Name: 使用的细胞图像分析仪量化致病真菌与宿主细胞协会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习使用图像细胞术定量分析巨噬细胞与致病酵母的相互作用。该方法通过吖啶橙和碘化丙啶染色，结合成像细胞仪快速计数，无需传统菌落形成单位培养，显著提高真菌致病机制研究效率。

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1. 用H. capsulatum, C. albicans感染巨噬细胞
<ol>
	<li>感染前16小时，将巨噬细胞以所需密度接种于24孔板中。本方案中使用的细胞密度为每孔3.0 × 105个细胞。</li>
	<li>加入处于对数生长期的真菌细胞，使其感染复数（MOI）达到所需水平。本方案适用于MOI范围为0.2至5.0的条件。在RAW264.7巨噬细胞感染H. capsulatum的实验中，我们采用的MOI为0.2。</li>
	<li>给予1.5小时以完成吞噬作用后，用PBS洗涤巨噬细胞三次，以去除细胞外的真菌。</li>
	<li>在样品分析前，根据需要孵育相应小时数。在低MOI条件下（本实验中为0.2），被感染的巨噬细胞可维持数天的活力，样品可大约每12–24小时分析一次。</li>
</ol>
2. 巨噬细胞裂解
<ol>
	<li>为释放巨噬细胞内的真菌，移除培养基，用 PBS 洗涤 3 次，加入 0.5 ml 无菌水。在此条件下，巨噬细胞将发生裂解，而真菌细胞保持完整。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>将裂解液转移至无菌管中，置于冰上保存。</li>
	<li>取 20 μl 裂解液转移至另一管中，然后加入 20 μl AO/PI 溶液。立即进入步骤 5：“成像细胞计量分析的样品制备”</li>
</ol>
3. 菌落形成单位（CFU）涂布
<ol>
	<li>用培养基对裂解物（来自步骤 2.3）进行十倍系列稀释。</li>
	<li>取每种稀释液 100 μl，重复两份，接种于 HMM-琼脂糖平板上。将平板置于湿润容器中，在 37 °C、含 5% CO2 条件下培养 7–8 天。</li>
	<li>人工计数菌落数在 100 至 1,000 个之间的平板上的菌落。</li>
</ol>
4. 活体巨噬细胞内真菌的可视化
<ol>
	<li>为收集活体巨噬细胞，用 PBS 洗涤细胞 3 次。加入 0.5 ml PBS，4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>为从组织培养孔中分离巨噬细胞，轻轻吹打数次。将液体转移至无菌离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>取 20 μl 样品转移至另一离心管，然后加入 20 μl AO/PI 溶液。立即进入第 5 步：“成像细胞分析的样品制备”。</li>
</ol>
5. 图像流式细胞分析的样本制备
<ol>
	<li>充分吹打混匀待测样品，然后取 20 μl 样品加入一次性细胞计数板中。</li>
	<li>静置 30 秒，使细胞在计数板内沉降。</li>
	<li>将计数板插入成像细胞计数仪中。</li>
</ol>
6. 细胞计数仪仪器设置
<ol>
	<li>将荧光光学模块 VB-535-402 和 VB-660-502 插入系统，并确保其已锁定到位。
	<ol>
		<li>VB-535-402（激发波长 475 nm，发射波长 535 nm）用于吖啶橙和 GFP 的检测。</li>
		<li>VB-660-502（激发波长 540 nm，发射波长 660 nm）用于碘化丙啶的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开成像细胞仪，并启动配套软件。</li>
</ol>
7. Cellometer 软件设置
<ol>
	<li>在“检测下拉菜单”中选择预设的“检测类型”和“细胞类型”。
	<ol>
		<li>对于活力检测，该检测已针对吖啶橙和碘化丙啶的检测进行了优化。</li>
		<li>对于白色念珠菌（Candida albicans）感染的检测，该检测已针对GFP检测进行了优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击顶部的“选项”，然后选择“采集背景图像”，并等待操作完成。</li>
	<li>点击“预览明场图像”。</li>
</ol>
8. 图像采集流程
<ol>
	<li>将制备好的样品室插入图像细胞计数仪中。</li>
	<li>使用调焦旋钮调节焦距。</li>
	<li>待图像清晰后，点击“计数”按钮，等待图像采集操作完成。</li>
	<li>取出一次性计数室，并按规定妥善处理。</li>
</ol>
9. 图像数据分析
<ol>
	<li>浓度与细胞活力测定
	<ol>
		<li>计数完成后，目标细胞的浓度和活力将在结果页面中显示。</li>
		<li>点击“导出”按钮，将数据导出至 FCS Express 4，用于白色念珠菌（Candida albicans）感染实验中 GFP 的细胞群体分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>白色念珠菌（Candida albicans）感染细胞的 FCS Express 分析
	<ol>
		<li>将“.NXDAT”文件导入 FCS Express 4，并在荧光直方图中绘制结果。</li>
		<li>在直方图上设置细胞群体门控，以确定白色念珠菌（Candida albicans）感染细胞的群体百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

