Name: 修正了福尔马林蛋白质组学样品的制备和石蜡包埋组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习福尔马林固定石蜡包埋组织的蛋白质组学样品制备技术，通过激光显微切割和FASP方法实现高回收率肽段提取。该流程支持从微量临床样本中鉴定多达10,000种蛋白质，适用于疾病生物标志物发现研究。

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作者感谢 Matthias Mann 博士的持续支持，以及 Katharina Zettl 女士对本方法的示范。
本工作由马克斯-普朗克科学促进学会资助。

1. 所需仪器
<ol>
	<li>显微切割和样品裂解用组织切片的制备
	<ol>
		<li>将恒温块设置为 99 °C 或使用沸水浴。</li>
		<li>激光显微切割系统（例如 PALM，Zeiss，Göttingen，德国）。</li>
		<li>恒温台式离心机，温度设定为 20 °C。</li>
		<li>带有 Eppendorf 管架的湿盒（容器）。</li>
		<li>设定为 37 °C 的培养箱。</li>
		<li>荧光分光光度计，可使用微量石英比色皿（0.1–0.2 ml）检测近紫外光激发的荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶液
<ol>
	<li>组织裂解缓冲液（TLB）：含 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 M DTT、0.5%（w/v）聚乙二醇 20,000 和 4% SDS。</li>
	<li>UA溶液：8 M 尿素溶于0.1 M Tris-HCl（pH 8.5）。每份样品准备1 ml。UA溶液和IAA溶液需新鲜配制，并在一天内使用完毕。</li>
	<li>IAA 溶液：UA 中含 0.05 M 碘乙酰胺。每份样品准备 0.1 ml。</li>
	<li>内切蛋白酶 Lys-C，贮存液。</li>
	<li>胰蛋白酶，贮存液</li>
	<li>消化缓冲液（DB）：0.05 M Tris-HCl，pH 8.5。每份样品准备0.25 ml。</li>
	<li>色氨酸标准溶液 0.1 μg 1 ml 去离子水中溶解色氨酸。</li>
	<li>“Assay buffer B”（ABB）：10 mM Tris-HCl，pH 7.6。</li>
	<li>Britton 储备液 &amp; Robinson通用缓冲液（BRUB）。配制含有0.1 M CH3COOH，0.1 M H3PO4，以及 0.1 M H3BO3 用1 M NaOH调节至所需pH值（2、4、5、6和11）。使用前用去离子水稀释5倍。</li>
	<li>缓冲液A：1%（v/v）CH3COOH溶于去离子水。</li>
	<li>缓冲液B：60%（v/v）CH3CN，去离子水中含1%（v/v）CH3COOH。</li>
</ol>
3. 移液枪吸头和“StageTip”柱
<ol>
	<li>通过在普通0.2 ml移液器吸头中堆叠6层Empore-阴离子交换膜来制备SAX尖端柱。每个样品制备两个SAX尖端柱。</li>
	<li>通过在0.2 ml移液器吸头中堆叠3层Empore-C18来制备“StageTip”。每个样品制备6个StageTip。</li>
</ol>
4. 显微切割与样本裂解用组织切片的制备
<ol>
	<li>使用切片机切片（切片厚度取决于样本，通常7-10 μm的切片适用于显微切割）。</li>
	<li>将膜片（MembraneSlide 1.0 PEN）用紫外光照射45分钟。</li>
	<li>将切片贴附于经照射处理的膜片上，并在37 °C下干燥2小时。</li>
	<li>通过在二甲苯中连续孵育2.5分钟和1.5分钟进行脱蜡处理。随后依次在无水乙醇、70%乙醇和水中孵育各1分钟，以完成再水化。</li>
	<li>用Mayer苏木精染色切片20秒，流水冲洗1分钟，然后自然干燥。</li>
	<li>使用激光捕获显微切割系统收集目标细胞群体。若使用PALM仪器（Zeiss），应将样本收集至粘附帽（Adhesive CAP 200）中。</li>
