Name: 粘附细胞用惰性气体喷射的透 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解利用惰性气体喷射技术对贴壁细胞进行可逆性通透化处理的方法。该技术通过机械力破坏细胞膜，实现遗传物质和生物大分子的高效递送，适用于细胞生物学与基因工程研究。

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作者感谢以下资助来源：加拿大卫生研究院（CIHR）、自然科学与工程研究理事会（NSERC）。

1. LabView 程序的开发
<ol>
	<li>将质量流量控制器（MKS M100B Mass-Flo Controller）连接至氦气管路，以确保精确的气体流速。该设备通过0至5 V的输入电压进行控制。LabView程序中的控制回路确定任意时刻所需的电压值。计算机与质量流量控制器之间的通信通过数据采集设备（NI USB-6009）实现，同时由12 V电源为质量流量控制器供电。</li>
	<li>使用两个线性定位滑台来控制6孔板在两个方向上的移动。每个滑台组件由MA15系列Velmex Unislide滑台与一个步进电机组成，两个组件均由一个Velmex VXM步进电机控制器统一控制。该控制器支持手动调节每个电机，也可接收外部串行指令字符串，二者结合可实现特定的运动模式。多种运动模式可预先编程至LabView程序中，用户仅需输入所需的火炬移动速度及路径尺寸即可。</li>
</ol>
2. 仪器设备的准备
<ol>
	<li>打开氦气瓶和减压阀。</li>
	<li>开启电机控制器。</li>
	<li>启动 LabView 程序并确认所有条件正常。</li>
	<li>确保平台处于中心位置。检查方法是观察每个电机滑台，确认每个滑块均未接近滑台任一端。可通过程序自动居中滑块，或手动使用电机控制器前面板上的点动控制进行调整。</li>
	<li>若为当日首次运行，建议在不放置细胞的情况下先运行一次程序，以确保系统设置工作正常。</li>
</ol>
3. 气体喷流毛细管喷嘴高度的制备
<ol>
	<li>从支架上取下毛细管，并将高度刻度盘归零。</li>
	<li>将6孔板放置在平台上。</li>
	<li>重新安装气体喷射毛细管，并将其下移至孔底，直至接触盖玻片。将毛细管固定在支架中。</li>
	<li>使用高度刻度盘将毛细管向上调节3 mm。在毛细管底座上标记此高度。</li>
	<li>将毛细管升至安全高度，然后取下6孔板。</li>
</ol>
4. 细胞通透化实验方案
<ol>
	<li>采用标准培养技术，在6孔板中的玻璃盖玻片上培养贴壁细胞系至汇合。对于HeLa细胞，每孔接种2 × 105个细胞，处理前孵育48小时。</li>
	<li>配制含有目标载体的适当体积溶液。对于hrGFPII-1，使用50 ng/μl的浓度溶于1×PBS中，在转染后24小时可在HeLa细胞中获得较强的荧光信号。对于葡聚糖实验，建议使用80 μg/ml的10 kDa绿色荧光葡聚糖。此后，该溶液将被称为&#34;载体溶液&#34;。</li>
	<li>从孔中移除细胞培养基，并用1×PBS冲洗三次。</li>
	<li>将步骤4.2中配制的1,370 μl载体溶液加入孔中。液体深度应约为1.3 mm。</li>
	<li>将含有载体溶液的孔置于平台中央。将气体喷嘴下降至先前标记的位置，使喷嘴高度位于盖玻片上方3 mm处。</li>
	<li>在LabView程序中设定氦气流速，并选择所需的运动模式。准备就绪后点击&#34;运行&#34;以开始通透化程序。此时会有一段初始延迟，期间质量流量控制器正在调节至所需流速。一旦达到设定流速，LabView程序将启动步进电机，使孔按预设的通透化模式移动。平台停止后，等待约30秒，然后移除载体溶液。注意：最佳通透化效果通常出现在喷嘴出口处动态压力为100至200 Pa时，具体数值取决于毛细管直径。</li>
	<li>用1×PBS洗涤孔三次。</li>
	<li>向孔中加入新鲜培养基。</li>
	<li>根据实验需求重复步骤4.3至4.6。注意：务必设置对照样本，即向孔中加入载体溶液但不开启气体喷射。对照组孔中的溶液应保留约1分钟，随后进行步骤4.5和4.6。</li>
	<li>若进行hrGFP转染实验，将6孔板放回培养箱孵育24小时，以使细胞完成转染物质的转录。若进行葡聚糖通透化实验，则将6孔板放回培养箱孵育15分钟。</li>
</ol>
5. 细胞成像
<ol>
	<li>如需评估细胞死亡情况，可在成像前立即使用适当的活/死细胞染色剂进行复染。</li>
	<li>使用合适的显微镜对细胞成像，以评估转染/通透化效率。</li>
</ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

