含ASCs）以等分量移入经组织培养处理的培养皿中。向每个培养皿中补充适量体积的CM。</li>
			<li>
				将细胞在37 °C、5% CO2条件下用CM培养3–4天，期间不更换培养基。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
经过初始培养期后，可吸除培养基，并用无菌1×PBS轻轻洗涤以去除污染的红细胞。更换为CM，根据需要继续培养ASCs。所使用的组织培养皿的类型以及重悬的SVF沉淀在这些培养皿中的分配方式，将取决于常规组织培养后所需的细胞数量。

	3. ASC 群体的表征：流式细胞术与多向分化

	分离后，应对ASC群体进行表征。常规方法包括采用流式细胞术分析细胞表面CD抗原谱型 体外 通过多向分化实验确认其多向分化潜能。尽管可对ASCs的多种分化方向进行评估，本方案重点阐述ASCs向脂肪细胞系、成骨细胞系和软骨细胞系的分化，以验证其多向中胚层分化潜能。 5.

	体外 多向分化脂肪源性干细胞（ASCs）
<ol>
	<li>
		脂肪源性干细胞（ASCs）的成骨分化：诱导前，按如下方法配制成骨诱导培养基（OM）：向一瓶500 ml的DMEM培养基（含4.5 g/ml葡萄糖）中加入25.0 ml胎牛血清（FBS，终浓度为5.0%）和5.0 ml青霉素/链霉素溶液（终浓度分别为10,000 I.U/ml和10,000 mg/ml）。在此基础上，加入以下成骨诱导剂，使其达到指定的终浓度：地塞米松（终浓度0.1 μM）、L-抗坏血酸-2-磷酸（终浓度50.0 μM）和β-甘油磷酸钠（终浓度10.0 mM）。
		<ol>
			<li>
				诱导前，收集并接种培养的ASCs至所需组织培养皿中，使细胞融合度约为50%。每接种一个实验组培养皿，需额外接种一个未诱导对照组培养皿。在完全培养基（CM）中过夜培养。 
				注意：建议细胞融合度为50%，以保证在诱导过程中细胞仍可继续增殖。
			</li>
			<li>
				在诱导当天，吸除原有培养基，并按如下方式添加新培养基：向目标成骨诱导实验孔中加入OM，向对照孔中加入CM。培养基体积根据组织培养皿的规格而定：12孔板每孔加1.0 ml培养基即可；6孔板每孔加2.0 ml；100 mm培养皿每皿加10.0 ml。
			</li>
			<li>将细胞培养至少14天，每隔3–4天更换一次相应培养基。高成骨潜能的ASC群体可能在诱导7天时即出现细胞外基质矿化的迹象。</li>
			<li>
				可通过冯科萨（von Kossa）组织化学染色法检测磷酸钙沉积，以确认成骨分化（即细胞外矿化沉积）。该染色可产生黑褐色沉淀，用于标识细胞外磷酸钙的存在（见图2）。 
				von Kossa染色步骤如下：
				<ol>
					<li>吸除实验组细胞的OM和对照组细胞的CM。</li>
					<li>用1×PBS配制的4.0%多聚甲醛固定细胞60分钟。</li>
					<li>用1×PBS洗涤细胞两次。</li>
					<li>将细胞与2.0%硝酸银溶液（用水配制）在避光条件下孵育30分钟。</li>
					<li>吸除硝酸银溶液，用蒸馏水洗涤两次，然后将细胞自然晾干。</li>
					<li>将细胞暴露于紫外光下60分钟，以显现出磷酸钙沉淀。</li>
					<li>用1×PBS多次洗涤细胞。</li>
					<li>如需，可用苏木精对细胞进行复染。</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="2">
	<li>
		ASCs 的成脂分化： 诱导前，按如下方法配制成脂诱导培养基（AM）：向一瓶 500 ml 的 DMEM 培养基（含 4.5 g/ml 葡萄糖）中加入 50.0 ml 胎牛血清（FBS，终浓度为 10.0%）和 5.0 ml 青霉素/链霉素溶液（终浓度分别为 10,000 I.U/ml 和 10,000 μg/ml）。在此基础上，加入以下成脂诱导剂，使其达到指定的终浓度：地塞米松（终浓度 1.0 μM）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，终浓度 0.5 mM）、吲哚美辛（终浓度 0.2 mM）和胰岛素（终浓度 10.0 μM）。
