功能研究和过继转移实验小鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离，纯化及贴标
July 10th, 2013
我们描述了一个协议，用于分离和纯化从小鼠骨髓中的嗜中性粒细胞通过密度梯度离心和嗜中性粒细胞标记使用CellTracker染料。这是一个简单，快速，重复性好，经济的方法获得大量的嗜中性粒细胞的下游功能研究或过继转移和跟踪实验。
该程序的总体目标是从小鼠骨髓中分离和标记中性粒细胞，用于下游功能研究和过继转移实验。这是通过首先从小鼠、股骨和胫骨中收集骨髓细胞来实现的。在第二步中，通过将红细胞分别依次悬浮在 0.2% 和 1.6% 氯化钠溶液中来渗透吸附红细胞。
接下来，通过密度梯度离心分离嗜中性粒细胞。在最后一步中，用 Cell Tracker 染料标记中性粒细胞。最终，流式细胞术可用于确定募集到各种小鼠组织的过继转移中性粒细胞的数量。
从骨髓中分离小鼠中性粒细胞而不是血液或腹膜的主要优点是，在稳态期间和感染后，都可以从骨髓中获得足以进行下游功能研究和过继转移实验的大量细胞。与荧光激活细胞分选的免疫磁性选择相比，使用梯度离心技术分离小鼠嗜中性粒细胞的优势在于它快速、经济，并且避免了用可能诱导嗜中性粒细胞活化的抗体标记中性粒细胞。演示该程序的是 muca swami us，我实验室的一名技术人员，在用 70% 乙醇喷洒了一只被安乐死的老鼠后。
在动物皮肤的腹部中部区域切开一个切口，然后从动物的远端部分（包括下肢）去除皮肤组织。接下来，用剪刀剪断动物后肢的肌肉，然后小心地将 ACE 骨从髋关节上脱臼，以免折断股骨头。然后使用手术刀中的剪刀从股骨和胫骨上去除剩余的肌肉。
在膝关节处分离腿骨，注意不要折断骨头末端，然后将骨头放入装有冰冷的 RPMI 1 6 4 oh 的培养皿中。补充 FBS 和抗生素。将培养皿转移到组织培养罩中，然后在新的培养皿中用 70% 乙醇对每块骨头的外部进行消毒。
大约 10 到 15 秒后，冲洗每根骨头表面的乙醇，然后在冰冷的无菌 PBS 中洗涤 3 次。然后将每块骨头的骨骺切开并放入新的无菌培养皿中。接下来，将 25 号针头连接到装有 10 毫升 RPMI 的 12 cc 注射器上。
补充 FBS 和 EDTA。然后将每对股骨胫骨轴两端的骨髓细胞冲洗到 50 毫升螺旋顶 Falcon 管上，用 100 微米过滤器褪色以去除所有细胞。用针尖刮擦骨头的内表面。
当骨头看起来变白时，细胞已被充分去除。现在用手术刀将骨骨骺切成 0.5 到 1 毫米 Q 的小块，然后使用 2.5 毫升银梳尖端的后端加上 BioPure 移液器尖端将它们粉碎通过 100 微米过滤器。将收获的细胞在 427 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 7 分钟后，红细胞在 20 毫升 0.2% 氯化钠中旋转约 20 秒。
然后用 20 毫升 1.6% 氯化钠停止裂解，旋转细胞，然后将沉淀重悬于含有 FBS 和 EDTA 的 RPMI 1 6 4 oh 补充剂中。对细胞进行计数，然后在再次旋转它们后，以不超过 100 倍的速度重悬洗涤的沉淀，每 1 毫升冰中 6 个细胞。冷无菌 PBS 现在将 3 毫升 18 至 26 摄氏度、不透明的 1 1 1 9 分液放入 15 毫升锥形管中，然后慢慢叠加 3 毫升 18 至 26 摄氏度。
他的不透明 1 0 7 7.避免混合两种密度 制备后，立即将骨髓细胞悬液小心地分层放在 his 不透明 1 0 7 7 离心机上，密度梯度在 834 倍 G 和 25 摄氏度下 30 分钟，不要中断，然后在 his 不透明 1 1 1 9 和 1 0 7 7 层的界面处收集中性粒细胞。在 RPMI 1、6、4 oh FBS 和抗生素中洗涤收集的嗜中性粒细胞两次后，Resus 将细胞以 5 倍 10 至每毫升 6 个细胞的速度在 PBS 中预热至 37 摄氏度。
细胞计数后，保留每个实验样品的一小份，以通过流式细胞术确定纯度和活力，然后用终浓度为 5 微摩尔的细胞示踪染料在 37 摄氏度下在黑暗中摇动水浴中标记剩余的嗜中性粒细胞 10 分钟。最后，用冰冷的 RPMI 1 6 4 oh 补充剂洗涤细胞两次，其中含有 FBS 和抗生素，以避免染料交叉污染，然后再混合差异标记的中性粒细胞群进行下游竞争性再种群研究，此处显示了来自未感染的 C 57 black six 小鼠的骨髓分离密度梯度分离的中性粒细胞的代表性流式细胞术图，该面板所示。用于从组织病理学 1 1 1 9 和组织病理学 1 0 7 7 的界面收集的骨髓细胞的初始门控。
使用前向散射和侧向散射证明，在过继转移细胞跟踪器后至少 4 小时内，密度梯度分离的嗜中性粒细胞纯度大于 90%，活性大于 95%。DIA 标记的中性粒细胞可以通过流式细胞术在各种小鼠问题中进行追踪。例如，在本实验所示的受体念珠菌感染的 C 57 black six 小鼠的血液骨髓和肾脏中，通过对活 CD 45 LY 6 G CD 11 B 细胞进行门控，这些代表性过继转移的 C-M-T-M-R 标记的中性粒细胞可以通过它们的 PE 表达与受体小鼠的天然 C-M-T-M-R 和 PE 阴性中性粒细胞区分开来。
一旦掌握，小鼠骨髓中性粒细胞的分离和标记可以在 3 小时内完成。
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概述
本文描述了一种从小鼠骨髓中分离和标记中性粒细胞的协议。该方法涉及密度梯度离心和使用CellTracker染料，为获取用于各种研究的中性粒细胞提供了一种可重复和经济的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 中性粒细胞对免疫反应和炎症至关重要。
- 中性粒细胞的分离对功能研究至关重要。
- 骨髓是提取中性粒细胞的主要来源。
- 标记中性粒细胞有助于在体内跟踪它们的行为。
研究目的
- 从小鼠骨髓中分离中性粒细胞。
- 为采用性转移实验中的跟踪标记中性粒细胞。
- 促进中性粒细胞的下游功能研究。
使用的方法
- 从小鼠股骨和胫骨收集骨髓。
- 使用氯化钠溶液进行渗透溶解红细胞。
- 通过密度梯度离心分离中性粒细胞。
- 用CellTracker染料标记中性粒细胞。
主要结果
- 成功从小鼠骨髓中分离中性粒细胞。
- 有效地为跟踪目的标记中性粒细胞。
- 流式细胞术可以量化采用性转移的中性粒细胞。
- 该方法展示了可重复性和效率。
结论
- 该协议提供了一种可靠的中性粒细胞分离方法。
- 标记增强了研究中性粒细胞动力学的能力。
