使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

本实验的总体目标是无需通过菌落形成单位培养，即可定量与宿主细胞相关的致病性酵母。首先，用具有H荚膜或白色念珠菌酵母细胞感染巨噬细胞，然后使用吖啶橙和碘化丙啶对感染的巨噬细胞进行染色，以标记存活的酵母细胞。随后，利用成像细胞仪捕获一系列图像，并分析大小和形态参数，从而精确计数酵母细胞。

图像细胞计量法的结果可有效用于量化与宿主细胞相关的致病性酵母。我最初萌生这一方法的想法，是在进行真菌致病机制研究时，当时我不得不反复进行平板培养并计数菌落形成单位，以定量荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsule）这一致病真菌。相较于传统的菌落形成单位（CFU）计数方法，图像细胞计量法的主要优势在于其速度更快，因为它省去了平板接种、孵育以及对CFU进行多重连续稀释后计数等耗时耗力的步骤，尤其在比较野生型与突变株在宿主细胞内生长情况时更为高效。

该方法消除了因在固体培养基上启动优质生长能力不同而可能引入的偏差。通常，初次接触该方法的人员可能会在图像细胞术、仪器和软件方面遇到挑战。

以所需的密度开始培养巨噬细胞。在24孔板中加入处于对数生长期的真菌细胞，然后孵育90分钟以允许吞噬作用发生。接着，用PBS洗涤巨噬细胞三次，以去除细胞外的真菌，并在低感染复数条件下，根据实验设定的时间点孵育，在此条件下，感染的巨噬细胞可保持数天的活力，样品大约可每12至24小时分析一次。

用 PBS 洗涤三次后，向感染的巨噬细胞中加入 0.5 毫升无菌水。室温孵育 5 分钟，以释放巨噬细胞中的真菌。然后将裂解液收集至无菌离心管中，并置于冰上保存。

将20 µL裂解液转移至另一离心管中。加入20 µL碘化丙啶橙黄酰胺溶液，立即进行成像流式细胞分析。用培养基对裂解液进行10倍稀释。

然后将每个稀释液取 100 µL，重复接种于 HMM 琼脂平板上。将平板置于湿润的培养箱中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 7 至 8 天。

人工计数平板上的菌落，菌落数量应不少于100个且不多于1000个。为收集活的巨噬细胞，用PBS洗涤细胞三次，然后加入0.5毫升PBS，在4°C下孵育30分钟。

通过轻柔吹打将巨噬细胞从组织培养孔中移出。将液体转移至无菌管中，并置于冰上保存。为设置加速度计仪器，请将荧光光学模块插入系统，并确保其已锁定到位。

在软件的检测下拉菜单中打开成像细胞仪。选择预设的检测类型和用于活力检测的细胞类型。该检测针对碘化丙啶和吖啶橙的检测进行了优化，用于检测白色念珠菌感染。

该检测方法已针对GFP检测进行了优化。现在打开选项选项卡，点击“采集背景图像”。操作完成后，点击预览明场图像以进行A OPI活力测定。取20 µL样品与20 µL A OPI混合，用移液器将混合液加入计数室，用于白色念珠菌感染率的测定。

充分混匀样品，直接用移液器将样品加入计数室。待细胞在计数室内沉降后，将计数室插入成像细胞计数仪中进行图像采集。调节样品至成像清晰，然后点击“计数”。

图像采集操作完成后，取下一次性计数板并妥善处理。进行 A OPI 测量时，细胞浓度和活力结果将显示在计数结果页面，用于确定白色念珠菌感染率。获得计数结果后，点击导出。

然后将数据发送至 FCS Express 4 进行 GFP 的细胞群体分析。在 FCS Express 中导入数据文件，并将结果以荧光直方图形式绘出。接下来，在直方图上应用细胞群体门控，以确定白色念珠菌感染细胞的群体百分比。

本实验在特定时间点监测感染了hcaps Lotum酵母的巨噬细胞的生长情况。样品经染色后，通过基于图像的细胞计数法进行分析。来自裂解巨噬细胞的游离酵母细胞由Soter vision软件识别。

此处检测到的活酵母细胞绝对数量高于在固体培养基上能够形成菌落的酵母细胞数量。这些数据表明存在大量具有活力但不可培养的细胞。这些骨髓来源的巨噬细胞被白色念珠菌酵母细胞感染，后者在ADH1启动子的调控下表达绿色荧光蛋白。

感染复数在 0.1 至 10 范围内可导致感染巨噬细胞内的 GFP 荧光强度以及感染巨噬细胞的总百分比逐步增加。一旦掌握，若操作得当，每个样本仅需几分钟即可完成该技术。在进行此操作时，重要的是要记住设置参数，以确保仅计数真菌细胞而非宿主细胞。

观看本视频后，您应能充分了解如何使用成像细胞术来定量与宿主细胞相关的致病性酵母。请务必注意，操作致病性真菌可能具有极高危险性，因此应穿戴个人防护装备，并遵循正确的生物危害废弃物处理程序。