Name: 偏振的实验性脑损伤小胶质细胞/巨噬细胞标志物的三维共聚焦分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学习使用三维共聚焦成像技术对小鼠脑缺血模型中的小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物进行可视化分析。该方法通过免疫荧光染色和三维渲染，帮助研究人员精确定位细胞簇中的标志物表达，深入理解脑损伤后的炎症反应机制。

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Stefano Fumagalli 是 Monzino 基金会的成员。

1. 免疫荧光
以下实验方案使用经心脏灌流小鼠获取的脑冠状冷冻切片（先灌注 20 ml PBS，0.1 mol/L，pH 7.4，随后灌注 50 ml 预冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS）。灌流后，小心取出脑组织并转移至含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 下孵育过夜以进行冷冻保护。随后将脑组织浸入 -45 °C 的异戊烷中快速冷冻 3 分钟，然后密封于样品管中，-70 °C 保存备用。连续切割脑冠状冷冻切片（20 μm），并进行免疫荧光染色实验11, 6。
使用前将所有试剂和样品恢复至室温。请注意，抗体和血清的工作稀释度是经过试验优化后确定的，以获得最佳实验效果。当使用不同的抗体和血清时，需对本实验方案进行验证。
需要注意的是，由于抗CD11b和抗CD68一抗均来源于大鼠，为避免使用抗大鼠Alexa 546二抗时产生交叉信号，我们采用高稀释度的抗CD11b抗体，随后使用TSA试剂盒（Cy5酪胺）进行荧光信号放大。我们通过执行本文所述实验流程（除步骤1.17外），并至少测试了7种不同稀释度的抗CD11b抗体（如表1所列），确定了其最佳工作稀释度。最终选择1:30,000稀释度，因为这是唯一满足以下条件的稀释度：1）在646 nm激发波长下可检测到Cy5的可见信号；2）在532 nm激发波长下无Alexa 546信号。通过此方法，Alexa 546荧光信号可特异性地反映CD68的表达。
抗CD11b和抗CD68抗体的最佳稀释度可能因组织类型而异，必须在开始共标记实验方案之前确定。
<ol>
	<li>用 PBS 清洗脑冷冻切片两次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 1% H2O2 的 PBS 中孵育 5 分钟（此步骤必需，因为荧光放大需要与辣根过氧化物酶链霉亲和素-HRP 孵育，请参见步骤 1.12）。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 2 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 10% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中孵育 60 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下，将冷冻切片在含一抗 Rat anti-CD11b [1:30,000]、10% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中过夜孵育。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 2 次（每次 5 分钟）。</li>
	<li>将冷冻切片在含生物素化二抗 anti-Rat Ab [1:200] 和 1% NGS 的 PBS 中孵育 60 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 2 次。</li>
	<li>用 TNT（Tris-HCl、NaCl、Tween：0.1 M TRIS-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20）清洗冷冻切片。</li>
	<li>将冷冻切片在 TNB（Tris-HCl-NaCl-封闭缓冲液：0.1 M TRIS-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.5% 来自相应试剂盒的封闭试剂）中孵育 1.5 小时。</li>
	<li>用 TNT 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 streptavidin-HRP [1:100] 的 TNB 中孵育。</li>
	<li>用 TNT 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 Cyanine 5 Tyramide [1:300] 的扩增稀释液中孵育 8 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 10% NGS 和 0.1% Triton 的 PBS 中孵育 60 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下，将冷冻切片在含一抗 Rat anti-CD68 [1:200]、3% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中过夜孵育。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含荧光标记二抗 Alexa 546 anti-Rat [1:500] 和 1% NGS 的 PBS 中孵育 60 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>将冷冻切片在含 Hoechst（1 μg/ml）的 PBS 中孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。</li>