作者 Leo Li-Ying Chan 和 Benjamin Paradis 是 Nexcelom Bioscience LLC 的员工。

图像细胞术可使用户获取高质量图像，并利用专用软件对细胞进行快速定量分析。图像细胞术在微生物致病性研究领域应用的一个潜在挑战在于，待计数的微生物存在于包含哺乳动物宿主细胞的混合细胞群体中。本文展示了图像细胞术可用于在混合细胞群体中对可存活的致病性酵母进行定量分析 体外 巨噬细胞感染。我们的方法不仅忠实地重现了真菌生长和存活率在感染过程中观察到的变化趋势 体外 巨噬细胞感染实验，且相较于传统的菌落形成单位（CFU）实验具有更高的灵敏度 13.
与菌落形成单位（CFU）计数或流式细胞术相比，图像细胞术在酵母细胞定量方面具有多项实际优势。进行CFU平板计数时，实验人员必须制备多个稀释度的样品，以确保每个平板上的细胞数量可被准确计数，这一过程可能极为耗时费力。图像细胞术则无需进行多重稀释。此前我们已证明，在固体培养基上菌落的形成往往存在较大变异性，在极低浓度下真菌可能完全无法形成可见菌落，而图像细胞术则能够在任意浓度下实现细胞计数13。在低剂量感染的早期阶段或病原体清除过程中，当真菌数量稀少且活力处于检测临界水平...

研究病原真菌与其宿主和/或宿主细胞的相互作用时，通常需要在不同时间点或不同感染条件下对具有活力的真菌细胞进行定量。菌落形成单位（CFU）计数是测定存活真菌细胞数量的标准方法，但该技术存在若干缺点和局限性。首先，许多真菌物种生长缓慢，在固体培养基上形成可见菌落可能需要1至2周，显著延缓了研究进程。其次，CFU平板操作过程繁琐，因为必须进行多个稀释度的涂布，以确保获得可计数的菌落数量。第三，由于平板接种效率远低于100%，所测得的CFU数量通常低于实际接种的活菌数量。例如，双相型病原真菌Histoplasma capsulatum的接种效率最高可达90%，但通常仅为30%左右，而其近缘双相真菌Paracoccidioides brasiliensis的效率甚至更低，仅为10%1, 2。Candida albicans的接种效率也存在较大变异性3。最后，CFU分析仅能检测在固体培养基上能够生长并分裂的活细胞，而在许多情况下，了解死亡细胞和/或代谢失活细胞的存在及其浓度同样具有重要意义。
此前已有文献描述过利用流式细胞术对多种致病性真菌进行定量的方法4-6。然而，由于在共用的流式细胞仪上操作生物安全二级（BSL2）或三级（BSL3）病原体存在生物安全防护问题，该技术的应用受到限制。与流式细胞术类似，成像细胞术也是一种灵敏且快速的细胞定量方法。但成像细胞术可在成本显著降低的情况下获得可比的结果7-11。本文中，我们介绍了对与宿主细胞共培养的致病性真菌进行成像细胞术分析的方法。我们以两种人类致病真菌——Histoplasma capsulatum 和 Candida albicans 为例，展示本方法的应用。Histoplasma capsulatum 是一种双相型致病真菌，可引起呼吸系统疾病；在人体内，它以出芽酵母形式生长，并在肺泡巨噬细胞内复制。Candida albicans 是一种人体共生真菌，偶尔可导致念珠菌病。我们证明，成像细胞术可实现对这些酵母菌的快速定量，同时具备可视化能力。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI 溶液</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>一次性计数室</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision 软件</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

对致病性酵母细胞致病机制的研究 白色念珠菌, 荚膜组织胞浆菌，以及 新型隐球菌 常采用哺乳动物宿主或宿主细胞感染（即 巨噬细胞），随后通过菌落形成单位分析或流式细胞术对酵母进行定量。尽管菌落形成单位计数法是该领域最常用的方法，但该技术存在一些缺点和局限性，包括某些真菌在固体培养基上生长缓慢以及铺板效率低或不稳定，这在比较野生型与突变株生长情况时尤为值得关注。流式细胞术可快速提供有关酵母活力的定量信息，但由于成本较高及生物安全方面的考虑等实际原因，流式细胞术在致病性酵母检测中的应用受到限制。本文中，我们展示了一种基于成像的细胞计量方法，利用Cellometer Vision（Nexcelom Bioscience, LLC）对与巨噬细胞共培养的活致病性酵母进行定量。我们的研究聚焦于两种人类真菌病原体的检测： Histoplasma capsulatum 和 白色念珠菌. H. capsulatum 在巨噬细胞吞噬体内部复制，从而定植肺泡巨噬细胞，本文中我们对该病原体在巨噬细胞内的生长进行定量评估 H. capsulatum 使用吖啶橙/碘化丙啶染色结合成像细胞术检测RAW 264.7巨噬细胞中的酵母菌。本方法能够真实再现通过传统菌落形成单位计数所测得的生长趋势，且灵敏度显著提高。此外，我们利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的菌株直接评估活体巨噬细胞的感染情况 C. albicans我们的方法为检测和定量与宿主细胞相关的重大人类真菌病原体提供了一种快速、准确且经济的手段。