- 该方法可以应用于各种功能研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and labeling of mouse bone marrow neutrophils enables high-purity functional studies and adoptive transfer experiments, supporting mechanistic de-risking in immunology-focused discovery pipelines. This protocol addresses a key bottleneck in obtaining sufficient, viable neutrophils for quantitative in vivo tracking and competitive repopulation studies. The approach enhances predictive confidence in target validation and gene function assessment within disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neutrophil trafficking and effector responses.
- Supports mechanistic de-risking by allowing side-by-side comparison of wild-type and gene-deficient neutrophils in vivo.
- Facilitates functional target validation in acute inflammation and infectious disease models.
Screening & Assay Development
- Provides high-purity, viable neutrophils for standardized downstream assays such as phagocytosis, cytokine production, and degranulation.
- Enables reproducible labeling for multiplexed tracking in competitive repopulation and trafficking studies.
- Supports quantitative flow cytometry readouts for robust assay development and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant in vivo models for translational biomarker and trafficking studies.
- Enables continuity from discovery-stage gene function analysis to preclinical validation of immune cell behavior.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative data on neutrophil dynamics in target tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality neutrophils for functional, mechanistic, and trafficking studies in mouse models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-specific neutrophil functions and trafficking mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready neutrophils for reproducible, quantitative downstream analyses.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of adoptively transferred cell populations across tissues.
- Translational Research: Provides a platform for in vivo validation of immune cell behavior in disease-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across immunology and inflammation research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and immune cell trafficking studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and economical neutrophil isolation and labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, quantitative in vivo functional assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in murine tissue dissection, density gradient centrifugation, and flow cytometry.
- Needs access to cell labeling reagents, centrifuges, and analytical flow cytometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in multi-site or multi-study settings.
- Adaptable to various mouse strains and gene-deficient models for comparative studies.
- Viability and purity are time-limited, requiring prompt downstream processing post-isolation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Isolation of Mouse Bone Marrow Cells
4:14
Neutrophil Density Gradient Centrifugation Separation and CellTracker Dye-labeling
5:50
Results: Bone Marrow-isolated Neutrophils are Highly Purified, Highly Viable, and Trackable by Dye-labeling in Various Mouse Tissues after Adoptive Transfer
7:07
Conclusion