	<li>用 Prolong Gold 封片剂封片。</li>
</ol>
2. 通过共聚焦显微镜获取三维图像
此处使用的显微镜为配备FV500共聚焦扫描单元的IX81显微镜，具有三条激光线：Ar-Kr（488 nm）、He-Ne红色（646 nm）和He-Ne绿色（532 nm），以及一个紫外二极管。
<ol>
	<li>根据待激发荧光染料的波长选择激发激光器（Cy5、CD11b 使用 He-Ne 红光；Alexa546、CD68 使用 He-Ne 绿光；Hoechst、细胞核使用紫外二极管激光）。</li>
	<li>选择最佳的二向色镜组合以收集光信号。</li>
	<li>将图像分辨率设置为至少 800 × 600 像素。</li>
	<li>使用落射荧光识别感兴趣区域，并逐步增加放大倍数至 40X 物镜。</li>
	<li>切换至激光扫描显微镜（LSM）模式。</li>
	<li>进行重复扫描，调节每个通道的光电倍增管（PMT）和增益。可单独开启各激光器以方便设置。增益应尽可能调低，以避免非特异性背景信号。</li>
	<li>在重复扫描过程中，调节焦距控制，确定 z 轴的上下极限位置（总 z 轴长度为 10 μm）。</li>
	<li>停止重复扫描。</li>
	<li>设定步进大小。步进大小应尽可能接近像素尺寸（0.225 μm），以在 z 轴上获得标准的 1:1 尺寸比例。</li>
	<li>至少启用两次 Kalman 滤波。</li>
	<li>启用顺序扫描模式，以避免串色干扰效应。</li>
	<li>沿 z 轴中点位置进行 xy 顺序扫描。检查 PMT 和增益的设置（良好的信噪比）。若结果不理想，重复步骤 2.6。</li>
	<li>执行 xyz 轴图像采集。</li>
	<li>将数据导出为多页 TIFF 文件。每个多页 TIFF 文件通常包含 3 个颜色通道（蓝色、绿色和红色）以及 44 个焦平面。</li>
</ol>
3. 共聚焦图像的三维视图与三维重建
将多页TIFF文件上传至Imaris软件，并按以下步骤进行处理：
<ol>
	<li>打开软件。</li>
	<li>选择 surpass 视图。</li>
	<li>上传 multitiff 文件。</li>
	<li>为每个通道选择所需的颜色。</li>
	<li>通过在 display adjustment 面板中提高最小值来去除背景噪声。每个通道需单独调整。</li>
	<li>切换至 section 视图。沿 z 轴移动，寻找共定位（黄色像素）。</li>
	<li>点击黄色区域，查看共定位是否沿 z 轴连续存在（即是否属于一个完整的结构）。z 轴投影显示在图像的右侧和底部。</li>
	<li>拍摄快照。</li>
	<li>返回 surpass 视图。</li>
	<li>对 3D 图像进行裁剪，以分离单个细胞或细胞簇。</li>
	<li>在 display adjustment 面板中选择一个通道。</li>
	<li>选择 surpass/surfaces 算法构建器。算法步骤：
	<ol>
		<li>选择通道。</li>
		<li>设定阈值（使用与 display adjustment 面板中相同的最小值）。</li>
		<li>设定重定大小参数。</li>
		<li>设定平滑度（最佳值 = 0.200）。</li>
		<li>设定颜色显示效果。</li>
		<li>结束算法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个通道重复步骤 3.12。</li>
	<li>在 display adjustment 面板中取消选择荧光通道，并选择全部三个 surfaces。</li>
	<li>旋转体积以找到最佳视角。</li>
	<li>拍摄快照。</li>
</ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种基于免疫荧光染色并结合三维共聚焦分析的实验方案，作为一种强大的方法用于研究缺血区域中巨噬/单核细胞（M/M）表型标志物的定位与共表达情况（更详细的分析参见参考文献 6）。该方法结合了巨噬细胞/单核细胞（M/M）活化相关标志物的特异性染色与三维共聚焦成像技术。通过精确优化抗体、血清及荧光标记物的工作浓度，可实现目标标志物最佳的信噪比。图像处理以获得三维重建图像，有助于界定细胞簇中标志物的表达情况，从而使所获取的图像能够反映M/M的功能状态。目前越来越多的研究认为，M/M是具有高度可塑性的细胞，可根据周围环境信号的不同，获得多种表型并启动不同的功能程序。炎症微环境随时间动态演变，可能调控M/M的极化方向，从而影响其功能表型。 体内 研究远比……更有启发性 体外 模型，在这些模型中，无法重现所招募/激活细胞的完整网络。	
	修改与故障排除	
	本文所述方案专门针对小鼠脑组织冷冻切片（20 μm）开发。所用抗体的工作稀释度可根据动物种类或组织性质进行调整。此外，免疫荧光...

