实验性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物的三维共聚焦分析

以下实验的总体目标是观察脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的表达及其细胞定位。首先，对脑缺血小鼠脑组织的冷冻切片进行染色，以鉴定小胶质细胞/巨噬细胞活化的标志物。染色后的切片进行三维共聚焦成像。

随后对获得的图像进行处理，以生成三维重建图像，并通过图像分析来确定细胞簇中标志物的表达定位。所得数据表明，三维共聚焦分析能够有效地将标志物的表达准确分配至特定的细胞结构。当同一细胞表达两种标志物但位于不同的亚细胞区域时，仅依靠共定位分析可能提供的信息有限。正如我们将在下文展示的，采用三维分析方法可实现更高的分辨率和准确性。

尽管该方法可用于深入了解大脑对缺血性损伤反应的复杂性，但它也可应用于其他急性或慢性疾病状况，其中小胶质细胞/巨噬细胞在损伤与修复中具有双重作用的情况已被提出；或在需要将信号选择性地定位于不同特定平面的情况下。Carlo Perigo 和 Magali 的 Stefan 将带领您逐步完成该实验操作的各个步骤。以下方案使用了通过永久性闭塞大脑中动脉诱导缺血的小鼠脑组织。

使用冷冻切片机将脑组织以20微米厚度进行连续冠状切片，并切至明胶上。盖玻片使用前需将所有试剂和样品恢复至室温。请注意，抗体和血清的工作稀释度是根据配套文件中所列条件经过试验确定的，以确保在使用不同抗体和血清时获得最佳效果。

该实验方案需要进行验证。首先使用液体阻断笔在载玻片上圈出组织区域，以减少所需试剂的用量。接着，用1毫升移液器将脑组织切片放入湿盒中。

向切片中加入室温的 PBS，孵育五分钟以进行洗涤。然后使用带针头的 1 毫升一次性注射器吸除溶液，并重复洗涤一次。在去除第二次洗涤液后，使用 1 毫升移液器和一次性注射器进行后续所有溶液更换，对样本进行染色。染色步骤应按照此处总结的流程进行。

具体步骤（包括洗涤步骤）详见配套文本。首先，细胞经正常山羊血清封闭后，用1%过氧化氢孵育。接着，细胞与抗CD11B的一抗孵育。然后，切片与适当的二抗孵育，随后用Triss、NACL Tween缓冲液（或TNT），再用Triss、H-Cl-NaCl封闭缓冲液（或TNB）处理，此步骤在TNB孵育后进行。

将切片与链霉亲和素-HRP孵育，随后加入含有氰化酪氨的扩增稀释液，以放大免疫荧光信号。接着，将切片与正常羊血清（NGS）孵育，以封闭非特异性结合位点。然后，再与抗CD68的一抗孵育。

一抗孵育后，将细胞置于相应的荧光标记二抗中孵育，随后加入每毫升1微克的鬼笔环肽以标记DNA。染色完成后，使用ProLong Gold封片剂封片，注意避免产生气泡。将切片置于4°C避光保存，直至进行分析。

荧光信号的采集应在一周内完成。本方案使用配备 FV 500 共聚焦扫描单元的 IX 81 显微镜，该系统具有三条激光线：488 纳米的氩-氪激光、646 纳米的氦-氖红色激光和 532 纳米的氦-氖绿色激光，另配有 U 500 软件中的紫外二极管。请选择合适的激发激光器和二向色镜。

同时将图像分辨率设置为至少 800 × 600 像素。接着，将玻片放置在显微镜载物台上，使用落射荧光识别感兴趣的区域，并逐步增加放大倍数至 40 × 物镜。然后切换至激光扫描显微成像模式，在调整每个通道的光电倍增管功率和增益的同时，进行重复扫描。

这将减少因不同波长的同步激发所导致的信号重叠。将增益保持在尽可能低的水平，以避免出现非特异性的背景信号。持续进行重复扫描，调节焦距，并定义Z轴的上下极限范围，使Z轴总长度为10微米。

