Name: 柔性神经微探针的使用附加与Biodissolvable胶粘剂刚性加劲肋插入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习使用生物可降解聚乙二醇胶粘剂和临时刚性加劲肋植入柔性神经微探针的方法。该技术可实现精确植入并减少组织损伤，适用于神经科学和生物医学工程领域的体内记录与刺激研究。

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本工作由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所资助，项目编号为 Y1-DC-8002-01。本工作在美国能源部授权下，由劳伦斯利弗莫尔国家实验室根据合同 DE-AC52-07NA27344 执行。

1. 探针与加强件的组装

	本方案的这一部分描述了硅质加强片的制备，以及将薄膜聚合物探针组装到该加强片上的过程。图1展示了一种典型的聚合物神经探针及其所提出的加强片结构。图2显示了加强片设计的详细结构。该设计的创新之处在于沿其长度方向设有一条浅的&quot;导液&quot;通道，用于在组装过程中分散液态粘合剂。加强片较宽的部分为操作标签，便于组装和手术植入时的操作。标签上的储液区与该通道相连。该部件采用标准的微加工工艺从硅材料加工而成。
<ol>
	<li>
		硅质加强片及其毛细引流通道由器件层厚度等于目标加强片厚度的绝缘体上硅（SOI）晶圆制备而成（图3A）。加强片厚度的合理范围为20–100 μm。建议加强片的宽度比探针宽度小20–30 μm，以防止粘合界面处的胶粘剂溢出至探针顶部。首先采用标准博世工艺干法刻蚀出毛细引流通道（图3B）。接着，通过更长时间的刻蚀定义加强片的几何形状，该刻蚀在埋入式氧化层处停止（图3C）。最后，使用49%氢氟酸湿法刻蚀去除埋入式氧化层，从而释放加强片（图3D）。将加强片充分冲洗后，浸泡于去离子水中15分钟。</li>
	<li>
		将分子量为10,000 g/mol的聚乙二醇（PEG）颗粒放入储液池中（图4）。将加强片加热至65 °C，使PEG熔化，并通过毛细作用吸入通道中。随后冷却至室温使其固化。</li>
	<li>
		图5展示了倒装焊机的装置示意图。将加强片倒置放置于倒装焊机的基底平台上，然后用工具头拾取加强片。将探针倒置放置于基底平台上。利用倒装焊机对准加强片与探针，随后降低加强片并将其贴合至探针上。</li>
	<li>
		倒装焊机的基底平台应配备加热元件，用于对基底加热。放置加强片后，再次将组件加热至65 °C。保持一分钟，使PEG重新熔化并开始填充探针与加强片之间的界面。随后冷却使其固化。</li>
	<li>
		将组件翻转，从顶部进行检查。根据需要重新加热，使PEG完全填充探针与加强片之间的界面。由于探针为透明材质，该过程可通过视觉评估。当组件以加热面朝上（即探针面朝上）放置于加热器上时，手动将1–3粒固态PEG颗粒放置于标签区域，使其在探针表面熔化，从而在该区域提供额外加固（图6）。最后，让组件冷却，使PEG完全固化。至此，组件已准备就绪，可用于外科植入。</li>
</ol>

	2. 插入与提取
<ol>
	<li>
		如图7A所示，将探针-加强片组件安装到显微操作器上，方法是将加强片背面的标签区域粘附至显微操作器臂上。可使用双面胶带或胶水固定，但需注意避免粘合剂接触探针。使用一小块粘性橡皮暂时将探针的连接端固定在显微操作器上，以便后续以较小的力轻松取下。</li>
	<li>
		将探针组件定位至目标区域上方，并以所需的插入速度插入探针。在本方案开发过程中，采用的插入速度为0.13–0.5 mm/s。</li>
	<li>
		在聚乙二醇（PEG）开始溶解之前，立即轻柔地将探针的连接端从显微操作器上取下，并将其放置在附近的支撑面上，例如另一操作器臂上（图7B）。此步骤必须在PEG溶解前完成，以避免探针发生位移。</li>
	<li>
		留出足够时间使PEG完全溶解。所需时间取决于PEG的分子量以及探针与加强片之间的接触面积。例如，当PEG分子量为10,000 g/mol，微电极探针长度约为6 mm，匹配的加强片宽度为306 μm时，15分钟已被证实为足够的时间。本方案第3节提供了一种测试所需溶解时间的方法。在此期间，使用滴管在标签区域和插入点周围滴加磷酸盐缓冲液（PBS），以溶解位于目标区域上方的任何残留PEG（图7C）。</li>
	<li>
		使用电动微位移装置，以5 mm/s的速度施加100 μm的位移，开始提取加强片。初始的快速运动有助于克服可能存在的静摩擦力，从而最小化探针的位移。随后，以约0.1 mm/s的较慢速度完成加强片的提取过程（图7D）。</li>
	<li>
		在实际手术情况下，继续按照常规操作，在插入部位涂抹凝胶、硅胶和/或牙科丙烯酸树脂，以固定和保护探针，具体操作如文献21所示。</li>
</ol>