		<ol>
			<li>
				诱导前，将培养的 ASCs 收集并接种至所需的组织培养皿中，使细胞融合度达到约 80%。每接种一个实验组培养皿，需额外接种一个未诱导对照组培养皿。在 CM 培养基中过夜培养。注意： ASCs 的成脂分化效率随细胞融合度增加而提高。</li>
			<li>
				诱导当天，吸除培养基，并按以下方式添加新培养基：向目标成脂诱导实验孔中加入 AM，向对照孔中加入 CM。培养基体积根据组织培养皿的规格而定。对于 12 孔板，每孔加入 1.0 ml 培养基即可；对于 6 孔板，每孔加入 2.0 ml 培养基即可；对于 100 mm 培养皿，每皿应使用 10.0 ml 培养基。</li>
			<li>将细胞培养至少 14 天，每隔 3–4 天更换一次相应培养基。高成脂潜能的 ASC 群体可能在诱导 7 天时即出现脂滴形成的迹象。</li>
			<li>正在进行成脂分化的 ASCs 将形成多个脂滴，在光学显微镜下可清晰观察到。此外，可通过油红 O 组织学染色进一步确认成脂分化，该染料会在脂滴内积聚（见 图 2）。 
				油红 O 染色步骤如下：
				<ol>
					<li>吸除实验组和对照组细胞的培养基，使用 10% 甲醛钙固定液固定 60 分钟。配制该固定液的方法为：将 1.0 g CaCl2、25.0 ml 16% 多聚甲醛（终浓度为 4.0%）与 75.0 ml 蒸馏水混合均匀。</li>
					<li>用 1× PBS 洗涤细胞两次。</li>
					<li>用 70% 乙醇短暂洗涤细胞。</li>
					<li>室温下用油红 O 溶液孵育细胞 5 分钟。油红 O 溶液的配制方法为：将 2.0 g 油红 O 粉末溶解于 50.0 ml 70% 乙醇和 50.0 ml 丙酮的混合液中。</li>
					<li>先用 70% 乙醇洗涤细胞，再用自来水洗涤。</li>
					<li>
						染色后应尽快观察，因染色会随时间逐渐褪色。</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="3">
	<li>
		ASCs 的软骨向分化： 软骨向分化通过一种称为&quot;微团培养&quot;的高密度培养技术实现。在培养前，按如下方法配制软骨诱导培养基（ChM）：向一瓶 500 ml 的 DMEM（含 4.5 g/ml 葡萄糖）中加入 5.0 ml 胎牛血清（FBS，终浓度为 1%）和 5.0 ml 青霉素/链霉素溶液（终浓度分别为 10,000 I.U/ml 和 10,000 μg/ml）。在此基础上，加入以下软骨诱导因子，使其达到指定的终浓度：L-抗坏血酸-2-磷酸（终浓度 50.0 μg/ml）、胰岛素（终浓度 6.25 μg/ml）、转铁蛋白（终浓度 6.25 μg/ml）和 TGFβ1（终浓度 10.0 ng/ml）。
		<ol>
			<li>
				收集 ASCs 并在 1,200 × g 条件下离心 5 分钟以沉淀细胞。计数细胞以确定细胞悬液的密度。</li>
			<li>为制备微团细胞团，配制两种细胞悬液：一种为实验组悬液，用 ChM 配制，细胞密度为 1 × 107 个细胞/ml；另一种为对照组悬液，用 CM 配制，细胞密度同样为 1 × 107 个细胞/ml。
				<ol>
					<li>将 10.0 μl 的细胞悬液“液滴”分别加入多孔板的各个孔中，在 37 °C 下静置 2–3 小时使其贴壁。</li>
					<li>小心地向已贴壁的液滴上层加入 ChM 或 CM，注意避免使细胞团解离。</li>
					<li>将细胞在 ChM 或 CM 中培养最多 14 天，每隔 3–4 天更换一次培养基。在 ChM 中培养的细胞会逐渐聚集，形成高密度的微团细胞团，周围单层细胞极少或无；而对照组细胞则不会发生此类聚集，多数以单层形式存在。</li>
					<li>为确认软骨形成，将细胞团在室温下用 4.0% 多聚甲醛（溶于 1× PBS）固定 15 分钟，随后使用阿利新蓝（Alcian Blue）组织学染色法检测硫酸化蛋白聚糖的存在。 