	<li>将一定量的TLB缓冲液加入帽中的显微切割材料上方。盖紧管盖，短暂离心收集溶液。在加热块中于99 °C、振荡（600 rpm）条件下裂解显微切割组织1小时。每10 nl显微切割组织使用3 μl缓冲液。</li>
	<li>将粗提物在18 °C下以16,000 × g离心10分钟以澄清。裂解液可于-20 °C冷冻保存。</li>
</ol>
5. 样品处理
<ol>
	<li>在超滤装置（Forensic 30k）中，将最多50 μl澄清裂解液与200 μl UA混合，于14,000 × g离心，直至滤膜上残留液体少于10 μl。此步骤通常需要离心10–15分钟。</li>
	<li>向超滤装置中加入200 μl UA，按步骤5.1进行离心。弃去收集管中的滤液。</li>
	<li>加入50 μl IAA溶液，于恒温混匀仪中以600 rpm混匀1分钟，然后按步骤5.1进行离心。</li>
	<li>向超滤装置中加入100 μl UA，按步骤5.1进行离心。重复此步骤两次。</li>
	<li>向超滤装置中加入100 μl DB，按步骤5.1进行离心。重复此步骤两次。</li>
	<li>将超滤装置转移至新的收集管中。加入含内切蛋白酶Lys-C的40 μl DB（蛋白酶与总蛋白比例为1:100），于恒温混匀仪中以600 rpm混匀1分钟。将装置置于湿润环境中，37 °C孵育18小时。</li>
	<li>按步骤5.1的条件对滤膜装置进行14,000 × g离心。</li>
	<li>加入160 μl去离子水，按步骤5.1对滤膜装置进行离心。合并步骤5.7和5.8的穿滤液，其中含有内切蛋白酶Lys-C释放的肽段。</li>
	<li>将超滤装置转移至新的收集管中。加入含胰蛋白酶的40 μl DB（酶与蛋白比例为1:100），于恒温混匀仪中以600 rpm混匀1分钟。将装置置于湿润环境中，37 °C孵育4小时。重复步骤5.7和5.8，以收集胰蛋白酶消化产生的肽段。</li>
</ol>
6. 肽的定量
<ol>
	<li>由于色氨酸残基易于接触溶剂，因此可在稀释的缓冲液中测定蛋白质消化产物中的肽含量。</li>
	<li>用移液器将 0.2 ml ABB 加入石英比色皿中，记录“空白”样品的发射光谱。</li>
	<li>通过向比色皿中逐次加入 1 μl TSS 溶液（每次增加 0.1 μg），并轻轻混匀 ABB，制备标准曲线。</li>
	<li>清洗比色皿。</li>
	<li>加入待测样品并记录其光谱（样品）。</li>
	<li>蛋白质和肽浓度的计算 
	由于 0.1 μg 色氨酸约相当于 9 μg 蛋白质（基于裂解人源细胞所得蛋白质混合物中平均含 1.1% 色氨酸），因此样品中的蛋白质含量或消化产物中的肽含量可由下式得出： 
	<img alt="肽定量方程（μg），实验数据分析公式，实验室计算。" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"> 
	其中 F(Standard1) 为 0.1 μg 色氨酸标准品的荧光值。肽含量可用于计算消化步骤的产率，并为后续的肽段分级分离和质谱分析提供关键信息。</li>
</ol>
7. Lys-C 和胰蛋白酶肽段的分级分离
<ol>
	<li>分别用 0.2 ml pH 11 和 pH 5 的 BRUB 稀释通过 Lys-C 和胰蛋白酶消化获得的肽溶液。</li>
	<li>在离心管适配器盖中组装 SAX 小柱。</li>
	<li>依次用 0.1 ml 甲醇、0.1 ml 1 M NaOH 以及 3 次 0.1 ml BRUB（pH 11 用于 Lys-C 肽的分离，pH 5 用于胰蛋白酶肽的分离）洗涤并平衡 SAX 小柱。通过在 4,000 × g 条件下离心促进溶液流经柱材料。</li>
	<li>随后用 0.05 ml 甲醇、0.05 ml 缓冲液 B 和 0.05 ml 缓冲液 A 洗涤并平衡 C18-'StageTips'。准备六个 C18-'StageTips'，其中四个用于 Lys-C 肽的分离，两个用于胰蛋白酶肽的分离。</li>
	<li>将 SAX 小柱组装到 C18-'StageTip' 中。将样品溶液加载至已平衡的 SAX 小柱中，并在 5,000 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>分别用 0.1 ml BRUB（pH 11 或 pH 5）对“移液小柱”进行平衡，对应 Lys-C 和胰蛋白酶样品。通过在 5,000 × g 条件下离心促进液体流动。</li>