	3. 琼脂糖凝胶实验

	本方案的这一部分描述了一种用于检测在0.6%琼脂糖凝胶中提取加劲材料的装置和操作步骤，该凝胶的总体力学性能、pH值和盐度近似于脑组织17,22。由于凝胶在短距离内几乎透明，因此可以观察到加劲材料的分离以及探针的位移。
<ol>
	<li>
		配制 0.6% 琼脂糖的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。加热搅拌至琼脂糖粉末完全溶解。将溶液倒入浅层丙烯酸盒中，凝胶厚度应为 3/4–1 英寸。室温下静置 1 小时，使凝胶充分凝固。</li>
	<li>
		确保固化后的凝胶充分浸润 PBS，防止干燥，并将凝胶加热至 37 °C。</li>
	<li>
		按照图8所示，安装显微操作仪、琼脂糖凝胶盒和显微摄像系统。</li>
	<li>
		将玻璃参考标记物插入凝胶盒中，将其沿凝胶与盒壁之间滑入（图8）。使用牙科探针调整参考标记物上的特征，使其与数字显微镜的视野对齐。</li>
	<li>
		按照步骤 2.1 所述，将探针组件安装到显微操作仪上。</li>
	<li>
		将探针组件置于凝胶上方，位于参考标记物后方约 1 mm 处。</li>
	<li>
		插入探针进入凝胶，利用摄像头引导其到达视野中所需的深度。</li>
	<li>
		立即将探针的连接端放置在附近的支撑表面上。</li>
	<li>
		根据需要调整摄像头图像以聚焦探针（参考标记物的特征可能略微失焦）。拍摄探针位置的快照。</li>
	<li>
		让 PEG 溶解（溶解时间可能有所不同，实际上可作为待测试的参数）。在标签附近加入 PBS，以溶解凝胶上方的 PEG。</li>
	<li>
		如需记录，开始视频采集，并按照步骤 2.5 所述开始刚性支撑体的提取。提取完成后，拍摄最终的探针位置快照。</li>
	<li>
		使用图像处理工具比较提取刚性支撑体前后的图像。利用视野中可见的参考标记物特征对图像进行配准（对齐）。根据探针上已知特征的尺寸校准图像比例尺，测量探针的位移距离。</li>
</ol>

<ol><li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li>
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<li>Parylene microprobes with engineered stiffness and shape for improved insertion. Egert, D., Peterson, R. L., Najafi, K. Proceedings of Transducers '11, Beijing, China, , (2011).</li>
<li>Lee, K. -K., He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyimide-based+intracortical+neural+implant+with+improved+structural+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Polyimide-based intracortical neural implant with improved structural stiffness.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 14, 32-37 (2004).</li>
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<li>Lewitus, D., Smith, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+resorbing+polymers+for+use+as+carriers+for+cortical+neural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Ultrafast resorbing polymers for use as carriers for cortical neural probes.</a> Acta Biomaterialia. 7, 2483-2491 (2011).</li>
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<li>Ware, T., Simon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+responsive%2C+softening+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of responsive, softening neural interfaces.</a> Advanced Functional Materials. 22 (16), 3470-3479 (2012).</li>
<li>Harris, J. P., Capadona, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+adaptive+intracortical+implants+improve+the+proximity+of+neuronal+cell+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanically adaptive intracortical implants improve the proximity of neuronal cell bodies.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 1-13 (2011).</li>
<li>Kozai, T. D. Y., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+shuttle+with+carboxyl+terminated+self-assembled+monolayer+coatings+for+implanting+flexible+polymer+neural+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Insertion shuttle with carboxyl terminated self-assembled monolayer coatings for implanting flexible polymer neural probes in the brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 199-205 (2009).</li>
<li>Bjugstad, K. B., Lampe, D. S., Kern, D. S., Mahoney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+poly%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels+in+the+brain%3A+An+analysis+of+the+glial+response+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of poly(ethylene glycol)-based hydrogels in the brain: An analysis of the glial response across space and time.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (1), 79-91 (2010).</li>
<li>Greenwalk, R. B., Choe, Y. H., McGuire, J., Conover, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+drug+delivery+by+pegylated+drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effective drug delivery by pegylated drug conjugates.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 217-250 (2003).</li>
<li>Effects of adsorbed proteins and an antifouling agent on the impedance of silicon-based neural microelectrodes. Sommakia, S. S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Proceedings of the 31st Annual IEEE EMBC International Conference, , 7139-7142 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., Stoetzner, C. R., Richner, T., Brodnick, S. K., Williams, J. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Implantation+of+Chronic+Neural+Electrodes+for+Recording+Single+Unit+Activity+and+Electrocorticographic+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals.</a> J. Vis. Exp. (60), e3565(2012).</li>
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<li>Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive. Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, , 871-874 (2012).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文所述方法提供了一种可控性良好的工艺，用于通过生物可降解粘合剂将薄膜聚合物探针固定在独立的支撑层上。同时介绍了实施这些可移除支撑层的推荐外科手术操作流程，以及验证该操作的技术。 体外 对于给定的探针-加强件构型。由于加强件可被制成任意刚性，该方法可促进相对较长探针的插入&gt;3 mm）。因此，该插入方法有望成为深部脑刺激（DBS）、脊髓刺激和外周神经接口等应用中的关键技术。