						阿利新蓝染色步骤如下：
						<ol>
							<li>用 1× PBS 将经多聚甲醛固定的细胞团洗涤一次。</li>
							<li>将细胞团在 0.1 N HCl（pH 1.0）中孵育 5 分钟，以降低其 pH 值。</li>
							<li>移除 HCl 溶液，加入 1% 阿利新蓝染液（溶于 0.1 N HCl，pH 1.0），在室温下孵育 30 分钟。</li>
							<li>移除阿利新蓝染液，并用 0.1 N HCl（pH 1.0）洗涤细胞团，以去除多余的染料。</li>
							<li>可使用自来水进行额外洗涤，以降低背景染色。</li>
							<li>作为替代方法，也可将微团细胞团收集后，在 10% 甲醛中固定过夜，经石蜡包埋并切片后进行阿利新蓝染色。</li>
						</ol>
					</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
4. ASCs 的流式细胞术表征
可通过常规流式细胞术对细胞表面CD抗原谱型进行表征。
<ol>
	<li>用于流式细胞术的ASCs制备： 分析前，配制流式细胞术缓冲液（FCB），其成分为：1.0% BSA、2.0% FBS 和 0.025% 皂苷，溶于1×PBS中。
		<ol>
			<li>收集ASCs，以1,200 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。</li>
			<li>将细胞重悬于无菌1×PBS中，使用血细胞计数板计数，并确定细胞悬液的密度。</li>
			<li>将悬液分装为每份总共5 × 105个细胞的等分试样，离心形成沉淀。</li>
			<li>弃去PBS上清液，加入过量预冷的70%乙醇，在-20 °C固定60分钟。如有需要，可将细胞保存于-20 °C冰箱中的70%乙醇中，待后续使用。</li>
			<li>
				固定后，小心吸除乙醇，并用过量FCB轻柔洗涤沉淀两次。洗涤步骤如下：
				<ol>
					<li>
						加入过量FCB，轻柔重悬沉淀。</li>
					<li>
						以1,200 × g离心5分钟，使细胞形成沉淀。</li>
					<li>
						小心吸除FCB上清液。</li>
					<li>
						重复一次。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>
				去除每份试样的最后一次FCB洗涤上清液，将细胞重悬于100 μl FCB中。按照制造商推荐的稀释比例，加入所需荧光素标记的一抗。将细胞与抗体在冰上孵育30分钟。 
				注意： 若无荧光素标记的一抗，可使用未标记的一抗。</li>
			<li>
				针对每种使用的荧光素（例如 FITC、PE），设置一份细胞试样，加入含同型对照IgG的100 μl FCB作为阴性对照。</li>
			<li>
				另设一份试样，加入不含任何抗体的100 μl FCB作为额外对照。</li>
			<li>
				按照步骤4.1.5所述方法，用FCB将每份细胞试样洗涤两次。最后一次洗涤后，将试样重悬于100 μl FCB中，立即进行流式分析。 
				注意： 若使用了未标记的一抗：在此洗涤步骤后，将试样与适当稀释的荧光素标记二抗（按制造商推荐比例配制于FCB中）在冰上孵育20分钟，然后按照步骤4.1.5所述方法再洗涤两次。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>
		ASCs的流式分析： 进行流式分析时，至少应采集10,000个事件。应利用未染色对照和同型对照，根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设定门控。其中，步骤4.1.8中的无抗体对照（即 未染色对照）用于排除碎片和死亡ASCs；步骤4.1.7中的同型对照IgG用于确定阳性荧光区域。</li>
</ol>

