Name: 基因编码的分子探针来研究G蛋白偶联受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: 学习利用基因编码的非天然氨基酸p-叠氮-L-苯丙氨酸研究G蛋白偶联受体的结构功能，通过光交联和生物正交标记技术实现位点特异性修饰，为神经科学和结构生物学研究提供灵活高效的新方法。

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我们感谢多家基金会和慈善捐赠者的慷慨支持（详见 SakmarLab.org）。

1. 在 GPCR 中进行非天然氨基酸的位点特异性基因整合
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（葡萄糖4.5 g/L，谷氨酰胺2 mM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养HEK293T细胞。</li>
	<li>当细胞在10 cm培养皿中生长至60–80%融合度时，使用Lipofectamine Plus试剂进行转染。
	<ol>
		<li>向750 μl DMEM中加入10 μl Plus试剂、3.5 μg含有目标位点琥珀终止密码子的GPCR cDNA（pMT4. Rho或pcDNA 3.1. CCR5）、3.5 μg抑制性tRNA cDNA（pSVB.Yam）以及0.35 μg针对对叠氮苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine）的突变型氨酰-tRNA合成酶cDNA（pcDNA.RS），室温孵育15分钟。同时使用不含琥珀终止密码子的野生型GPCR cDNA进行类似的转染作为对照。将该混合物加入含17 μl Lipofectamine的750 μl DMEM中，室温平衡15分钟后，加液至总体积为4 ml。</li>
		<li>吸除10 cm培养皿中的培养基，加入转染混合物，放回37 °C、5% CO2培养箱中继续培养。4–6小时后，补充4 ml含20% FBS和1 mM azF的DMEM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，更换为含10% FBS和0.5 mM azF的DMEM培养基。</li>
	<li>转染后48小时收集细胞，用于分析表达情况，或进行后续光交联或标记实验（见下文所述步骤）。
	<ol>
		<li>通过检测生长培养基中存在非天然氨基酸（UAA）时GPCR琥珀突变体的表达情况来确认其表达。我们采用Western免疫印迹法进行检测：将细胞沉淀在含1%（w/v）十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM NaCl缓冲液中，4 °C裂解1小时。裂解液于16,000 × g离心，上清在还原条件下进行SDS-PAGE电泳分离。转膜至PVDF膜后，使用1D4单克隆抗体（National Cell Culture Center）进行免疫印迹分析，以检测受体C末端工程化表位对应的全长受体表达。31</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用靶向光交联技术定位配体结合位点
<ol>
	<li>转染后48小时，吸去细胞培养液，加入4 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS），于37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>用1×PBS重悬细胞，转移至Falcon管中。以1,500 rpm离心2分钟使细胞沉淀，吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于含有20 mM HEPES（pH 7.5）、0.2% BSA及放射性标记配体的1×Hank's平衡盐溶液中，配体浓度为其受体结合饱和浓度，在所需时间和温度条件下孵育，以确保受体-配体复合物的形成。</li>