惰性气体射流透化是一种用于贴壁细胞转染的有效技术。该技术利用机械力将生物分子导入细胞，无需使用可能有害的化学试剂或病毒载体。该方法有望为研究人员和临床医生提供一种高效且相对简单的精确转染细胞的手段。其透化过程具有独特的选择性，允许研究人员仅对单个菌落中的特定细胞进行处理，这在多种应用中具有重要价值。
可根据具体实验需求调整多个参数，例如毛细管喷嘴直径和角度、气体流速、液体和毛细管高度、细胞系、目标生物分子以及惰性气体的种类。本方案中已指定固定的液体液位和毛细管高度，这些数值的选择旨在尽量减少实验中涉及的变量数量。目前，我们正在通过实验流动可视化和计算流体动力学对系统进行建模。这将帮助我们更深入地理解作用于细胞的力，从而确定通透化作用对液体性质等变量的依赖关系。
必须注意细胞能够存活的最大动态压力。研究发现，当气体射流喷嘴高度为 3 mm 时，一旦动态压力接近 200 Pa，HeLa 细胞就可能发生剥离。这一结果与其他研究一致，例如 Lu et al. 观察到 WT NR6 成纤维细胞在 200–265 Pa ...

随着生物医学的发展以及对细胞力学理解的深入，将生物分子递送至细胞内已成为众多研究领域和医学治疗中的关键环节。目前已开发出多种技术，用于将外源分子穿过质膜导入细胞质中。这些技术通常可分为病毒类、化学类或机械类方法。病毒技术利用病毒载体将RNA和DNA等遗传物质导入细胞1。该方法在某些细胞系中转染效率较高，但可能引发免疫反应和炎症反应2。常见的化学转染方法包括磷酸钙沉淀法3、细菌外毒素法4以及脂质体转染法（lipofection）5。这些技术已被证实有效，但仍存在细胞毒性及非特异性等问题。此外，磷酸钙沉淀法在某些细胞系中的转染效率可达70%，但在原代细胞中极少成功6。这一点尤为重要，因为当前越来越多的研究聚焦于原代细胞，尤其是在开发多种临床治疗方案以及研究DNA功能的过程中。
通过机械刺激暂时破坏细胞膜是将外源分子导入细胞的一种替代方法。技术包括：分子显微注射7，利用电场破坏细胞膜的电穿孔技术8,9，利用超声波进行声孔效应以破坏细胞膜10-12，如本实验所示的粒子轰击法 &#34;基因枪&#34;，可将携带基因的微粒射入细胞13，以及最近应用的流体剪切应力，已被证明可暂时性地增加哺乳动物细胞的通透性14,15尽管机械方法可以避免前述部分问题，但通常伴随着较低的效率以及非常复杂且专用的装置。麦吉尔大学开发了一种常压辉光放电等离子体炬（APGD-t），其最初目标是实现表面功能化及分离贴壁细胞 体外16偶然发现，一种活/死染色试剂在未添加透化剂的情况下被细胞吸收。进一步观察发现，这种现象仅出现在孔板的特定区域，恰好与等离子炬的路径相吻合。随后，我们继续研究了大气压辉光放电等离子体（APGD-t）的透化能力；在对照实验中发现，未激发的等离子体载气惰性气体射流本身也能够实现细胞透化。这一结果与最初的假设相矛盾，即等离子体射流产生的活性物质会暂时破坏细胞膜功能；相反，结果表明仅机械力就足以引起细胞透化。基于此，我们实验室进一步开展了研究，旨在定量表征惰性气体射流的透化效率，并评估其转染能力。16.
通过这些研究发现，血浆膜上确实会形成微孔，且这些微孔通常在约5秒内重新封闭。15我们已证明了该技术的实用性 体外 和 体内 鸡胚的尿囊绒毛膜中