急性脑损伤后，小胶质细胞会迅速被激活，并发生显著的形态学和表型改变1-3。这种内在反应常伴随外周血源性巨噬细胞的募集，这些巨噬细胞迁移至受损的脑实质中4,5。目前对于在抗原表型上难以区分的小胶质细胞和巨噬细胞（以下简称M/M）在脑损伤中的作用仍存在争议。越来越多的研究表明，类似于外周巨噬细胞，小胶质细胞及脑内募集的巨噬细胞可呈现不同的表型，其两极分别为经典的促炎毒性表型（M1）和抗炎保护性表型（M2）。这些不同的活化状态，包括促炎或抗炎因子的分泌、神经营养分子的释放以及溶酶体活性，均表现出特定的表型标志物表达模式，而这些标志物的表达取决于局部微环境随时间的动态变化。目前对损伤脑组织中M/M表型的特征描述仍较为有限。我们采用一种成熟的鼠类永久性大脑中动脉闭塞（pMCAo）模型，以分析脑卒中后M/M的表达及其演变过程。本文所介绍的基于免疫荧光的实验方案，旨在深入了解特定M/M表型标志物在缺血区域的出现情况、定位分布及其细胞共表达特征。我们检测了若干与不同活化状态或表型相关的分子，包括CD11b（一种白细胞表面标志物，广泛用于标记M/M的活化或募集6-8）、CD68（溶酶体标志物6,7）以及Ym1（一种由替代活化型巨噬细胞（M2）表达的分泌蛋白，与功能恢复和修复过程相关9-10）。	
	当两种标记物由同一细胞表达，但在不同的亚细胞区室中时，仅靠共定位可能无法提供足够的信息。在此情况下，可通过单平面视图和三维重建来进行共表达分析。本文介绍了一种对标记物共表达进行彻底三维分析的实验方案。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD11b</td><td>由意大利米兰 Humanitas 临床研究所 A. Doni 博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠 Ym1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗神经元核抗原（NeuN）</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>生物素化山羊抗大鼠抗体</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 Alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vectors Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>冷冻切片机 CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.0 软件包</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

实验性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物的三维共聚焦分析

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

脑卒中后，小胶质细胞/巨噬细胞（M/M）会迅速活化，发生显著的形态学和表型改变，包括表达新的表面抗原以及产生介导并维持炎症反应的介质。新兴证据表明，M/M 是具有高度可塑性的细胞，在急性脑损伤后可表现为经典的促炎性（M1）或替代性的抗炎性（M2）活化状态。然而，对于损伤脑组织中 M/M 表型标志物的表达特征、共定位情况及其随时间演变的完整描述仍尚不完善。	
	可在脑缺血组织中实施特异性标记巨噬细胞/小胶质细胞（M/M）活化相关标志物的免疫荧光染色方案。本文介绍了一种基于免疫荧光染色并结合三维共聚焦分析的强大方法，用于研究在大脑中动脉永久性闭塞（pMCAO）诱导的小鼠局灶性脑缺血模型中，M/M表型标志物（如CD11b、CD68、Ym1）的定位模式与共表达情况。对染色区域的二维分析显示，每种标志物均与特定的M/M形态相关，并在缺血病灶中具有特定的分布位置。通过三维共聚焦成像可进一步评估缺血区域内M/M表型标志物的共表达模式。图像采集可在特定体积范围内（z轴10 μm，步进大小0.23 μm，对应180 × 135 × 10 μm的体积）采用逐帧扫描模式进行，以最大限度减少荧光串色效应并避免波长重叠。随后利用Imaris软件对图像进行处理，生成三维重建图像。三维重建图像的实体视图可清晰显示细胞簇中标志物的表达情况。结果表明，M/M具有向多种表型分化的能力，其分化方向取决于在病灶中的位置及损伤后的时间点。

当在缺血区域执行标记方案和共聚焦采集时，所获得结果的一个示例如图1A和1B所示。图像的二维视图显示，在缺血后24小时(A)，溶酶体标志物CD68（绿色）表达于缺血核心区域存在的肥大阿米巴样CD11b细胞（红色）中。在边界区域(B)，CD11b阳性细胞呈现圆形胞体以及对CD68呈阳性反应的分支状突起。Z轴投影（A和B的右侧及底部部分）可用于观察在单平面视图中记录的标志物分布是否同样存在于Z轴方向上。当发生共定位时，会生成黄色像素。CD11b是C3片段的受体，呈膜分布；CD68标记溶酶体，因此主要存在于细胞质中。CD11b/CD68双阳性细胞通常仅有小部分体素发生共定位，在大多数情况下CD11b包围着CD68（图1A）。只有在吞噬过程中吞噬体与细胞膜结合时，才会实现CD11b与CD68之间的共定位（图1B）。
在<st...