	<li>将细胞悬液转移至24孔板或96孔板，用于在365 nm条件下对azF进行光激活（例如 使用紫外A波段（UV-A）灯在4 °C下照射15分钟。将培养板保持在冰上，以避免样品受热和细胞裂解。</li>
	<li>将细胞转移至Eppendorf管中，离心沉淀细胞，弃去上清液，随后进行分析。沉淀物可于-20 °C保存，以备后续使用。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，缓冲液含1% (w/v) DDM、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）及蛋白酶抑制剂。4 °C孵育1小时后，于16,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新管中。</li>
	<li>将1D4单抗-Sepharose 2B树脂加入上清液中，4 °C孵育过夜，利用基因工程改造的C末端1D4单抗表位对GPCR进行免疫纯化。次日用裂解缓冲液洗涤树脂数次，随后加入1% SDS，37 °C振荡洗脱1小时。</li>
	<li>将部分洗脱液转移至含有闪烁液的15 ml小瓶中，使用β闪烁计数器进行计数，以定量测定氚标记配体与受体的特异性结合量。</li>
	<li>使用标准凝胶电泳分离剩余的1D4单抗纯化洗脱液。我们采用4-12%的SDS-PAGE凝胶，随后进行半干式转膜至PVDF膜，用于免疫印迹。同时设置一条标准蛋白ladder泳道，以直观估计分子量。
	<ol>
		<li>用含0.05% Tween-20的TBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭PVDF膜。使用1D4单克隆抗体探测膜以验证全长受体的表达，随后使用HRP标记的抗小鼠IgG二抗进行孵育。</li>
		<li>使用增强型化学发光（ECL）试剂处理，将膜暴露于X射线胶片以显影条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用剃刀将膜切割，分离每个样品泳道，随后根据特定的分子量标记物进行切割。将膜片段转移至含有闪烁液的小瓶中。使用β-闪烁计数器对每个膜片段中的氚含量进行定量检测。</li>
	<li>通过检测表观分子质量等于GPCR与配体分子质量之和处的氚信号，确定阳性光交联结果。</li>
</ol>
3. 靶向表位标记与细胞表面酶联免疫吸附测定（ELISA）
<ol>
	<li>转染后24小时，用1 ml 1× PBS洗涤细胞，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化3分钟。加入9 ml含10% FBS和0.5 mM azF的DMEM终止消化。重悬细胞并计数细胞密度。我们使用标准血细胞计数板进行计数。</li>
	<li>用100 μl浓度为0.01 mg/ml的多聚-D-赖氨酸预处理高结合力、透明底96孔板的每个孔。室温孵育30分钟，反复用1× PBS洗涤后自然晾干。</li>
	<li>将转染后的细胞以6 × 104 - 8 × 104 个细胞/孔的密度接种至96孔板中，每孔200 μl，然后置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>次日准备进行标记。用100 μl/孔的1× PBS轻柔洗涤三次，以去除含azF的培养基。确保细胞仍贴壁良好，例如可使用含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液。</li>
	<li>从以5–20 mM保存在PBS中的母液中，用1× HBSS/PBS配制50–200 μM的FLAG-三芳基膦标记试剂。每孔加入60 μl（每个琥珀突变体设三个重复），置于37 °C孵育30分钟至4小时。同时保留一组未加标记试剂的孔，仅加入1× HBSS/PBS作为空白对照。另设野生型GPCR对照组，用于与azF-GPCR变体进行比较。</li>
	<li>用100 μl/孔的封闭缓冲液BB（1× PBS，0.5% BSA）洗涤细胞三次，彻底去除未反应的标记物。</li>
	<li>向细胞中加入100 μl/孔的4%多聚甲醛（用1× PBS将16%母液稀释而成）。室温孵育20分钟，再用BB洗涤三次。</li>