	<li>将 SAX 小柱转移至下一个 C18-'StageTip'。</li>
	<li>继续用 BRUB pH 6、pH 4 和 pH 2 对 Lys-C 样品进行肽的洗脱，用 BRUB pH 2 对胰蛋白酶肽样品进行洗脱。每个洗脱步骤使用单独的 C18-'StageTip'。</li>
	<li>用 0.05 ml 缓冲液 A 洗涤 C18-'StageTips'。</li>
	<li>用 0.05 ml 缓冲液 B 将各组分洗脱至小瓶中，随后可直接用于进样至配备质谱仪的液相色谱系统。</li>
</ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
<li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549(2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li>
<li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li>
<li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome%2C+phosphoproteome%2C+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611(2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用蛋白质组学技术对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料进行深度分析，其深度可与核酸测序和微阵列技术相媲美，这为生物标志物和药物靶点的发现开辟了新的前景。本方案描述的方法能够在约10,000种蛋白质的规模上，对显微切割获得的细胞群体的蛋白质组进行表征和定量。当使用较少的显微切割材料时，虽只能获得较小的数据集，但在许多情况下仍可能提供有价值的临床信息。因此，样品可在完成MED-FASP步骤后直接进行分析，也可选择减少分级分离的级数。由于FASP步骤适用于任何类型的蛋白酶，因此可用于蛋白质消化的酶不仅限于某一种，也可使用其他酶或多种酶的组合6。
FFPE 材料的质量似乎是分析中最关键的问题。我们发现，来源相同但来自不同诊所的固定组织具有不同的特性。使用某一来源的组织时，我们能够高效地获得大量肽段，而另一诊所提供的相似材料则几乎无法使用。这很可能是因为所采用的固定和包埋程序以及储存条件是影响临床材料特性的主要因素12。因此，在启动较大规模项目之前，建议先测试少量样本的特性。
过去已有大量文献报道了对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料的应用。然而，这些研究中鉴定出的蛋白质数量从未超过 1,000–2,000 种4。考虑到人类细胞特异性蛋白质组包含超过 10,000 种蛋白质，此类研究仅能提供极为浅显的图景，几乎局限于参与看家功能的高丰度蛋白质。我们的方案能够高效地从保存组织中分离临床或生物学材料，并针对裂解、蛋白质处理和肽段预分级进行了优化。因此，当本样品制备流程与高端质谱技术联用时，可实现对近乎完整蛋白质组的深入解析。值得注意的是，该方法在样品用量极低的条件下即可实现这一目标。
使用保存组织的主要优势在于其相对广泛的可获得性。许多福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本已被存档数年甚至数十年，有时曾被认为无用，但现在得益于蛋白质组学技术，这些样本已成为临床研究中极具价值的材料。尽管许多疾病可通过新鲜或冷冻组织进行研究，但对FFPE样本的研究在罕见病领域显得尤为重要12，因为收集一组具有代表性的样本通常需要很长时间。

使用多聚甲醛固定并包埋于石蜡中（FFPE）是临床组织材料保存及病理形态学研究的标准方法。对保存的组织进行显微镜观察，可识别与疾病相关的形态学改变，并检测和评分疾病相关抗原的出现情况。由于在这些分析中通常仅使用FFPE样本的一小部分，大量临床材料得以存档保留，可用于其他类型的研究。