本文介绍了一种深入了解脑部炎症反应复杂性的方法。我们描述了基于免疫荧光的实验方案，结合三维共聚焦分析，用于研究局灶性脑缺血小鼠模型中小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的共表达模式。

脑卒中后，小胶质细胞/巨噬细胞（M/M）会迅速活化，伴随显著的形态学和表型变化，包括表达……

以下实验的总体目标是观察脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的表达及其细胞定位。首先，对脑缺血小鼠脑组织的冷冻切片进行染色，以鉴定小胶质细胞/巨噬细胞活化的标志物。染色后的切片进行三维共聚焦成像。随后对获得的图像进行处理，以生成三维重建图像，并通过图像分析来确定标记物在细胞簇中的定位。所得数据表明，三维共聚焦分析能够有效地将标记物的表达准确分配至特定的细胞结构。当同一细胞表达两种标记物但位于不同的亚细胞区域时，仅依靠共定位分析可能提供的信息有限。正如我们将在下文展示的，采用三维分析可实现更高的分辨率和准确性。尽管该方法可揭示脑组织对缺血性损伤反应的复杂性，但也适用于其他急性或慢性疾病状况，尤其是在小胶质细胞/巨噬细胞在损伤与修复中具有双重作用被提出的情况下，或需要在不同特定平面选择性定位信号的情形。Carlo Perigo 和 Magali 的 Stefan 将引导您完成该实验操作的各个步骤。以下方案使用了通过永久性闭塞大脑中动脉诱导缺血的小鼠脑组织。使用冷冻切片机将脑组织以20微米厚度进行连续冠状切片，并切至明胶上。盖玻片使用前需将所有试剂和样品恢复至室温。请注意，随附文件中所列抗体和血清的工作稀释度是通过实验优化得出的，以确保在使用不同抗体和血清时获得最佳效果。该实验方案需要进行验证。首先使用液体阻断笔在载玻片上圈出组织区域，以减少所需试剂的用量。接着，用1毫升移液器将脑组织切片放入湿盒中。向切片中加入室温的 PBS，孵育五分钟以进行洗涤。然后使用带针头的一毫升一次性注射器吸除溶液，并重复洗涤一次。在去除第二次洗涤液后，使用一毫升移液器和一次性注射器进行所有溶液更换，对样本进行染色。染色步骤应按照此处总结的方法进行。具体步骤（包括洗涤步骤）详见配套文本。首先，细胞在用正常山羊血清封闭后，与1%过氧化氢共同孵育。接着，细胞与抗CD11B的一抗共同孵育。随后，切片与适当的二抗孵育，然后用Triss、NaCl Tween缓冲液（或TNT），再用Triss、HCl、NaCl缓冲液（或TNB）进行处理，即在TNB孵育后使用TNB缓冲液。将切片与链霉亲和素-HRP孵育，随后加入含有氰化酪氨的扩增稀释液，以放大免疫荧光信号。接着，将切片与正常羊血清（NGS）孵育，以阻断非特异性结合位点。然后，再与抗CD68的一抗孵育。一抗孵育后，将细胞置于相应的荧光标记二抗中孵育，随后加入每毫升1微克的钩标记DNA。染色完成后，使用Prolonged Gold封片剂封片，注意避免产生气泡。将切片置于4°C避光保存，直至进行分析。荧光信号的采集应在一周内完成。本方案使用配备 FV 500 共聚焦扫描单元的 IX 81 显微镜，其具有三条激光线：488 纳米的氩-氪激光、646 纳米的氦-氖红色激光和 532 纳米的氦-氖绿色激光，另加 U 500 软件中的紫外二极管。请选择合适的激发激光器和二向色镜。同时将图像分辨率设置为至少 800 × 600 像素。接下来，将玻片放置在显微镜载物台上，使用落射荧光法找到感兴趣的区域，并逐步增加放大倍数至 40 × 物镜。然后切换至激光扫描显微模式，在调整每个通道的光电倍增管功率和增益的同时进行重复扫描。这将减少因不同波长的同步激发所引起的信号重叠。