	<li>按照标准细胞表面ELISA流程检测标记受体及受体表达水平。先在冰上与一抗孵育1.5小时，再于室温下与二抗孵育1小时。
	<ol>
		<li>加入100 μl抗-FLAG M2抗体（例如，用BB缓冲液按1:2,000稀释）以检测FLAG-三芳基膦标记试剂中的FLAG肽段表位。同时对未标记处理的孔进行检测，作为阴性对照。另取一组孔加入抗-CCR5 2D7抗体（我们使用1:500稀释）以测定野生型或azF-GPCR的细胞表面表达水平。</li>
		<li>用BB缓冲液洗涤细胞三次，每孔加入100 μl HRP偶联的抗小鼠IgG二抗（1:2,000稀释），室温孵育1小时。</li>
		<li>仔细用BB缓冲液洗涤细胞五次。每孔加入50 μl检测缓冲液：Amplex Red、20 mM H2O2、1× PBS（按1:10:90比例混合），室温孵育15分钟。使用荧光多孔板读板仪在λex=530 nm和λem=590 nm条件下采集光谱数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. GPCR 的生物正交荧光标记
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，用 1 ml 含 1% (w/v) DM、50 mM HEPES 或 Tris-HCl（pH 6.8）、100 mM NaCl、1 mM CaCl2 及蛋白酶抑制剂的溶解缓冲液裂解 107 个表达野生型或含 azF 的视紫红质变体的收获细胞，孵育 1 小时。将细胞裂解物在 15,000 × g 离心 10 分钟，收集上清组分。</li>
	<li>加入 100 μl 1D4-mAb Sepharose 2B 树脂，利用工程化 C 末端 1D4 表位捕获受体。4 °C 孵育 12 小时。用含 0.1% (w/v) DDM 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.3）洗涤树脂三次。</li>
	<li>在总体积为 0.3–0.5 ml 的溶液中加入 0.1 mM 荧光素膦试剂，用于标记固定在免疫亲和基质（1D4-mAb Sepharose 2B）上的受体。室温孵育 12 小时。离心并移除上清液。洗涤树脂以去除未反应的标记物。</li>
	<li>将树脂置于冰上，加入 100 ml 洗脱缓冲液（含 0.1% (w/v) DDM 和 0.33 mg/ml 九肽（C9 肽，针对 1D4 表位）的 2 mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.0），孵育 1 小时，洗脱标记的受体。</li>
	<li>在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离标记样品。用 PBS 短暂洗涤凝胶，然后通过凝胶内荧光检测 azF-GPCR 的标记情况。例如，使用配备 488 nm 波长激光的共聚焦荧光扫描仪检测与荧光素修饰的受体。</li>
</ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种将反应性探针azF特异性地插入G蛋白偶联受体（GPCRs）的稳健方法，并展示了该工具在研究GPCR结构与动态特性方面的三种重要应用。我们所采用的特异性插入非天然氨基酸（UAA）的方法，克服了另一种基于化学标记32, 33或向单一可及的半胱氨酸突变体添加光交联剂34策略的根本性问题。尽管已有针对半胱氨酸巯基的化学反应可用于连接荧光探针，但该策略要求构建无半胱氨酸的蛋白背景。这一要求具有局限性，因为所有GPCRs均含有多个半胱氨酸，其中许多可能对维持受体正常功能至关重要。因此，引入一种可进行化学修饰或能被紫外光激活的非天然氨基酸的策略极具吸引力。
光活化交联剂与靶分子之间的共价反应依赖于距离及邻近的侧链。因此，这类探针可用于鉴定与交联剂在特定距离范围内的相互作用；例如，基于二苯甲酮的交联剂据称其作用距离约为 3 Å。35 此前，我们已将对氟苯丙氨酸（azF）和苯甲酰基苯丙氨酸（BzF）——一种含有二苯甲酮反应基团的非天然氨基酸——应用于鉴定 G 蛋白偶联受体（GPCR）中与荧光素或氚标记配体在特定距离内的残...

