修正了福尔马林蛋白质组学样品的制备和石蜡包埋组织

该程序的总体目标是从正式和固定以及石蜡包埋或 FFPE 材料中生成和预分馏肽，用于蛋白质组学分析。这是通过显微解剖分离所需组织，然后进行细胞裂解来实现的。第二步是通过样品处理生成肽。

使用多酶消解过滤器辅助样品制备。然后通过测量其色氨酸荧光来定量肽。最后一步是使用基于强阴离子交换剂的肽分离技术对肽进行分馏。

最终，制备的样品可以分析从微量材料到 10， 000 种蛋白质深度的蛋白质组。与现有方法（如凝胶或溶液消化）相比，该技术的主要优点是它适用于微量的临床样本，例如激光显微解剖细胞。该方法提供含有完美肽和纯肽的样品。

什么有助于人体组织和疾病的蛋白质组学探索？整个协议由过去开发和发布的技术组成。这些包括高回收率 fasp、移液管尖端和基于色氨酸荧光的肽含量测定，证明该程序将是

Catina 夫人定居我们实验室的技术人员开始准备组织切片，用于用切片机进行显微解剖切片。切片的厚度取决于样品。通常，显微解剖适用于 7 到 10 微米的切片。

用紫外线照射膜玻片 45 分钟后，将切片贴在上面，然后在 37 摄氏度下干燥 2 小时。通过在连续的二甲苯罐中连续孵育两次来分离封片部分 2 分半钟和 1 分半钟。然后连续再水化切片。

在无水乙醇、70% 乙醇中孵育 1 分钟。最后是水。用 Meyer 血红素对切片染色 20 秒后。

用水冲洗 1 分钟，然后风干。使用激光捕获显微切割系统收集感兴趣的细胞群。使用手掌仪器时，使用 3 微升组织裂解缓冲液收集胶帽中的样品，用于 10 纳升显微解剖组织。

将缓冲液涂抹在盖子中的显微解剖材料上，然后关闭试管。短暂离心后收集悬浮液。然后将微切片组织在 99 摄氏度的加热块中搅拌 1 小时。

通过在 16， 000 Gs 和 18 摄氏度下离心 10 分钟来澄清粗提取物。在超滤装置中，将多达 50 微升的澄清裂解物与 200 微升 UA 溶液混合。然后以 14， 000 GS 离心，直到过滤器中残留的溶液少于 10 微升。

通常此步骤需要 10 至 15 分钟的离心。接下来，将 200 微升 UA 溶液移液到超滤装置中并离心。和以前一样，在将 50 μL I A 溶液移液到超滤装置中之前，先清空收集管。

在热混合器中以 600 RPM 的转速在室温下混合 1 分钟，然后离心。和以前一样，继续按照本视频随附的文本方案中所述进行超滤和离心步骤。然后将过滤装置转移到新的收集管中。

吸取 40 μL 消化缓冲液和内切蛋白酶 lic C，然后在热混合器中以 600 RPM 混合 1 分钟。将装置在 37 摄氏度的湿室中孵育 18 小时。如前所述离心过滤器单元后，移取 160 微升 DB 缓冲液并离心。

混合流过的过滤器单元包含内切蛋白酶 lic C.Next 释放的肽，如文本方案中所述收集三联肽。蛋白质消化物中肽含量的测量可以在稀释的缓冲液中进行，因为色氨酸残基很容易被溶剂吸收。为了定量肽，首先将 0.2 毫升测定缓冲液 DB 移液到石英 Q VET 中。

然后将 Q vet 放入仪器 qve 支架中，并记录空白的发射光谱。向 Q vet 中加入 1 微升色氨酸标准溶液等分试样，并与缓冲液 db 轻轻混合，使用 0.1 μg 步骤制备校准曲线。清洁 Q 兽医后，吸取样品并记录样品光谱。

在分级分离之前，按照文本方案中的说明继续计算蛋白质和肽浓度。通过堆叠六层 EM 来制备 SAX 吸头柱。将离子膜导入普通的 0.2 mL 移液器吸头中。每个样品制作两个 SAX 吸头柱。

接下来，通过堆叠三层 M four C 18 来准备载物台尖端。在 0.2 mL 移液器吸头中，为每个样品制作 6 个阶段吸头。开始。

分级分离稀释用 ly C 和 0.2 ml BRI 和 Robinson 通用缓冲液消化得到的肽溶液。pH 值 11 同样稀释用胰蛋白酶和 0.2 ml Britain and Robinson Universal 缓冲液消化得到的肽溶液。pH 值 5 在洗涤前将 SAX 吸头柱组装在离心管适配器盖中，并按照文本方案中的说明平衡 SAX 吸头柱和 C 18 阶段吸头。

接下来，将 SAX 吸头柱组装在 C 18 stage 吸头中。将样品溶液上样到平衡 SAX 吸头柱中，并以 5， 000 Gs 离心柱 3 分钟。用 0.1 mL 稀释的样品清洗移液器吸头柱。

通过以 5， 000 Gs 离心促进流速，将 SAX 吸头柱转移到下一个 C 18 阶段吸头，然后按照文本方案中的说明继续洗脱肽。用 0.05 mL 缓冲液 a 洗涤 C 18 样品台吸头后，用 0.05 mL 缓冲液 B 将馏分洗脱到样品瓶中，然后将样品注入由质谱仪代表组装的液相色谱系统中。蛋白质提取和消化的结果如下所示。

裂解 250 纳升组织，相当于从 10 微米切片中切割 25 平方毫米的显微切片区域，在用内切蛋白酶切片 C 和胰蛋白酶以禁食形式进行两步连续消化后，产生大约 45 微克总蛋白，产量超过总蛋白的 50%。此处显示的是肽含量的代表性荧光测量值，色氨酸标准品和样品的光谱显示 350 至 360 纳米处的最大值。荧光强度与色氨酸含量成正比。

观看此视频后，您应该对如何使用显微切割技术、样品处理和肽分离从高组织中制备用于蛋白质组学分析的样品有很好的了解。一旦掌握，该技术可以在 3 到 4 小时内完成，加上蛋白质消化不良所需的时间。在尝试此过程时，重要的是要记住使用新鲜制备的组织切片 开发后。这项技术为蛋白质组学领域的研究人员在固定和 paren 包埋材料中使用 arval for 探索组织和细胞的蛋白质组以及人类的异常铺平了道路。