在最近十年中，强大的蛋白质组学技术推动了生命科学领域的研究进展。该技术能够对复杂蛋白质混合物中的数千种蛋白质进行鉴定和定量分析。该技术的一个重要特点是，仅需极微量的样品即可完成大规模分析。近期的蛋白质组学研究表明，蛋白质的研究可达到接近全蛋白质组的规模1, 2。此类研究能够系统性地揭示细胞的组成，并识别在疾病状态下异常表达的蛋白质群。尽管这些研究曾需要大量的质谱分析能力，但近期的工作已证明，在单日测量中即可实现同等程度的蛋白质鉴定3。
相对较低的样本用量需求以及大量保存的临床样本资源，促使我们及其他研究者致力于开发能够对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料进行蛋白质组学研究的方法（相关综述见4）。我们利用福尔马林固定的可逆性，在加热处理条件下开发出一种可从固定组织中定量提取蛋白质的实验方案5。我们已证实，固定过程不仅保存了蛋白质，还至少保留了部分翻译后修饰。磷酸化和N-糖基化可通过FFPE样本进行研究5，但前提是必须严格控制组织采集、储存及固定条件。随后，我们优化了固定组织的激光捕获显微切割方法，并结合基于蛋白质组反应器的样本处理技术6, 7。一项针对结直肠癌的大规模研究实现了从临床材料显微切割样本中对7,500种蛋白质的定量分析8。最后，我们通过采用连续两步蛋白消化方案，进一步提升了对显微切割样本的分析深度9。与常规使用单一酶消化的策略相比，该方法可产生更多序列唯一的肽段，从而显著提高蛋白质鉴定的深度。对显微切割的人结肠腺瘤样本进行分析，实现了每样本高达9,500种蛋白质的蛋白质组学检测深度3。在本研究中，我们每样本鉴定了55,000个肽段，使88–89%的蛋白质至少被两个肽段所支持。本文中，我们提供了一种优化后的从FFPE材料制备样本用于LC-MS/MS分析的实验方案。该方案包括组织切片的显微切割前处理、分离细胞的裂解，以及以反应器形式（FASP）进行样本处理6。随后，我们描述了肽段得率的荧光分光光度测定方法；该步骤对质谱检测中肽段的最优鉴定具有重要意义。最后，我们展示了一种基于强阴离子交换（SAX）的肽段分级分离技术。该方法中，肽段分离和最终纯化均采用移液枪头式微柱进行10, 11。此步骤为可选，但在单一样本可获得数微克以上肽段的研究中强烈推荐使用。SAX分级可显著增加鉴定数量和动态范围，并扩展蛋白质序列覆盖度3, 10。

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>卡尔·蔡司显微技术有限公司，德国哥廷根</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>不透明胶盖 200</td><td>卡尔·蔡司显微技术有限公司，德国哥廷根</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>梅氏苏木精溶液</td><td>西格玛奥德里奇，美国圣路易斯</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k</td><td>默克密理博，德国达姆施塔特</td><td>MRCF0R030</td><td>（曾以 Microcon YM-30 名义销售）</td></tr><tr><td>Empore 阴离子交换膜</td><td>生物分析技术 3M 公司，美国圣保罗</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>生物分析技术 3M 公司，美国圣保罗</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>普洛麦格</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>内肽酶 Lys-C</td><td>和光</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

福尔马林固定及石蜡包埋组织的蛋白质组学样品制备

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

保存的临床样本是研究人类疾病蛋白质组学的独特资源。本文介绍了一种经过优化的方案，可对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行大规模定量分析。该流程包括四个独立步骤：第一步是从FFPE样本制备切片，并对目标细胞进行显微切割；第二步是裂解分离得到的细胞，并采用“滤膜辅助样品制备”（FASP）技术进行处理。在此步骤中，通过滤膜去除样品裂解过程中使用的试剂，蛋白质随后分两步依次使用内切蛋白酶LysC和胰蛋白酶进行消化。