七次跨膜G蛋白偶联受体（GPCRs）构成一个高度动态的膜蛋白超家族，可介导多种重要的胞外信号。在经典范式中，受体的激活与配体诱导的构象变化相偶联1, 2。近年来，GPCR结构生物学的进展为跨膜信号转导的分子机制提供了深入的认识3-5。然而，要以更高的化学精度理解GPCR信号转导的功能机制和结构动态，需要一套方法工具，以引入具有信息性的分子和化学探针，用于研究活性信号复合物。
为此，我们改进了一种方法，该方法基于非天然氨基酸（UAA）的琥珀密码子抑制技术，可将无干扰或最小干扰的探针位点特异性地引入表达的受体中，该技术早前由Schultz及其同事首创6。我们优化了UAA突变方法，以实现高效表达和突变系统，适用于如G蛋白偶联受体（GPCR）等在除哺乳动物细胞外的多数异源表达系统中难以表达的蛋白质。利用正交设计的抑制tRNA与进化获得的氨酰-tRNA合成酶配对，针对特定UAA，我们在表达的目标GPCR中实现了UAA的位点特异性插入。我们已在模型GPCR——视紫红质和人C-C趋化因子受体CCR5中，成功实现了对p-乙酰-L-苯丙氨酸（AcF）、p-苯甲酰-L-苯丙氨酸（BzF）和p-叠氮-L-苯丙氨酸（azF）等UAA的掺入7, 8。
理论上，非天然氨基酸（UAA）可在蛋白质序列的任意位置通过遗传编码引入，这一特性使其成为一种宝贵的生物化学工具，能够实现对目标G蛋白偶联受体（GPCR）的单密码子扫描。本文重点介绍一种具有反应性叠氮基团的非天然氨基酸——对-叠氮苯丙氨酸（azF）的多功能性。除了可作为独特的红外（IR）探针8, 9，azF还可作为光激活交联剂，与邻近的伯胺或脂肪族氢原子发生反应。此外，叠氮基团在生物体系中具有惰性，可在生物正交标记反应中作为选择性化学手柄。本文展示了将azF特异性地引入GPCR中的若干应用实例，例如通过靶向光交联捕获受体-配体复合物，以及利用生物正交表位标记和荧光标记策略对GPCR进行修饰。
自20世纪60年代以来，光活化试剂已被用于研究生物系统。10 在此期间，已有大量受体-配体交联实验被报道，用于研究G蛋白偶联受体（GPCR）复合物，其中大多数实验使用了光亲和配体。11, 12 然而，这些应用在技术上存在局限性，因为它们需要合成带有交联基团的配体。13-15 此外，由于配体中含有交联基团，难以确定交联位点在GPCR上的具体位置。利用琥珀密码子抑制技术将光交联基团作为非天然氨基酸（UAA）位点特异性地引入蛋白质，是一项重要的技术进步。16, 17 我们开发了一种光交联技术，通过将光敏基团引入GPCR，在活细胞中识别参与受体-配体复合物形成的受体结合界面。18, 19 本文描述了应用该靶向光交联技术识别小分子配体[³H]马拉维若（maraviroc）在CCR5上结合位点的实验方案及数据分析方法。该方法不仅能够精确量化配体上的放射性标记，同时保留了配体的天然化学结构。
基于荧光的技术可通过直接探测受体的构象状态，帮助精确理解受体激活的结构基础。20, 21 然而，能够灵活地将荧光标记特异性引入G蛋白偶联受体（GPCR）的技术仍有限。我们致力于采用生物正交化学修饰策略，以促进对GPCR信号复合物的单分子检测（SMD）。22 叠氮基团可参与多种生物正交化学反应，例如施陶丁格-贝托齐连接反应（Staudinger-Bertozzi ligation），23, 24 无铜应变促进的叠氮-炔环加成反应（SpAAC）25 以及铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）。26 本文重点介绍施陶丁格-贝托齐连接反应，该反应涉及叠氮与膦基之间的特异性反应。我们展示了两种不同膦基衍生物的应用，分别与肽表位（FLAG肽）或荧光标记物（荧光素）偶联，以实现对GPCR的位点特异性修饰。
我们先前利用X射线晶体结构和动力学模拟优化了视紫红质azF突变体位点特异性标记的条件，以选择溶剂暴露的靶位点27, 28。我们还展示了通过施陶丁格-贝尔托齐偶联实现无背景标记的可行性29。本文演示了对去垢剂溶解并固定于免疫亲和基质上的受体进行荧光标记的通用操作流程，并通过凝胶内荧光成像进行检测。此外，我们还展示了该标记策略的一项实用拓展，用于鉴定结构未知的受体CCR5中适合标记的位点。该方法采用基于细胞的半高通量格式，依赖于对azF-GPCR突变体进行生物正交修饰的靶向肽-表位标记策略30。该方法利用细胞表面ELISA的多步检测特性来监测标记过程。
本文讨论的方法具有通用性，原则上可应用于任何通过琥珀密码子抑制技术将azF掺入的G蛋白偶联受体（GPCR）。在本文提供的实验方案中，我们详细描述了利用非天然氨基酸突变技术，在哺乳动物细胞中表达掺入了azF等非天然氨基酸（UAA）的受体的步骤，以及后续促进GPCR结构与动态研究的应用方法。

<table><tbody><tr><td>质粒 pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., 2008)</td></tr><tr><td>质粒 pcDNA.RS 用于 azF</td><td></td><td></td><td>(Ye &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2009)</td></tr><tr><td>质粒 pMT4.Rho 和 pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>可选择性地在目标位置包含琥珀终止密码子（TAG）</td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td></td><td></td><td>贴壁细胞</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine: 18324-012&lt;br/&gt; Plus: 11514-015</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-叠氮-L-苯丙氨酸</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; GPCR 中非天然氨基酸位点特异性遗传掺入材料</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S 紫外-A 灯</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF 可被 365 nm 光激活</td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氚标记配体</td><td></td><td></td><td>来自合作者（Grunbeck &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012)</td></tr><tr><td>1% (w/v) 