小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

本实验的总体目标是从鼠类骨髓中分离并标记中性粒细胞，用于后续功能研究及过继性转移实验。首先从鼠类股骨和胫骨中收集骨髓细胞以完成第一步。在第二步中，分别将红细胞依次悬浮于0.2%和1.6%的氯化钠溶液中，通过渗透作用裂解红细胞。

接下来，通过密度梯度离心法分离中性粒细胞。最后一步是用细胞示踪染料标记中性粒细胞。最终，可通过流式细胞术确定被过继转移并募集到各种小鼠组织中的中性粒细胞数量。

与从血液或腹腔中分离小鼠中性粒细胞相比，从骨髓中分离的主要优势在于，无论是在稳态条件下还是感染后，均可获得足够数量的细胞，用于后续的功能研究和过继转移实验。与免疫磁珠分选或荧光激活细胞分选技术相比，采用梯度离心法分离小鼠中性粒细胞的优势在于该方法快速、经济，并且避免了使用抗体标记中性粒细胞，从而防止可能诱导的中性粒细胞活化。演示该实验操作的将是本实验室的技术员 muca swami us，在用70%乙醇喷洒已处死的小鼠后。

在动物皮肤的腹部中线区域做一切口，然后去除动物远端的皮肤组织，包括下肢部分。接着用剪刀剪除动物后肢的肌肉，小心地将髋臼从髋关节处脱位，避免损坏股骨头。然后使用剪刀作为手术刀，去除附着在股骨和胫骨上的剩余肌肉组织。

在膝关节处分离腿骨，注意不要折断骨端，然后将骨骼放入含有冰冻RPMI 1640的培养皿中。添加FBS和抗生素。将培养皿转移至组织培养罩内，然后在新的培养皿中用70%乙醇对外表面每根骨骼进行消毒。

大约 10 到 15 秒后，用预冷的无菌 PBS 对每块骨表面进行三次冲洗，以去除乙醇。然后切下每块骨的骨骺，并将其放入一个新的无菌培养皿中。接下来，将一支 25 号针头连接到装有 10 毫升 RPMI 的 12 毫升注射器上。

加入 FBS 和 EDTA。然后从每对股骨胫骨骨干的两端冲洗骨髓细胞，收集至一个50毫升带螺旋盖的Falcon管中，管口覆盖100微米滤膜，以去除所有细胞。用针尖刮擦骨骼内表面。

当骨骼呈现苍白时，表明细胞已充分去除。现在使用解剖刀将骨骺切成0.5至1毫米见方的小块，然后用2.5毫升Eppendorf枪头加BioPure枪头的尾端将组织块压过100微米滤网。将收集的细胞在427 × g、4°C条件下离心7分钟，随后在20毫升0.2%氯化钠溶液中裂解红细胞约20秒。

然后加入20毫升1.6%氯化钠终止裂解，离心收集细胞，再将沉淀重悬于含FBS和EDTA的RPMI 1640培养基中。计数细胞，再次离心后，将洗涤后的沉淀重悬于冰上预冷的无菌PBS中，浓度不超过100 × 10⁶个细胞/毫升。现在取3毫升18至26摄氏度的Hanks不完全平衡盐溶液（HIBS）加入15毫升锥形管中，然后缓慢地在其上层叠加3毫升18至26摄氏度的溶液。

其不透明液 1 0 7 7。制备好其不透明液后，需避免两种密度液体立即混合，小心地将骨髓细胞悬液铺加在其不透明液 1 0 7 7 上，然后在 834 ×g、25 °C 条件下离心密度梯度 30 分钟，不启用刹车，随后收集位于其不透明液 1 1 1 9 与 1 0 7 7 层之间的界面处的中性粒细胞。用含 FBS 和抗生素的 RPMI 1640 将收集的中性粒细胞洗涤两次后，重悬于预热至 37 °C 的 PBS 中，细胞浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/毫升。

计数细胞后，保留每份实验样品的一小部分，用于通过流式细胞术检测细胞纯度和活力；然后将剩余的中性粒细胞用细胞示踪染料在37°C、避光、摇动水浴中孵育10分钟，染料终浓度为5 µM。最后，用预冷的含FBS和抗生素的RPMI 1640培养基洗涤细胞两次，以避免染料交叉污染，随后将不同标记的中性粒细胞群体混合，用于后续的竞争性重constitution实验。本图显示了来自未感染的C57BL/6小鼠的骨髓经密度梯度分离后获得的中性粒细胞的代表性流式细胞术图谱。初始设门依据为位于Histopaque-1119与Histopaque-1077界面处收集的骨髓细胞。

通过前向散射和侧向散射分析表明，经密度梯度分离的中性粒细胞纯度高于90%，在过继性细胞示踪转移后至少4小时内存活率超过95%。DIA标记的中性粒细胞可通过流式细胞术在多种小鼠组织中进行追踪。例如，在本实验中，通过圈选活的CD45+ Ly6G+ CD11b+细胞，可在受体小鼠的血液、骨髓和肾脏中检测到过继转移的CMTMR标记中性粒细胞；这些代表性细胞可通过其PE表达，与受体小鼠自身CMTMR和PE双阴性的内源性中性粒细胞区分开来。

掌握后，小鼠骨髓中性粒细胞的分离与标记可在三小时内完成。