然后停止重复扫描。接下来输入步长，应尽可能接近像素大小，即 0.225 微米。

这将在软件中使 Z 轴方向保持标准的 1:1 尺寸比例。至少启用两次卡尔曼滤波器。卡尔曼算法是一种迭代函数，可消除随机信号（例如属于背景噪声的单个阳性体素），从而提高信噪比。现在启用顺序扫描模式，以避免串扰效应。

移动至Z轴中点并执行XY序列扫描。检查PMT和增益的设置，以确保获得满意的信噪比。在采集后执行XY、Z轴图像采集。

将数据导出为多页TIF文件。每个多页TIF文件通常包含三个颜色通道和44个焦平面，用于后续处理。首先打开imas软件。

首先，选择“surpass”视图，然后上传多通道TIF文件。接下来，在显示调节面板中，为每个通道选择所需的颜色。其中，红色代表CD11B，绿色代表CD68，蓝色代表Hoechst DNA染色。为去除背景噪声，需在显示调节面板中提高每个通道的最小值。

然后进入剖面视图，以可视化单个 XY 焦平面，并显示 x、Z 和 YZ 轴的正交投影。沿 Z 轴移动，寻找共定位现象，其表现为黄色像素。单击黄色区域，查看共定位是否沿 Z 轴持续存在，若存在，则表明该结构属于沿 Z 轴的实体对象。

在图像的右侧和底部可见投影。拍摄快照后，返回超越视图。接着，在编辑下拉菜单中选择“裁剪3D”，并圈定感兴趣区域，以分离单个细胞或细胞簇。

然后在显示调节面板中选择一个通道。选择“超越表面”算法构建器。接着，为设置算法，首先选择一个通道。

然后将阈值定义为与显示调整面板中设置的相同最小值，并在需要时定义重采样大小。接下来，将平滑度定义为0.200。选择颜色面板并根据需要更改外观。

对每个通道重复进行 surpass 表面算法构建器的设置。然后在显示调整面板中，取消选择荧光通道，并选择所有三个表面。最后移动体积以找到最佳视角，并拍摄快照以确定 MM 标记物的共表达模式。

本视频中描述的免疫荧光与共聚焦成像方案是在一种通过大脑中动脉永久性闭塞诱导的局灶性缺血小鼠模型中进行的。所获取图像的二维视图显示，在缺血后24小时，溶酶体标志物CD68（绿色显示）表达于缺血核心区域中呈肥大的CD11b阳性细胞（红色显示）内。右下角所示的Z轴投影表明，单平面视图中记录的标志物分布同样存在于Z轴方向的边缘区域中。

CD11b 阳性细胞呈现肥大的细胞体，其突起对 CD68 高度阳性，提示吞噬体与细胞膜结合。这表明小胶质细胞具有活跃的酸性吞噬活性，可用于评估 CD68 与 YM1（M2 极化标志物）的共表达。Mm。荧光图像经过三维重建。

此处显示的图像三维视图表明存在 CD68 阳性细胞（绿色荧光体素）和 YM1 阳性细胞（红色荧光体素）。当两种信号平行排列时，观察者的视角可能产生共定位信号（呈现黄色），但这可能与标记物之间的实际距离无关。为定义共定位。

应沿 Z 轴移动，生成包含 Z 轴投影的单平面视图，以观察共定位。该图像右侧和底部所示部分即为获得的 Z 轴投影。

通过将标记物的表达指定给特定的细胞结构，并进行三维重建，可将荧光体素转化为实体结构。经过高倍放大和三维重建后，两种标记物似乎分别属于彼此邻近的不同细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何使用多种标记物和染料进行免疫荧光实验，以及如何通过共聚焦显微镜正确获取和可视化三维图像。

此外，所描述的后处理分析可有效用于分析细胞水平上的任何共表达或共定位，或在需要将信号选择性地定位在不同空间平面的情况下的分析。