正十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-琼脂糖树脂</td><td></td><td></td><td>1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上</td></tr><tr><td>1% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 装置</td><td>Biorad</td><td></td><td>用于半干转印的装置</td></tr><tr><td>Immobilon 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>闪烁液</td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta 液体闪烁计数器</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>β-闪烁计数器</td></tr><tr><td>抗视紫红质 1D4 单克隆抗体</td><td>National Cell Culture Center</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗小鼠 IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR 膜</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 靶向光交联材料</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FLAG-三芳基膦</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAG 单克隆抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CCR5 2D7 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>透明底，高结合 EIA/RIA 板</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（含钙、镁）</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HRP 偶联的</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗兔 IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CytoFluor II 荧光多孔板读板仪</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 3.&lt;/strong&gt; 靶向肽-表位标记及细胞表面 ELISA 材料</td></tr><tr><td>荧光素-膦</td><td></td><td></td><td>(Huber &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012 年投稿)</td></tr><tr><td>九肽（C9 肽）</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>模拟 1D4 表位的肽段 NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (w/v) 正十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-琼脂糖树脂</td><td></td><td></td><td>1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE</td></tr><tr><td>共聚焦 Typhoon 9400 荧光扫描仪</td><td>GE Healthcare</td><td>已停产</td><td>配备 488 nm 波长激光的扫描仪</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 4. &lt;/strong&gt; 荧光标记材料</td></tr></tbody></table>

基因编码的分子探针用于研究g蛋白偶联受体

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

为了促进对G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构与动态研究，需要开发新的方法，将具有信息指示作用的探针或标记物引入表达的受体中，同时不干扰受体功能。我们利用琥珀密码子抑制技术，在哺乳动物细胞中外源表达的GPCR中，将非天然氨基酸 p-叠氮基-L-苯丙氨酸（azF）遗传编码至多个特定位点。本文展示了叠氮基团在不同应用中的多功能性，可用于在天然细胞环境或去垢剂溶解条件下研究GPCR。首先，我们展示了一种基于细胞的靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中与氚标记的小分子配体发生交联的残基，该交联发生在遗传编码的叠氮基氨基酸位点。接着，我们展示了利用靶向叠氮基团的生物正交Staudinger-Bertozzi连接反应，实现对GPCR的位点特异性修饰，该反应使用膦衍生物作为反应试剂。我们讨论了一种通用策略，用于在培养条件下对表达的膜蛋白进行靶向肽-表位标记，并通过基于全细胞的ELISA方法进行检测。最后，我们证明azF-GPCR可被选择性地标记荧光探针。文中讨论的方法具有普适性，原则上可应用于任何表达的GPCR中的任意氨基酸位点，以研究其活性信号复合物。

我们采用非天然氨基酸突变技术，利用琥珀密码子抑制技术，将分子探针位点特异性地引入G蛋白偶联受体（GPCR）中。该方案如图所示 图1 概述了该方法学的关键步骤以及引入多功能非天然氨基酸（UAA）的各种应用 p-将叠氮-L-苯丙氨酸（azF）引入G蛋白偶联受体（GPCRs）。在哺乳动物细胞中表达含azF的GPCRs，可实现对配体的靶向光交联，以及对GPCR进行靶向肽表位标记或荧光修饰 通过 生物正交标记化学反应
光交联技术可用于研究活细胞中G蛋白偶联受体（GPCR）与配体复合物的结构特征（图1a）。此类实验获得的代表性数据如图2所示。19 在本研究中，我们使用放射性标记的小分子配体——氚标记马拉维若克（tritiated maraviroc），以确定其在CCR5上的结合位点。在此示例中，对预先孵育了氚标记马拉维若克的azF-CCR5突变体细胞进行紫外照射，可形成共价交联的复合物，并可通过配体上的高灵敏度放射性标签进行检测。在测试...