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</ol>

本文手稿的作者是加州大学董事会拥有并授权给Cytori Therapeutics的一项专利的共同发明人。

用于分离ASCs的脂肪组织有多种来源：可通过切除术或抽脂术获得的实体组织块，也可通过注射器抽取或负压辅助抽脂术获得的较小组织块即 吸脂术）。目前尚不明确从切除或抽吸获得的脂肪样本中是否能获取更多的基质血管组分（SVF）细胞（从而获得更多的脂肪来源干细胞，ASCs），因为已有相互矛盾的研究结果被报道 16, 17有可能，只要操作者熟练掌握分离技术，任一种脂肪组织均足以用于分离基质血管组分（SVF）细胞和脂肪源性间充质干细胞（ASCs）。然而，与手术切除相比，抽脂术具有创伤更小、术后护理需求显著减少的优势。尽管过去十年间抽脂术的类型不断增加，包括超声辅助、动力辅助以及激光辅助抽脂术等技术 18最常见的是肿胀性吸脂术，即在抽吸前向脂肪组织注入大量无菌生理盐水、麻醉剂和血管收缩剂 19不同外科医生在技术选择上可能有所不同。然而，尽管提取方法对研究者而言似乎并不重要，但必须认识到，这些技术可能会对脂肪来源干细胞（ASC）的数量和活性产生影响。例如，增加抽脂术的负压可能会对基质血管组分（SVF）细胞的得率产生负面影响。 20此外，已有研究测得在...

2001年，《组织工程》杂志报道了一群源自脂肪组织的多能干细胞群体 1这些细胞因来源于通过整形手术获得的经处理的抽吸脂肪组织，故被命名为处理后的抽吸脂肪细胞（Processed Lipoaspirate cells，PLA细胞）。本文所述的分离方法基于现有的酶消化法，用于从脂肪组织中分离基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）。 2SVF 被定义为一种经最小程度处理的细胞群体，包含尚未贴附于组织培养基质的红细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞和前脂肪细胞。 2, 3随着时间推移对这一基质血管组分（SVF）进行培养，被认为可消除其中多数污染性细胞群体，从而获得一种贴壁生长的成纤维细胞样细胞群。在过去40年的文献中，这些成纤维细胞被认定为前脂肪细胞。然而，我们研究团队证实这些细胞具有中胚层多向分化潜能，并将贴壁的SVF细胞群重新命名为PLA细胞。随后，多个其他研究团队的进一步研究扩展了其分化潜能，提示其可能同时具备内胚层和外胚层分化潜能（综述见 4）。自那时起，文献中陆续出现了许多用于描述这些细胞的其他术语。为了达成一定程度的共识，脂肪源性干细胞（Adipose-derived Stem Cells）或 ASCs 这一术语在第二届nd 年度IFATS会议。因此，本文将使用术语ASC。 
本文所述方案是一种相对简单的操作流程，仅需常规实验室设备，并使用磷酸盐缓冲液、标准组织培养基试剂和胶原酶等简单试剂。根据起始脂肪组织体积及后续培养时间的不同，该方法可获得大量脂肪间充质干细胞（ASCs）。然而，处理大量脂肪组织可能会带来一些实际操作上的困难，但通过本方案可在一定程度上缓解这些问题。此外，该方案需要无菌的组织培养设施以及经认证的生物安全柜，因此必须在符合资质的组织培养实验室中进行。这一要求也可能限制ASC在临床应用中的实用性，除非这些细胞是在专为临床级材料分离与扩增而设计的符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施中分离获得的。 
作为替代方案，在手术室中使用可于封闭系统内自动分离ASC的自动化系统，可避免这一关键限制，并使得ASC能够立即使用，无需任何后续的体外扩增。截至目前，已有六种 commercially available 的自动化系统可用于从人体组织中分离细胞。这些系统可能实现在脂肪组织获取后立即从大量组织中分离出足量ASC的目标。随后，这些ASC可被直接回输至患者体内，用于多种再生医学目的，而患者无需离开手术室。 
除本方案所描述的ASC手动分离方法外，配套文章中还提供了利用Celution系统进行ASC自动化分离的相应操作流程。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco）&amp;#8217;s 改良的伊格尔培养基&amp;#8217;s 培养基)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>含 4.5 g/ml 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10,000 IU/ml 青霉素/10,000 &amp;#956;g/ml 链霉素</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-003-CF</td><td>250 &amp;#956;g/ml 两性霉素B</td></tr><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>无钙，无镁</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>20-031-CV</td><td>0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA</td></tr><tr><td>胶原酶 IA 型（来自溶组织梭菌）</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>粗提物 &amp;lt;125 胶原消化单位/毫克固体</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）热灭活</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100106</td><td>美国农业部来源，热灭活 </td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清移液管</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-106</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>150 毫米组织培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Stericup 滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>PES 膜，0.22 &amp;#956;微孔</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>FisherBrand</td><td>22-363-549</td><td>100 &amp;#956;m 尼龙网</td></tr><tr><td>地塞米松 - 水溶性</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;甘油磷酸二钠盐 </td><td>Sigma</td><td>G-9422</td><td>也称为甘油磷酸酯</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td>由牛胰腺制成</td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>脱铁转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T-4382</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;#946;1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>240-B-002</td><td>重组人</td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>阿利新蓝</td><td>Sigma</td><td>A-5268</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma</td><td>S-0319</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>以16%的储存液形式提供</td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;所需设备&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>II 级 A/B 型生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>确保通风橱配有用于抽吸的真空管路</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>赫姆勒实验室网</td><td>Z383</td><td>需要用于50 ml离心管的甩平式转子，可承受1200×g离心力</td></tr><tr><td>水浴锅 </td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>S52602Q</td><td>容量5-10升，可达到37°C</td></tr><tr><td>自动移液器辅助装置</td><td>Drummond Pipette Aid XL</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Forma 310</td><td>直接加热或水套式</td></tr></tbody></table>