<table><tbody><tr><td>活力型 hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>用于 HeLa 细胞转染实验的绿色荧光蛋白</td></tr><tr><td>葡聚糖，AlexaFluor 488 标记；10,000 MW，阴离子型，可固定</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>用于通透性实验的葡聚糖</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>用于哺乳动物细胞的复染</td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>成像时用于载玻片封片</td></tr><tr><td>超高纯度氦气</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM 高糖培养基 - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>用于 HeLa 细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>用于 DMEM 培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（液体）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>用于 DMEM 培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 1&lt;/strong&gt;。所需试剂列表</td></tr><tr><td>6 孔透明 TC 处理培养板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI 尺寸信息</td></tr><tr><td>内径 (mm)：1, 0.86, 0.68, 0.5 订货号：1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo 流量控制器</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>质量流量控制器，M100B 系列，需外接 12 V 电源</td></tr><tr><td>USB-6009 数据采集设备</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带步进电机及控制器的 UniSlide 装置</td><td>Velmex</td><td></td><td>两套 MA15 系列 UniSlide 装置，配备由 Velmex 提供的 Vexta 1.8&amp;deg; 步进电机，并由 VXM 步进电机控制器控制</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;表 2。&lt;/strong&gt; 所需设备列表</td></tr></tbody></table>

使用惰性气体射流对贴壁细胞进行透化处理

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

存在多种细胞转染技术，可 broadly 分为三大类：病毒法、化学法和机械法。本方案描述了一种利用惰性气体射流对贴壁细胞进行瞬时通透化处理的机械方法，该方法可促进通常不可穿透的大分子物质进入细胞。我们认为该技术的作用机制是通过对贴壁细胞的质膜施加剪切力，从而暂时形成微孔。一旦微孔形成，细胞即对遗传物质及其他生物大分子具备通透性。然而，所涉及的机械力存在导致细胞永久性损伤或从基质上脱落的风险。因此，该技术的有效性仅存在于较窄范围的惰性气体动力学参数内。已有研究表明，惰性气体射流可高效实现多种贴壁细胞系的通透化处理，包括 HeLa、HEK293 和人腹主动脉内皮细胞。本方案适用于贴壁细胞的通透化处理，既可用于 体外 并且，正如我们已证明的那样， 体内，表明其可用于研究，并可能在未来具有临床应用潜力。此外，它还具有以空间限制方式使细胞通透的优势，可能成为一种有价值的研究工具。

使用内径为0.86 mm毛细管的氦气射流对HeLa细胞进行通透化处理，并以10 kDa绿色荧光葡聚糖标记，结果如图1所示。通透化处理后立即用2 μl/ml的EthD-1溶液（LIVE/DEAD活力/细胞毒性检测试剂盒）对细胞进行复染，以显示细胞死亡情况。复染完成后立即封片并进行成像。本图展示了在三种不同出口压力下使用氦气射流处理的结果，并与对照样本进行了比较。可见，随着动态压力升高，通透化轨迹宽度和通透效率均增加，而细胞死亡率仅略有上升（A和B）。然而，当动态压力过高时，HeLa细胞会从盖玻片上被剥离，导致周边区域通透化效果显著减弱。关于细胞剥离与转染效率的更详细分析此前已由Chouinard-Pelletier et al.15开展。
通过扫描电子显微镜观察，在细胞膜中发现了微孔（图 2）。使用内径为 0.86 mm 的毛细管，在出口压力为 300 Pa 的条件下，以氦气射流对 HeLa 细胞进行穿孔处理。完成穿孔...