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

为了促进对G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构与动态研究，需要开发新方法以引入……

以下实验的总体目标是将单个信息性探针引入靶向G蛋白偶联受体中，以促进对信号复合物的结构和动态研究。该目标通过将含有表达所需翻译系统组分的质粒转入细胞来实现，该翻译系统可将非天然氨基酸zeto苯丙氨酸（zeto phenylalanine）或zeto fee插入表达的GPCR中。随后，可通过三种不同方式应用含zeto fee变异的GPCR，以研究该受体的结构与功能。首先，zeto fee 作为光激活交联剂用于 GPCR 中，从而能够鉴定氚标记配体的结合位点。接着，zeto fee 可作为反应性化学手柄，通过生物正交标记化学方法将肽偶联物或荧光探针连接到 GPCR 上，所得结果表明，分子探针 zeto fee 可基于活细胞和生物化学方法，应用于 GPCR 的靶向光交联、靶向表位标记以及荧光标记。该技术相较于现有方法（如光亲和配体或半胱氨酸标记）的主要优势在于，能够在目标受体的已知位置特异性地引入一种生物学惰性且具有反应活性的非天然氨基酸——对-叠氮苯基丙氨酸（p-azido phenylalanine），具有更高的灵活性。该方法有助于解答G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导领域中的关键问题，包括在天然膜环境中绘制受体-配体（LIG）复合物的相互作用位点，以及通过鉴定A-G-P-C-R中适合生物正交标记的位点，推动单分子荧光研究。第三，该方法可揭示G蛋白偶联受体的分子作用机制，并且还可应用于其他系统，例如多种细胞膜蛋白。在开始本实验之前，将HEC 293T细胞培养于添加了10%胎牛血清的Knockout DMEM培养基中，于37°C、5% CO2的培养箱中维持培养。在10厘米培养皿中，当细胞融合度达到60%至80%时，按照文中实验方案，使用Lipofectamine Plus试剂将G pcr、r CD和NA转染至细胞中。转染后次日，将生长培养基更换为含10% FBS和0.5 mmol/L fee的DMEM培养基。转染48小时后，按照文中所述方法分析表达情况。按照本视频后续所述，进行拍照、交联或标记操作。转染后48小时，吸去细胞培养基，加入4毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS），于37°C孵育15分钟，使细胞从培养板上脱落。随后用1×PBS重悬细胞，并转移至Falcon管中，在1500 RPM条件下离心2分钟。离心收集细胞后，吸除上清液，再将细胞沉淀重悬于含有氚标记配体的1×Hanks平衡盐溶液中，配体浓度为饱和结合浓度，其配制方法见文本方案。将细胞沉淀在37°C孵育所需时间，以确保受体-配体复合物的形成，具体孵育时间取决于特定的受体和配体。随后，将细胞悬液转移至24孔板或96孔板中。然后在4摄氏度条件下，将微孔板置于冰上以避免样品受热和细胞裂解，使用波长为365纳米的紫外灯照射15分钟，对zeto fee进行光活化。光活化完成后，将细胞转移至einor管中，离心以沉淀细胞。弃去上清液，随后进行分析。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，在4°C条件下孵育1小时。