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从抽脂术获取的脂肪组织中分离出的新成人干细胞群体，他们最初将其称为处理后的抽脂细胞（Processed Lipoaspirate Cells）或PLA细胞。此后，这些干细胞被重新命名为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells）或ASCs，并已成为干细胞研究和再生医学领域中最受欢迎的成人干细胞群体之一。目前已有数千篇文章描述了ASCs在多种再生动物模型中的应用，包括骨再生、周围神经修复和心血管组织工程。最近的一些文章开始报道ASCs在临床中的多种用途。本文所示方案概述了从整形手术获得的大量抽脂物中，通过人工和酶解方法手动分离ASCs的基本操作步骤。该方案可轻松根据抽脂物的体积进行放大或缩小，并可调整用于从腹壁成形术及其他类似手术获得的脂肪组织中分离ASCs。

上述方案概述了一种从大体积脂肪抽吸物样本中分离基质血管组分（SVF）的手动酶解方法。该SVF中含有多种细胞群体，包括脂肪源性基质细胞（ASC）。大量研究表明，在标准组织培养条件下培养该SVF可富集贴壁的成纤维细胞样细胞群，其主要成分为ASC。与此一致，我们通过流式细胞术和免疫荧光分析证实，培养后的SVF细胞沉淀物基本上消除了主要的污染细胞类型，即红细胞（RBCs）、平滑肌细胞以及内皮细胞谱系细胞。 1. 所获得的ASC群体在形态上相对均一，由成纤维细胞样细胞组成（图2这些贴壁的ASCs在标准的组织培养条件下培养时生长良好，且具有中等的群体倍增时间 1 使其适用于多种分子与细胞生物学研究 体外 再生研究 在体然而，鉴于分离得到的基质血管组分（SVF）具有异质性，有必要对ASC群体进行验证。已有大量研究采用流式细胞术来表征培养后ASCs的CD抗原谱，作为识别这些细胞的潜在方法 体外 和 在体 5-9. 表1 总结了多项此类研究的结果。...

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）。本文概述了使用胶原酶进行人工酶消化法从吸脂术获取物中分离ASCs的步骤。

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从抽脂术获取的组织中分离出的新成人干细胞群体的分离方法……