每次消化后，将肽段分别收集到不同的组分中，并使用高灵敏度的荧光检测方法测定其含量。最后，通过“移液枪头”微柱对肽段进行分级分离。LysC肽段被分为4个组分，而胰蛋白酶消化的肽段则被分为2个组分。通过该方法制备的样品，能够实现对极微量样品的蛋白质组进行深度达10,000种蛋白质的分析。因此，该工作流程是一种用于系统性研究疾病以及发现潜在生物标志物和药物靶点的强大技术。

对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行蛋白质组学分析需要稳健且可重复的样品制备方法。本文介绍了一种实验方案，可实现从固定组织中有效分离特定细胞群体，并通过化学处理获得高纯度的肽段组分，这些肽段可直接用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。该流程包括四个独立步骤：（1）FFPE样本切片及其显微切割，（2）样本裂解及采用MED FASP方法进行蛋白质处理，（3）肽段定量，以及（4）肽段分级分离（图1）。
在该操作流程的第一步中，使用切片机将FFPE样品切成切片，并置于带有膜的载玻片上。为了增强组织切片与载玻片膜表面之间的黏附性，需要用紫外光照射载玻片表面。为此，我们使用集成在细胞培养操作台中的紫外灯发出的光线。此步骤完成后，载玻片需经过一系列洗涤，以去除石蜡并使样品重新水化。重新水化后的组织材料用苏木精短时间染色。这会使样品呈现弱染色，但足以用于显微切割区域的观察。染色过程必须通过大量水冲洗迅速终止，若染色时间过长，会导致肽段得率降低。
下一步，将干燥的切片进行显微切割。组织区域的选择取决于单个细胞的类型以及具体的研究目的，通常需要具备组织学或病理形态学方面的专业知识。激光切割释放的材料被收集在样本收集管的黏附表面上。由于黏附材料的结合能力有限，因此在每切割约 3-5 mm2 的样本后，必须将显微切割所得材料从管盖转移至管体中。此步骤可通过在管盖上加入数微升组织裂解缓冲液（LTB），并在离心机中短暂离心实现。待样本完全沉降至管底后，可继续在管盖上进行后续的显微切割和样本收集。当全部样本收集完成后，需用封口膜进一步密封管口，并将管子置于约 99 °C 的水浴中，在持续振荡条件下孵育 1 小时。由于孵育过程中水分会在管盖上冷凝，因此每隔 15 分钟需短暂离心一次，以将冷凝液重新收集至管底。
为了获得肽段，组织裂解物采用 MED-FASP 方法进行处理。该方法中，裂解后的蛋白质首先去除去垢剂及其他小分子量物质，随后在半胱氨酸残基上进行羧甲基化修饰，然后依次使用两种具有不同切割特异性的蛋白酶——内切蛋白酶 LysC 和胰蛋白酶进行消化。每次消化后，肽段被分别收集到不同的组分中。在样品制备的这一阶段，每次离心步骤均需持续进行，直至滤过装置中初始加入的溶液有超过 95% 已透过膜。在分析结肠组织及其癌症样本时，我们观察到该流程每 100 nl（100 μg 组织或 10 μm 切片的 10 mm2）显微切割材料可产生 3–6 μg 肽段（表 1）。由于组织中可提取的总蛋白量约为组织重量的 10%，因此提取与消化过程的总得率相对于原始新鲜组织为 30–60%。这些数值反映了蛋白质在脱水、染色、显微切割以及未完全消化样品在超滤装置中滞留等步骤中的损失。由于非显微切割的 FFPE 组织提取与处理所获得的蛋白-肽段转化得率为 75%5，因此推测关键的样品损失主要发生在 MED-FASP 之前的步骤。通过该方法获得的肽段混合物的一个重要特征是其高纯度，这有利于后续的肽段分级分离及质谱鉴定。最近对结直肠腺瘤样本的分析已证实了这一点3。在该研究中，约 40% 的 MS/MS 事件成功鉴定了来自 FFPE 组织的肽段，单次 LC-MS/MS 运行可实现多达 17,000 个肽段的鉴定。更高的鉴定率仅在冷冻的 in vitro 培养细胞分析中实现3。
在完整实验流程的最后两个步骤中，使用移液枪头微柱对分离的肽段进行定量和分级。由于从显微切割组织中分离出的肽段含量低于10 μg，因此无法使用常见的染料法蛋白质检测方法进行定量。此外，由于光散射效应，在此浓度下进行A280 紫外光谱测量也无法获得可靠结果。相比之下，色氨酸残基的荧光测定为肽段含量的确定提供了一种可靠的方法。