然后在16,000 × g离心10分钟。在将上清液转移至新管之前，向上清液中加入1D4单克隆抗体修饰的SROs 2B树脂，在4°C条件下过夜孵育，利用基因工程改造的C末端1D4单克隆抗体表位对GPCR进行免疫纯化。次日，用裂解缓冲液多次洗涤磁珠，随后在37°C、振荡条件下用1% SDS洗脱样品，孵育1小时。取部分EENT转移至含有闪烁液的15毫升小瓶中，使用β闪烁计数器进行计数，以量化氚标记配体与受体的特异性结合量。将剩余的纯化EENT采用4%至12% SDS凝胶进行标准凝胶电泳分离，并以标准蛋白质ladder作为参照。随后通过半干转法将蛋白转移至PVDF膜，用于免疫印迹分析。用含 0.05% Tween 20 的 TBS 缓冲液配制 5% 脱脂奶粉封闭 PVDF 膜。使用 1D four 单克隆抗体探测膜以确认全长受体的表达，随后加入 HRP 标记的抗-US IgG 二抗。然后用增强型化学发光试剂处理膜。将膜暴露于放射自显影胶片以显示条带。随后，用剃刀片切割膜，分离每个样品泳道，并在特定的分子量标记处进行切割。将膜片段转移至含有闪烁液的小瓶中，然后使用β闪烁计数器对每个膜片段中的氚含量进行定量。通过检测到氚标记信号出现在表观分子质量等于GPCR与配体分子质量之和的位置，确定为阳性光交联结果。洗涤并计数细胞后，用每孔100微升、每毫升10微克的多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）预处理一块96孔高吸附透明底板，室温孵育30分钟。然后用一倍体积的磷酸盐缓冲液（XPBS）反复洗涤，之后将转染的细胞以每孔60,000至80,000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为200微升，并在37摄氏度、5% CO2的培养箱中继续培养。次日。准备细胞以进行标记。使用1× PBS轻柔洗涤细胞，每孔100微升，共洗涤三次，以去除含有生长因子的培养基。按照文本方案所述，配制含有50至200微摩尔浓度FLAG TriAAL PHOSPHINE标记试剂的缓冲液。每孔加入60微升。保留一组未进行标记处理且不含缓冲液的孔。同时包括野生型GPCR对照，以便与零饲料GPCR变异体进行比较。孵育后，将培养板放回 37 摄氏度，孵育时间介于 30 分钟至 4 小时之间。用封闭缓冲液每孔 100 微升洗涤细胞三次，以彻底去除未反应的标记物。接着，在室温下孵育 20 分钟后，每孔加入 100 微升 4% 多聚甲醛溶液处理细胞。用封闭缓冲液洗涤细胞三次。采用标准的细胞表面EISA实验方案检测标记受体及受体表达：首先在冰上与一抗孵育1.5小时，随后在室温下与二抗孵育一小时。接下来，加入 100 µL 稀释后的 Anti-Flag M2 抗体，以检测 Flag-Tri AAL 磷化标记试剂的 Flag 肽表位。同时，将未经标记处理的孔作为阴性对照进行检测。然后向不同孔中加入稀释后的抗CCR5 2D7抗体，以分别检测野生型或Zeto F的GPCR细胞表面表达。用封闭缓冲液洗涤细胞3次，随后加入100 µL稀释的HRP标记的抗小鼠IgG抗体，进行孵育。用封闭缓冲液将细胞仔细洗涤五次后，加入 50 µL 检测缓冲液，在室温下孵育 15 分钟。最后，在荧光多孔板读板仪上采集光谱数据，激发波长为 530 nm，发射波长为 590 nm。开始标记程序时，裂解 1000 万表达野生型或 zeto fee 的收获细胞。在4°C下，将视杆细胞视紫红质在1毫升溶解缓冲液中孵育1小时。