	具有吸液通道的新型加固件及基于倒装芯片的组装工艺适用于多种材料和探针构型。从几何结构上看，加固件无需与探针的 footprint 完全匹配，例如，其宽度可小于探针。加固件的厚度也可根据需要变化。尽管本文描述的加固件由硅材料制成，但使用其他材料可能在某些应用中实现更理想的机械性能。该组装工艺同样适用于其他类型的液态粘合剂。聚乙二醇（PEG）因其可多次固化和再熔化的特性而特别易于操作。对于不具备此特性的其他液态粘合剂，组装步骤可能需要相应调整。PEG 的分子量也可选择不同规格。较高分子量的 PEG 溶解时间更长，这在手术过程中可能更具优势。探针与加固件之间的接触面积也会影响探针插入后粘...

微电极阵列是神经科学以及假肢等新兴临床应用中的重要工具。特别是穿透式微电极探针，可通过与大脑、脊髓及外周神经中的细胞紧密接触，实现对神经元活动的刺激与记录。植入式神经探针面临的主要挑战之一，是其刺激与记录功能的稳定性与长期有效性。关于微电极探针与神经组织相互作用的建模与实验研究表明，探针与组织之间微小的相对运动可能导致神经组织发生微撕裂，从而成为功能退化的一种机制1-3。一种解决方案是制备柔性探针，使其整体刚度更接近神经组织的力学特性，从而最大限度地减少相对微动。因此，聚酰亚胺和派瑞林等生物相容性薄膜聚合物已被广泛采用作为微电极探针的理想基底材料4-8。

柔性探针的一个权衡之处在于其难以插入神经组织。研究人员已采用多种方法来促进柔性探针的植入，同时保持其理想的力学性能。一类设计通过改变聚合物探针的几何结构，使某些部分或轴向增加刚度，而在其他区域仍保持柔顺性。这一目标已通过引入加强筋或其他材料的层来实现9,10。另一种方法是在聚合物探针结构中集成一个三维通道，并填充可生物降解材料11。该探针可在植入前暂时增强刚性，植入后通道内的材料会溶解并排出。然而，此类永久性改变最终植入器件几何结构的方法可能会削弱柔性探针某些理想的特性。

	一种不改变最终探针几何形状的方法是用可生物降解材料包裹聚合物器件，以暂时增加器件的刚度12-14。然而，典型的可生物降解材料的杨氏模量比硅低数个数量级，因此需要更大的厚度才能达到相同的刚度。对探针进行充分涂覆可能导致尖端更加圆钝，使插入更加困难。此外，由于可溶解涂层暴露在外，存在在接触组织时甚至在接近组织时立即溶解的风险。

	另一类方法采用新型探针基底材料，这类材料在植入组织后刚度会降低。此类材料包括形状记忆聚合物15和一种机械自适应纳米复合材料16。这些材料在插入后能够显著降低其弹性模量，从而使得探针更接近神经组织的力学特性。然而，其可实现的刚度范围仍然有限，因此可能无法达到与硅或钨丝相当的高刚度。因此，对于非常长（例如 &gt;3 mm）或刚度极低的柔性探针，可能仍需要采用临时连接更刚性支撑体的方法。