本实验的总体目标是从以脂肪抽吸物形式获得的脂肪组织中分离出脂肪来源的干细胞。首先去除手术溶液，并清洗抽吸物中的污染性红细胞；第二步是利用胶原酶对清洗后的脂肪抽吸物进行酶消化，从而释放干细胞。接下来，通过离心收集以基质血管组分（SVF）形式释放的细胞。最后一步是去除上清液，并将SVF细胞接种，用于筛选和培养贴壁的脂肪源性干细胞（ASCs）。最终对体外培养的这些ASCs进行成骨、成脂和成软骨诱导。除了确认这些细胞的多向分化潜能外，还可利用细胞系来验证其在培养物中的存在。通常，初次使用该方法的研究人员会因在细胞收获前处理大量脂肪抽吸物的物流问题而遇到困难。请预先准备好无菌的I型胶原酶溶液和无菌对照培养基。将脂肪抽吸物收集到吸出容器中。小心地将脂肪抽吸物倾倒入一个无菌的一升玻璃烧杯中。当脂肪抽吸物通过重力分层后，若存在上层油相，则吸除上层油层。同时，去除下层液体。评估所得脂肪组织层的体积。加入与脂肪组织等体积的无菌 1× PBS，并用用于抽吸的移液管进行搅拌。当两层液体完全分层后，使用10毫升血清移液管吸除上清液。继续用PBS洗涤脂肪组织组分，直至脂肪层呈现黄金色。最后一次吸除上清液，保留脂肪组织组分。在玻璃容器中。最后一次洗涤后，在最终吸取前，让脂质抽提层静置五分钟。在过滤装置中，配制无菌胶原酶1A溶液。加入与脂肪部分等体积的无菌过滤液。然后将洗涤后的脂肪部分小心倒入胶原酶溶液中，并 tightly close the bottle。随后将胶原酶与脂肪的混合物置于37°C水浴中孵育30分钟，每5至10分钟轻轻摇晃一次；随着消化过程进行，观察脂肪组织层是否变得更为平滑，如有必要，可延长反应时间以溶解任何残留的固体脂肪块。用70%乙醇对含有消化后胶原酶脂肪混合物的滤器单元进行灭菌，然后将其放回生物安全柜中。现在将含有基质血管组分的25毫升等分试样移入无菌的50毫升离心管中。向每根离心管中加入25毫升对照培养基，并在室温下孵育5分钟，以灭活胶原酶。然后在生物安全柜中以1,200 × g离心10分钟，以收集基质血管组分沉淀。吸除每根试管中的上清液，确保将上层油相及任何漂浮的脂肪细胞随上清液一同吸除。接下来，使用 30 毫升预温培养基将 SVF 沉淀合并至一个离心管中，离心后将沉淀均分至两个新的 50 毫升离心管中，并吸除两个沉淀的上清液。如果需要进行红细胞裂解，可将这两个沉淀分别重悬于 10 毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育 10 分钟。离心后，吸除上清液，得到基质血管组分的沉淀。将这两个沉淀合并至一个新离心管中。使用5到10毫升对照培养基，可通过置于新50毫升离心管上方的100微米孔径滤网过滤除去较大的组织颗粒。随后将含有脂肪干细胞的滤过部分分装至组织培养皿中。然后向每块培养皿中加入适量的对照培养基。培养细胞三至四天，期间不更换培养基。吸除培养基，用无菌 PBS 洗

manual-isolation-adipose-derived-stem-cells-from-human

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从人类Lipoaspirates脂肪来源干细胞的手动隔离

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

本文介绍一种通过系列机械处理（包括乳化和多次离心）从脂肪组织中获取基质血管组分的实验方案。...

脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

本方案提供了一种无需使用酶消化的方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离间充质干细胞。该方法避免了剧烈的酶处理或离心步骤，所获得的干细胞更符合临床应用需求，可用于体外研究或重新返回临床应用。...

一种无需酶解法分离与扩增人脂肪源性间充质干细胞的方法

本文介绍了一种使用封闭系统装置进行人脂肪组织无酶微片段化的技术。该新方法可获得适用于体内移植、体外培养以及进一步细胞分离与表征的亚毫米级脂肪组织簇。...

人体脂肪组织微片段化用于细胞表型分析与分泌组表征

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

本方案描述了一种改进的ADSC分离方法，与文献报道相比，该方法可获得极高的细胞产量，并节省大量时间。本研究还提供了一种简单的方法，可在长期冻存后获得相对大量的活细胞。...

从脂肪组织中获取间充质干细胞及长期冷冻保存后基质血管组分表征的技术

异源性（化学或动物来源）产品在细胞治疗制备/操作步骤中的引入，与宿主患者免疫反应性增加及病原体传播风险升高相关。本文介绍一种完全无异源成分的细胞分离与 体外...

一种用于人类治疗的无异种来源创新方法分离与培养人脂肪源性干细胞

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

了解从人类脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞的标准化酶消化方案。该方法通过胶原酶消化和离心收集基质血管组分，获得具有多向分化潜能的贴壁干细胞，适用于再生医学与组织工程研究。

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

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