本方案描述了一种利用惰性气体射流对贴壁细胞进行暂时性透化的方法。该技术通过机械力破坏细胞质膜，从而促进遗传物质和生物分子转入贴壁的哺乳动物细胞中。

存在多种细胞转染技术，可 broadly 分为三大类：病毒法、化学法和机械法。本方案描述……

本实验的总体目标是使贴壁细胞通透化。首先，在六孔板中的盖玻片上培养实验细胞，以实现这一目标。第二步是用1×PBS冲洗细胞，并加入含有待转入细胞的生物分子的溶液覆盖细胞。接下来，用惰性气体气流吹扫。样品穿透细胞。最后一步是根据需要对细胞进行固定和染色。最终，免疫荧光显微镜用于检测通透效率和细胞活力。与现有的增殖法或基因枪法相比，该技术的主要优势在于操作简便，并可实现对贴壁细胞的空间限制性通透。在培养过程中，通常初学者可能会遇到困难，因为需要花费一定时间优化特定参数（如气体流速或毛细管直径），以在其特定应用中实现高效的通透。本实验所用的质量流量控制器需要外部 12 vol 电源供电，并连接至氦气气路，以确保精确的气体流速。质量流量控制器与计算机之间的通信通过数据采集设备实现。该装置由 0 至 5 伏的输入电压控制。LabVIEW 程序中的控制回路可确定任意时刻所需的电压值。使用两个定位线性滑轨来控制六孔板在两个方向上的移动，每个方向各一个。每个组件由一个 MA 15 系列 Velm X uni 滑轨组件与一个步进电机耦合而成，两个组件均由一个 VELM XVXM 步进电机控制器统一控制。该控制器支持手动点动每个电机，也可接收外部串行指令字符串。这些组合可实现特定的运动模式。可在LabVIEW程序中预设多种运动模式，用户只需提供所需的焊枪速度以及路径尺寸。通过打开氦气瓶和减压阀，并开启电机控制器，开始设备的准备工作。打开实验室视图程序并确认所有条件。接着，确保平台已居中以进行检查。观察每个电机平台，确认每个滑座均未靠近任一端点，然后通过程序将滑座居中。如果这是当天的第一次实验，建议在不加细胞的情况下先运行一次程序，以确保装置工作正常。为调节气体喷射毛细管喷嘴的高度，需先将毛细管从夹持器中取出，并将高度刻度盘归零。然后将六孔板放置于平台上。更换气体喷射毛细管，并将其下放至孔的底部，直至接触盖玻片。使用高度调节旋钮将毛细管固定在支架上。将毛细管向上提升三毫米，并在毛细管底座上标记此高度。最后，将毛细管升至安全高度，然后移除六孔板。本方案所用的贴壁细胞系应采用贴壁细胞的标准培养技术，在六孔板中的玻璃盖玻片上培养至完全汇合。每个六孔板每孔接种 2 × 10⁵ 个细胞，处理前孵育 48 小时。在处理当天，配制含有目标载体的适当体积溶液。对于葡聚糖研究，建议使用每毫升80微克的10千道尔顿绿色荧光葡聚糖，即1/4稀释。该溶液将被称为载体溶液。从孔中移除细胞培养基，用1 mL PBS冲洗三次，然后向孔中加入370微升的载体溶液。液体深度应约为1.3毫米。将含有载体溶液的孔置于平台中央。将气体喷嘴降低至先前标记的位置，使喷嘴高度位于载玻片上方三毫米处。在LabVIEW程序中设置氦气流速，并选择所需的运动模式。点击运行。当准备开始渗透实验流程时，会有一个初始的延迟阶段，此时质量流量控制器正在准备提供所需的流速。为了确保该实验流程的成功，优化流动条件以最小化细胞深度和细胞脱落至关重要。一旦达到适当的流速，LabVIEW 程序将启动步进电机，使孔板按照预设的渗透模式移动。当平台停止后，从平台上取下六孔板。等待约 30 秒，然后移除载体溶液。用 PBS 洗涤孔板三次。第三次洗涤后，向孔中加入新鲜培养基。根据所需实验次数重复渗透实验方案。务必设置对照样品，即在孔中加入载体溶液但不进行气体喷射处理。在移除溶液前，将溶液在对照孔中保留约一分钟。用 PBS 清洗细胞，并向孔中加入新鲜培养基。将六孔板放回培养箱中，在葡聚糖渗透孵育的情况下孵育 15 分钟。随后，使用合适的显微镜对细胞成像，以检测渗透效率。图中显示了使用内径为 0.86 毫米的氦气喷射流处理海拉细胞后，10 千道尔顿绿色荧光葡聚糖进入细胞的结果。毛细管面板 A、B 和 C 展示了在三种不同出口压力下运行氦气喷射流的实验结果，面板 D 为对照组，其中加入了葡聚糖但未暴露于氦气喷射流。细胞在透化后立即进行复染，以显示细胞死亡情况。在这些图像中，葡聚糖发出绿色荧光，而死亡细胞发出红色荧光。在图A和图B中观察到，随着动态压力的升高，渗透轨迹的宽度和效率增加，而细胞死亡率仅有轻微上升。然而，当达到图C所示的高动态压力时，HeLa细胞从盖玻片上脱落，通过扫描电子显微镜观察发现，周边渗透现象极少发生。在细胞膜上观察到微孔的形成。在此示例中，使用内径为0.86毫米、出口压力为300帕斯卡的氦气喷射装置对HeLa细胞进行穿孔处理，并在50,000倍放大倍数下获取扫描电子显微镜图像。图A显示对照样本，其细胞表面光滑；图B显示穿孔细胞的表面，可见一个直径为84纳米的孔。一旦掌握该技术，操作得当情况下应在15至30分钟内完成。操作完成后，可进行染色以评估其他因素，如细胞活力。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