	另一种已报道的有前景的方法是，在刚性递送载体上涂覆一层永久性的自组装单分子层（SAM），以定制载体与柔性探针之间的表面相互作用17。在干燥状态下，探针通过静电作用吸附在涂覆后的载体上。插入后，水分子迁移到亲水性表面，使探针与载体分离，从而可将载体抽出。已有研究实现了探针位移减小的载体抽出（85 μm）。然而，由于仅依靠静电相互作用将探针固定在载体上，在插入前和插入过程中探针相对于载体存在一定的滑移风险。

	我们开发了一种方法，将柔性探针通过一种临时性的生物可降解粘合材料固定在刚性支撑体上，从而在插入过程中牢固地固定探针。所用探针由聚酰亚胺制成，其弹性模量约为 2–4 GPa。刚性支撑体由硅制成，弹性模量约为 200 GPa。当两者结合时，硅的刚度占主导地位，有利于探针插入。一旦探针插入组织后，粘合材料溶解，随后抽出刚性支撑体，使探针恢复其原有的柔韧性。我们选用聚乙二醇（PEG）作为生物可降解粘合材料。PEG 已被应用于神经探针、组织工程和药物递送等植入式场景11,18,19。一些研究表明，PEG 可能在脑组织中减弱神经炎症反应18,20。与其他可能的材料（如蔗糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA））相比，PEG 在生物液体中的溶解时间尺度更适合多种植入手术（通常为数十分钟，具体取决于分子量）。此外，PEG 在室温下呈固态，在 50–65 °C 温度范围内呈液态。这一特性使其特别适用于我们的精密组装过程。而且，与文献17中描述的自组装单层膜（SAM）类似，溶解后的 PEG 具有亲水性，有助于刚性支撑体的抽出。这一优势得益于一种新颖的刚性支撑体设计和系统化的组装工艺，可确保粘合剂均匀覆盖，并实现精确且可重复的对准。除了组装工艺外，我们还介绍了在手术过程中实施可移除刚性支撑体的方法，以及一种用于评估支撑体抽出效果的体外实验流程。

	本文所述方案假设使用者已具备一种柔性聚合物微电极探针。关于制备探针增强件及其与增强件组装的方案部分，需具备微加工实验室中常见的工具。而与插入和取出操作相关的方案则可能在神经科学研究实验室中进行。

<table><tbody><tr><td>聚乙二醇，10,000 g/mol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309028</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>柔性亚微米级芯片贴合机</td><td>Finetech</td><td>Fineplacer lambda</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>KOPF</td><td>1760-61</td><td></td></tr><tr><td>数字显微镜</td><td>Hirox</td><td>KH-7700</td><td></td></tr><tr><td>双光源转塔式变焦镜头</td><td>Hirox</td><td>MXG-2500REZ</td><td></td></tr><tr><td>精密电动执行器</td><td>Newport</td><td>LTA-HS</td><td>配 CONEX-CC 控制器</td></tr></tbody></table>

使用可生物降解粘合剂固定刚性支撑体插入柔性神经探针

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

用于神经接口装置的微电极阵列若由生物相容性薄膜聚合物制成，因其柔性材料可减轻因微小运动引起的组织不良反应，预期可延长功能寿命。然而，其柔韧性也导致难以准确插入神经组织。本文展示一种方法：使用可生物降解的聚乙二醇（PEG）将柔性微电极探针暂时固定于刚性加固片上，以实现探针的精确定位和手术植入。独特的加固片设计可使PEG粘合剂沿探针长度方向均匀分布。倒装芯片键合（flip-chip bonding）是微电子封装中常用的技术，可实现探针与加固片之间精确且可重复的对准与固定。探针与加固片共同进行手术植入后，让PEG自然溶解，随后移除加固片，使探针留置于目标位置。最后，一种 体外 测试方法用于评估在脑组织的琼脂糖凝胶模型中加强件的提取。该植入方法已被证明对较长的柔性探针尤为有利&gt;3 毫米）。该方法还为植入双面柔性探针提供了一种可行方案。迄今为止，该技术已被用于获取多种 在体 记录大鼠皮层的数据。