最近，我们已证明在培养细胞中，可在一次“单针”4小时LC-MS/MS分析中鉴定出多达5,000种蛋白质7。然而，此类分析应用于天然组织时，通常鉴定出的蛋白质数量很少超过3,000种。为了提高分析深度，MED FASP中生成的肽段必须在LC-MS/MS分析前进行预分级。基于强阴离子交换（SAX）的微柱分离是一种简单且高效的分级方法10。该方法已应用于多项蛋白质组学研究中，包括对固定组织的分析5, 8, 9。SAX“移液枪头”微柱以及C18“StageTip”脱盐柱9均易于制备。这些微柱通过将SAX或C18膜切割成的小塞堆叠于200 μl移液枪头中组装而成11。SAX分级的FFPE样本分析示例见表1。
<img alt="样本显微切割、MED-FASP处理、肽浓度测定、SAX分级示意图。" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程概览。该实验流程包括四个独立步骤：（1）FFPE样本切片及其显微切割，（2）样本裂解及采用MED FASP方法进行蛋白质处理，（3）肽段定量，以及（4）肽段分级。
<table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1.4in">样品</td>
			<td fo:width="1in">样品预分离/消化</td>
			<td fo:width="1in">使用的质谱仪</td>
			<td fo:width="1.25in">肽段得率（ng/nL 样品，±SD）</td>
			<td fo:width="1.25in">单个样品中唯一蛋白质鉴定数</td>
			<td fo:width=".75in">参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			•腺癌 
			•正常结肠黏膜
			</td>
			<td>SAX/一种酶</td>
			<td>Orbitrap -Velos</td>
			<td>36±11 (n = 8) 
			30±8 (n = 8)</td>
			<td>5,985±54 
			5,868±110</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>•结肠腺瘤</td>
			<td>SAX/两种酶</td>
			<td>Q Exactive</td>
			<td>56±6.1 (n = 3)</td>
			<td>9,501±28</td>
			<td>3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 福尔马林固定石蜡包埋组织显微切割样品蛋白质组学分析的代表性结果。

存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本是疾病研究的宝贵材料。本文展示了一种样本制备流程，可实现对显微切割的FFPE组织进行深入的蛋白质组学分析。

保存的临床样本是研究人类疾病蛋白质组学的独特资源。本文介绍了一种优化的方案，可实现大规模……

本实验的总体目标是从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）材料中生成并预先分级分离肽段，用于蛋白质组学分析。该过程首先通过显微切割分离目标组织，随后进行细胞裂解；第二步是通过样品处理生成肽段。采用多酶消化滤膜辅助样品制备法。随后通过测定色氨酸荧光对肽段进行定量。最后一步是利用强阴离子交换分离技术对肽段进行分级分离。最终，制备好的样品可实现对微量样本材料进行深度达 10,000 种蛋白质的蛋白质组分析。与现有的方法（如凝胶内或溶液中消化）相比，该技术的主要优势在于其适用于极微量的临床样本，例如激光显微切割细胞。该方法可提供含有完美且纯净肽段的样品。是什么推动了人类组织和疾病的蛋白质组学探索？整个方案包含过去开发并发表的技术。这些技术包括高回收率FASP、移液枪头法以及基于色氨酸荧光的肽含量测定，表明该操作流程将具有高效性。由我们实验室的技术员Catina开始准备组织切片，使用切片机切割用于显微切割的切片。切片的厚度取决于样本类型，通常显微切割适用于七到十微米厚的切片。将膜片在紫外光下照射45分钟后，将组织切片贴附其上，并于37摄氏度下干燥2小时。