我们采用 Cellometer Vision 图像细胞仪监测H. capsulatum在巨噬细胞中的生长情况。将 RAW 264.7 细胞感染H. capsulatum酵母细胞后，在不同时间点取样，进行 AO/PI 染色，随后进行基于图像的细胞计量分析。同时，采用传统的菌落形成单位（CFU）计数法对样品进行分析。在每个时间点，样品均在水中孵育以裂解巨噬细胞，释放出的酵母细胞由 Cellometer Vision 软件识别（图1a和1b）。我们发现，在各个时间点，基于图像的细胞计量分析与CFU计数所检测到的活酵母浓度呈现出高度一致的变化趋势（图1c）。如预期所示，AO/PI染色检测到的活酵母绝对数量始终高于CFU分析所评估的在固体培养基上能够形成菌落的酵母数量，表明存在大量可存活但不可培养的细胞。
利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的酵母菌株可实现活体巨噬细胞内真菌细胞的可视化。骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）被在ADH1启动子调控下表达绿色荧光蛋白（G...

本文展示了如何利用图像细胞计量技术对与培养中宿主细胞相关的致病性真菌进行定量分析。该技术可作为菌落形成单位（CFU）计数的替代方法。

对白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌和新型隐球菌等致病性酵母细胞致病机制的研究……

本实验的总体目标是无需通过菌落形成单位培养，即可定量与宿主细胞相关的致病性酵母。首先，用具有H荚膜或白色念珠菌酵母细胞感染巨噬细胞，然后用吖啶橙和碘化丙啶对感染的巨噬细胞进行染色，以标记存活的酵母细胞。随后，利用成像细胞仪捕获一系列图像，并分析大小和形态参数，从而精确计数酵母细胞。图像流式细胞术的结果可有效用于定量与宿主细胞相关的致病性酵母。我最初萌生这一方法的想法是在进行真菌致病性研究时，当时我需要反复进行平板培养并计数菌落形成单位，以定量荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsule）这一致病真菌。与传统的菌落形成单位（CFU）计数方法相比，图像流式细胞术的主要优势在于其速度更快，因为它省去了对CFU进行多次连续稀释时所需的平板接种、培养和计数等耗时耗力的步骤，尤其在比较野生型和突变株在宿主细胞内生长情况时更为高效。该方法消除了因在固体培养基上启动优质生长能力不同而可能引入的偏差。通常，初次接触该方法的人员可能会在图像细胞术、仪器和软件方面遇到挑战。首先以适当的密度培养巨噬细胞。在24孔板中加入处于对数生长期的真菌细胞，孵育90分钟以允许吞噬作用发生。随后，用PBS洗涤巨噬细胞三次，以去除胞外真菌，并在低感染复数条件下，根据实验设定的时间点孵育细胞。在此条件下，感染的巨噬细胞可维持数天的活力，样品可每隔约12至24小时进行一次分析。用 PBS 洗涤三次后，向感染的巨噬细胞中加入 0.5 毫升无菌水。室温孵育 5 分钟，以释放巨噬细胞中的真菌。然后将裂解液收集至无菌离心管中，并置于冰上保存。将20 µL裂解液转移至另一离心管中。加入20 µL碘化丙啶橙黄溶液，立即进行成像流式细胞分析。用培养基对裂解液进行10倍稀释。然后将每个稀释液取 100 µL，重复接种于 HMM 琼脂平板上。将平板置于含 5% 二氧化碳的 37 °C 恒温湿化培养箱中孵育 7 至 8 天。手动计数平板上菌落数量，选择菌落数量在100至1000个之间的平板。为收集活的巨噬细胞，用PBS洗涤细胞三次，随后加入0.5毫升PBS，于4摄氏度孵育30分钟。通过轻柔吹打从组织培养孔中取出巨噬细胞。将液体转移至无菌管中并置于冰上保存。安装加速度计仪器时，将荧光光学模块插入系统，并确保其牢固固定。在软件的检测下拉菜单中打开成像细胞仪。选择预设的检测类型和细胞类型以进行活力检测。该检测针对碘化丙啶和丫啶橙的检测进行了优化，用于检测白色念珠菌感染。该检测方法已针对 GFP 检测进行优化。现在打开选项选项卡，点击“采集背景图像”。操作完成后，点击预览明场图像以进行 A OPI 活性测定。将 20 微升样品与 20 微升 A OPI 混合，用移液器转移至计数室，用于白色念珠菌感染率的测定。充分混匀样品，直接用移液器将样品加入计数室。待细胞在计数室内沉降后，将计数室插入成像细胞仪中进行图像采集。调节样品至成像清晰，然后点击计数。图像采集操作完成后，取下一次性计数室并妥善处理。进行 A OPI 测量时，细胞浓度和活率结果将显示在计数结果页面上，以确定白色念珠菌感染率。获得计数结果后，点击导出。然后将数据发送至 FCS Express 4 进行 GFP 的细胞群体分析。在 FCS Express 中导入数据文件，并将结果绘制为荧光直方图。接着，在直方图上应用细胞群体门控，以确定感染白色念珠菌细胞的群体百分比。本实验在特定时间点监测感染了 hcaps Lotum 酵母的巨噬细胞的生长情况。通过基于图像的流式细胞术对样品进行染色和分析。由Soter视觉软件识别从破裂的巨噬细胞中释放出的酵母细胞。此处检测到的活酵母细胞绝对数量大于能在固体培养基上形成菌落的酵母细胞数量。这些数据表明存在大量具有活力但不可培养的细胞。这些骨髓来源的巨噬细胞被白色念珠菌酵母细胞感染，后者在ADH1启动子的调控下表达绿色荧光蛋白。感染复数在 0.1 到 10 之间时，可导致感染巨噬细胞内的 GFP 荧光强度以及感染巨噬细胞的总百分比逐步增加。一旦掌握，若操作得当，该技术每个样本仅需数分钟即可完成。在进行此操作时，重要的是要记住设置参数，以确保仅计数真菌细胞而不计数宿主细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用成像细胞术来定量分析与宿主细胞相关的致病性酵母。请务必注意，操作致病性真菌可能具有极高危险性，因此必须穿戴个人防护装备，并遵循正确的生物危害废弃物处理程序。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用的细胞图像分析仪量化致病真菌与宿主细胞协会