该插入技术与劳伦斯利弗莫尔国家实验室（LLNL）的薄膜聚酰亚胺探针联合使用，此类探针已通过ISO 10993生物相容性标准，适用于长期植入。一种典型的薄膜聚酰亚胺探针如图1所示，图中还包含一个硅质背衬，其窄部长度约为10 mm。该背衬沿长度方向设有一条毛细引液通道，如图2所示。图3展示了利用微加工工艺在硅材料上制备该背衬的过程。图4显示了通过倒装芯片键合系统的摄像头观察到的、放置于标签区域储液槽中的固体聚乙二醇（PEG）颗粒。当利用倒装芯片键合设备基座阶段内置加热器加热后，PEG熔化并开始通过毛细作用进入通道。通过摄像头观察，可实时监测毛细填充过程，直至PEG完全填满通道；使用分子量为10,000 g/mol的PEG时，该过程耗时约一小时。随后，PEG重新固化，并将探针与背衬按图5所示方式安装至倒装芯片键合系统中。图9A展示了探针与背衬对准并粘接后的俯视图，其中PEG完全填充了界面。图9B显示了一个...

通过将柔性神经微电极探针与聚乙二醇（PEG）刚性支撑体连接，可实现探针的植入。一种独特的组装工艺可确保连接的均匀性和可重复性。探针插入组织后，PEG 溶解，随后将支撑体抽出。 体外 测试方法在琼脂糖凝胶中评估该技术。

用于神经接口装置的由生物相容性薄膜聚合物制成的微电极阵列有望延长功能寿命……

本实验的总体目标是利用临时性刚性支撑物，将柔性薄膜神经探针植入组织中。首先设计并制备与探针匹配的定制硅基刚性支撑物，其内部通道填充可溶解的聚乙二醇；第二步是使用倒装芯片键合机将该支撑物与探针进行组装。接下来，将刚性化的探针组件插入目标组织。最后一步是让聚乙二醇溶解并抽出探针杆。最终，该方法可用于将柔性微电极探针植入神经组织，以进行体内记录和刺激。该技术在神经系统疾病的临床治疗中具有重要意义，因为可移除的刚性增强层能够实现柔性的植入式器件，从而减少不良的组织反应。与现有的软化材料等方法相比，该技术的主要优势在于能够精确插入任意长且细的探针。利用绝缘体上硅晶圆制备带有吸液通道的硅质刚性增强层，其中器件层的厚度应等于所需增强层的厚度。使用标准博世工艺在等离子体刻蚀机中干法刻蚀导流通道。然后通过较长的边缘定义加强筋轮廓，该边缘停止在埋氧层上。现在用49%氢氟酸湿法刻蚀埋氧层，以释放加强筋。然后将释放加强片浸泡在去离子水中15分钟。接着将一粒聚乙二醇放入储液池中，位于加强片的标签处。将增强片加热至 65 摄氏度，使聚乙二醇熔化并通过毛细作用吸入通道中，然后冷却至室温使其固化。将增强片倒置放置在倒装芯片键合机的基底平台上。然后使用工具头拾取补强板。接着，利用倒装芯片键合机将探针倒置放置在基底平台上。对准补强板与探针。然后将加强件放至探针上。将组件加热至65摄氏度，持续一分钟，使聚乙二醇重新熔化，从而将加强件粘附到探针上。随后冷却使其固化，翻转组件，从顶部检查并再次加热至65摄氏度，使聚乙二醇完全填充探针与加强件之间的界面。将探头朝上，在标签区域额外熔化一到三个聚乙二醇小球，以对该区域提供额外加固。最后，让组件冷却，使聚乙二醇固化，组件即可用于外科植入。在丙烯酸盒中，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制0.6%琼脂糖凝胶，用PBS饱和凝胶，并加热至37摄氏度。然后安装琼脂糖凝胶的显微操作仪装置盒和显微成像系统。将一根带有玻璃参考标记物的探针插入凝胶装置盒中。接着，使用牙科探针调整参考标记物的特征，使其与数字显微镜的视野对齐成正方形。将探针加强片组件安装到显微操作器时，将加强片标签的背面粘附到可夹紧在显微操作器上的固定装置上，注意避免将粘合剂接触到探针。使用少量粘性橡皮暂时固定探针连接端至固定装置，使其可轻松移除。将探针组件置于凝胶上方，位于参考标记后方约一毫米处。然后使用摄像头引导，将探针插入凝胶中，到达视野内所需深度。立即从显微操作器上取下探针的连接端，并将其固定在附近的表面上，例如第二个操作器臂上。此操作必须在标签上的聚乙二醇开始溶解之前完成。为避免探针移位，需先拍摄探针位置的快照。请注意，参考标记特征可能略微失焦。在标签附近添加生理盐水，以溶解位于aros凝胶上方的聚乙二醇；若需要，可在标签处开始视频采集。现在开始通过施加100微米的位移以每秒5毫米的速度提取加强件。然后以

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