通过在两个连续盛有二甲苯的容器中依次孵育2.5分钟和1.5分钟，对贴附的切片进行脱蜡处理。随后通过连续步骤对切片进行再水化。在无水乙醇中孵育1分钟，70%乙醇中孵育1分钟，最后孵育水。用梅耶氏血红素染色20秒后。用清水冲洗一分钟，然后自然晾干。使用激光捕获显微切割系统收集目标细胞群体。使用PALM仪器时，将样品收集至粘附帽中，并加入3 µL组织裂解缓冲液，用于溶解10 nL的显微切割组织。将缓冲液加入盖子中的显微切割材料中，并盖紧管盖。短暂离心后收集悬浮液。随后在加热块中以99°C振荡处理显微切割组织1小时。将粗提物在16,000 G、18摄氏度条件下离心10分钟以澄清。在超滤装置中，将最多50微升澄清裂解液与200微升UA溶液混合。然后在14,000 G下离心，直至滤膜上残留液体少于10微升。通常此步骤需要离心10至15分钟。接着，用移液器将200 µL UA溶液加入超滤装置中并进行离心。与之前相同，在将50 µL IAA溶液移入超滤装置前，需先弃去收集管中的滤液。在室温下，以 600 转/分钟的速度在恒温混匀仪中混合 1 分钟，然后离心。与之前相同，继续按照本视频所附文字方案中所述的超滤和离心步骤操作。然后将滤过装置转移至新的收集管中。使用内切蛋白酶 lic C 消化缓冲液 40 微升，于 600 转/分钟的恒温混匀仪中混匀 1 分钟。将样品在 37 摄氏度的湿盒中孵育 18 小时。按先前方法离心滤器单元后，移取 160 微升 DB 缓冲液并进行离心。滤过单元使合并的流出液通过，其中含有内肽酶 lic C 释放的肽段。接下来，按照文本方案所述收集三联肽段。由于色氨酸残基易于接触溶剂，因此可在稀释缓冲液中测定蛋白质消化产物中的肽含量。为定量肽段，首先用移液器将 0.2 毫升测定缓冲液 DB 加入石英比色皿中。然后将石英比色皿放入仪器的比色皿 holder 中，记录空白样的发射光谱。通过向石英比色皿中逐次加入 1 µL 色氨酸标准溶液，并用缓冲液 db 轻柔混匀，以 0.1 µg 为梯度制备标准曲线。清洗石英比色皿后，用移液器加入待测样品，记录样品的光谱。在进行分级之前，按照文本方案中的描述计算蛋白质和肽段的浓度。通过在普通的 0.2 毫升移液枪头中堆叠六层 EM.Import 离子膜来制备 SAX 小柱。每个样品制备两个 SAX 小柱。接下来，通过堆叠三层 M four C 18 来制备阶段小柱。在一支 0.2 毫升的移液枪头中，为每个样品制备六个阶段小柱。开始操作。使用0.2毫升BRI和Robinson通用缓冲液（pH 11）稀释通过ly C消化获得的肽溶液。同样，使用0.2毫升Britannia和Robinson通用缓冲液（pH 5）稀释通过胰蛋白酶消化获得的肽溶液。在按照文本方案所述清洗并平衡SAX尖端柱和C18固相萃取小柱之前，先将SAX尖端柱组装到离心管适配器盖中。接下来，在C 18阶段尖端中组装SAX尖端柱。将样品溶液加入已平衡的SAX尖端柱中，并在5,000 G下离心3分钟。用0.1毫升稀释后的样品洗涤移液尖端柱。通过在5,000 G下离心促进液体流动。将SAX小柱转移至下一个C18阶段小柱，并继续按照文本方案中所述洗脱肽段。用0.05毫升缓冲液A洗涤C18小柱后，再用0.05毫升缓冲液B将组分洗脱至样品瓶中，后续用于将样品注入配备代表性质谱仪的液相色谱系统。此处展示的是蛋白质提取与消化的结果。裂解250纳升组织（相当于从10微米厚切片中显微切割的25平方毫米区域），经快速流程中内肽酶Slice C和胰蛋白酶两步连续消化后，可获得约45微克总蛋白，蛋白产率超过总蛋白量的50%。图中显示的是肽含量的代表性荧光测定结果，色氨酸标准品与样品的光谱在350至360纳米处均呈现最大荧光峰。荧光强度与色氨酸含量成正比。观看本视频后，您应能充分理解如何利用显微切割技术、样品处理及肽段分级分离方法，从高组织样本中制备用于蛋白质组学分析的样品。掌握该技术后，整个流程可在三至四小时内完成，另需加上蛋白质消化所需的时间。在操作该实验时，务必注意使用新鲜制备的组织切片。该技术的建立为蛋白质组学领域的研究人员探索组织与细胞的蛋白质组及其在人类疾病中的异常变化提供了可能，尤其适用于福尔马林固定及石蜡包埋的样本材料。

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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