将增益保持在尽可能低的水平，以避免出现非特异性的背景信号。在持续进行重复扫描的同时，调节焦距，并定义Z轴的上下极限范围，总Z轴长度为10微米。然后停止重复扫描。接下来，输入步长，应尽可能接近像素大小，即 0.225 微米。这将在软件中实现Z轴方向的标准1:1尺寸比例。至少启用两次卡尔曼滤波器。卡尔曼算法是一种迭代函数，可消除随机信号（例如属于背景噪声的单个阳性体素），从而提高信噪比。现在启用顺序扫描模式，以避免串扰效应。移动至Z轴中点并执行XY序列扫描。检查PMT和增益的设置，以确保获得满意的信噪比。随后进行XY、Z轴图像采集。将数据导出为多页TIF文件。每个多页TIF文件通常包含三个颜色通道和44个焦平面，用于后续处理。首先打开imas软件。首先，选择“surpass”视图，然后上传多通道TIF文件。接下来，在显示调节面板中，为每个通道选择所需的颜色。其中，红色代表CD11B，绿色代表CD68，蓝色代表Hoechst DNA染色。为去除背景噪声，需在显示调节面板中提高每个通道的最小值。然后进入剖面视图，以可视化单个 XY 焦平面，并显示 x、Z 和 YZ 轴的正交投影。沿 Z 轴移动，寻找共定位现象，其表现为黄色像素。单击黄色区域，查看共定位是否沿 Z 轴持续存在，若存在，则表明该结构属于沿 Z 轴的实体对象。在图像的右侧和底部可见投影。拍摄快照后，返回 surpass 视图。接着，在编辑下拉菜单中选择“裁剪 3D”，并圈定感兴趣区域，以分离单个细胞或细胞簇。然后在显示调节面板中选择一个通道。选择“超越表面”算法构建器。接着，为设置算法，首先选择一个通道。然后将阈值定义为与显示调整面板中设置的相同最小值，并在需要时定义重设大小。接下来，将平滑度定义为0.200。选择颜色面板，并根据需要更改外观。对每个通道重复进行 surpass 表面算法构建器的设置。然后在显示调整面板中，取消选择荧光通道，并选择所有三个表面。最后移动体积以找到最佳视角，并拍摄快照以确定 MM 标记物的共表达模式。本视频中描述的免疫荧光和共聚焦成像方案是在一种通过永久性闭塞大脑中动脉诱导局灶性缺血的小鼠模型中进行的。所获取图像的二维视图显示，在缺血后24小时，溶酶体标志物CD68（绿色显示）表达于缺血核心区域存在的肥大CD11b阳性细胞（红色显示）中。右下角所示的Z轴投影表明，在单平面视图中记录的标志物分布同样沿Z轴存在于边界区。CD11b 阳性细胞表现出肥大的细胞体，其突起对 CD68 高度阳性，提示吞噬体与细胞膜结合。这表明小胶质细胞具有活跃的酸性吞噬体行为，可用于评估 CD68 与 YM1（M2 极化细胞的标志物）的共表达。Mm。荧光图像经过三维重建。此处显示的图像三维视图表明存在 CD68 阳性细胞（绿色荧光体素）和 YM1 阳性细胞（红色荧光体素）。当两种信号平行排列时，观察者视角可能产生共定位信号（呈现黄色），但该现象可能与标记物之间的实际距离无关。为明确定义共定位。应沿Z轴移动，生成包含Z轴投影的单平面图像，以观察共定位情况。Z轴投影如本图右侧和底部所示。通过将标记物的表达指定到特定的细胞结构，并进行三维重建，可将荧光体素转化为实体结构。经过高倍放大和三维重建后，两种标记物似乎分别属于彼此邻近的不同细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用多种标记物和染料进行免疫荧光实验，以及如何通过共聚焦显微镜正确获取和可视化三维图像。此外，所描述的后期分析方法可有效用于分析细胞水平上的任何共表达或共定位，或在需要将信号选择性地定位在不同空间平面的情况下的分析。

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