将细胞裂解液在15,000 × g条件下离心10分钟，收集上清组分。然后加入100 µL经1D4单克隆抗体修饰的Spheroas Two B树脂，利用工程化C末端1D4表位捕获受体。在4摄氏度孵育12小时后，按照文本方案所述方法洗涤树脂三次。接下来，通过加入0.1毫摩尔的荧光素膦试剂至终体积0.3至0.5毫升，对固定在免疫亲和基质上的受体进行标记，在室温下孵育12小时，随后离心并弃去上清液。洗涤树脂以去除未反应的标记物，然后用100微升Elian缓冲液在冰上孵育1小时，洗脱标记的受体。在还原条件下通过SDS-PAGE分离标记的样品。在使用共聚焦荧光扫描仪以488纳米波长激光检测经荧光素修饰的GPCR之前，用PBS短暂洗涤凝胶。利用非天然氨基酸突变技术，通过琥珀密码子抑制技术，特异性地在A-G-P-C-R的C位点引入分子探针。随后可采用光交联技术，在活细胞中研究G蛋白偶联受体（GPCR）配体复合物的结构特征，所用小分子配体为放射性标记的氚化配体。Ravi Rock用于鉴定其在G-P-C-R-C-C-R五号上的结合位点。在此示例中，对表达 zeto fee 的细胞进行紫外线照射。CCR5 变体与氚标记的 Ravi 在孵育前经 Rock 处理，可形成共价交联的复合物，这些复合物可通过配体上的敏感放射性标签进行鉴定。在测试的CCR5多个位点中，亮氨酸28位和色氨酸86位的叠氮基团能够与氚标记的Ravi Rock发生光交联，表现为显著更高的闪烁计数。野生型受体未显示出与放射性配体的交联。生物正交标记化学可用于在C位点特异性修饰叠氮基团。GPCR 变异的一种策略涉及在活细胞中使用与肽标签偶联的标记物——Flag 肽，对 A-G-P-C-R 进行靶向表位标记。三芳基膦标记试剂用于特异性且选择性地修饰叠氮基团。此处展示的 CCR5 变异数据，代表了一种灵敏的多步 ELISA 检测策略的结果，该策略用于鉴定被 Flag 肽标记的位点。在所研究的CCR5位点中，所有zeto突变体均进行了检测。CCR5变异体在细胞表面均有表达，其中约一半成功实现了靶向表位标记；野生型CCR5作为表位标记的阴性对照，因其缺乏抗Flag信号而得以确认。在另一种策略中，将去污剂溶解的zeto突变型G蛋白偶联受体（GPCR）固定于免疫亲和基质上（例如与Spherosyl 2B树脂偶联的抗1D4单克隆抗体），随后用荧光素四（fluoro4）偶联标记物进行标记。Ingel 荧光图像显示，在三个不同位置成功实现了对 GPCR 视蛋白的荧光标记，结果符合预期，野生型视蛋白未显示背景标记，表现为受体预期分子量处无荧光条带。在进行该实验操作时，需注意在发育完成后，使用一组特异性的引入酸 AOL 丙氨酸确认目标 GPCR 在整个晶状体中的完全表达。该技术将为受体生物学领域的研究人员探索任意受体-配体复合物或标记靶向受体提供新途径。通过在特定位点引入非天然氨基酸——对叠氮苯丙氨酸——作为反应性探针。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用非天然氨基酸插入技术，将分子探针引入A-G-P-C-R，从而借助靶向光交联和生物正交标记技术，促进对GPCR信号复合物的结构与动态研究。

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基因编码的分子探针来研究G蛋白偶联受体

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