本视频展示了一种定量检测人白细胞吞噬FITC标记的致病性真菌孢子的方法。通过复染区分被吞噬的孢子与黏附在细胞表面的孢子，随后进行流式细胞术分析。...

定量流式细胞术检测人吞噬细胞对真菌孢子的吞噬作用

在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌...

一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

本文介绍了一种利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子，结合活细胞视频显微镜和流式细胞术，实时评估原代人免疫细胞抗真菌活性的实验方案。所获得的数据可揭示宿主细胞与Aspergillus之间的相互作用，包括杀菌活性、吞噬作用、细胞迁移以及对真菌生长的抑制等过程。...

人原代中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus反应中抗真菌活性的活体成像

本文介绍了一种通过定量组织切片中Gomori改良银染法染色来测定侵袭性曲霉病小鼠肺部真菌负荷的实验方案。与通过肺组织真菌DNA的定量PCR评估真菌负荷的方法相比，该方法在使用较少动物的情况下即可获得可比的结果。...

组织学定量法测定实验性曲霉病中的肺部真菌负荷

本文详细介绍了一种制备隐球菌细胞与阿米巴原虫共培养体系的实验方案，该体系通过静态荧光图像和高分辨率透射电子显微镜图像进行研究。文中展示了定量数据如何补充此类定性信息。...

显微技术与荧光读取在研究中的互补应用 隐球菌-阿米巴相互作用

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

本实验方案的目的是在哺乳动物胃肠道中观察白色念珠菌（Candida...

使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

本方案提供了一种快速、可靠的方法，利用流式细胞术定量检测人原代吞噬细胞对Aspergillus...

使用流式细胞术测量人白细胞对Aspergillus fumigatus分生孢子的吞噬作用

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。...

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus...

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

我们提出一种方法，该方法利用一种可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞数量。对不同细胞群体的分析利用了不同细胞类型之间显著的细胞高度和结构差异，并通过自适应算法实现。...

基于面积的图像分析算法用于定量巨噬细胞-成纤维细胞共培养

学习使用图像细胞术定量分析巨噬细胞与致病酵母的相互作用。该方法通过吖啶橙和碘化丙啶染色，结合成像细胞仪快速计数，无需传统菌落形成单位培养，显著提高真菌致病机制研究效率。

使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

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