粘附细胞用惰性气体喷射的透

本方案描述了一种用于上皮细胞与细菌同时且局部共培养的微流控共培养模型。该模型可用于研究不同可溶性分子信号在发病机制中的作用，以及筛选潜在益生菌菌株的有效性。...

用于研究可溶性信号介导相互作用的上皮细胞与细菌微流控共培养

使用标准喷墨打印机创建瞬时细胞膜孔

结合单分散液滴生成与细胞及颗粒的惯性有序排列，我们描述了一种在千赫兹速率下单个液滴内封装特定数量细胞或颗粒的方法。对于单颗粒和双颗粒液滴，该方法的封装效率是无序封装的两倍以上。...

高通量单细胞与多细胞微封装

我们采用等离子体增强化学气相沉积法，在多种材料的纳米级颗粒上沉积了厚度从几纳米到数百纳米的薄膜。随后通过刻蚀去除核心材料，形成中空纳米壳层，其渗透性由壳层厚度控制。我们表征了这些涂层对小分子溶质的渗透性，并证明这些屏障能够实现核心物质在数天内的持续释放。...

等离子体聚合中空颗粒的包封与渗透特性

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

细胞黏附性在生物材料研究和组织工程的多种方法中至关重要。本文介绍了一种利用湿化学法对重要聚合物聚四氟乙烯（PTFE）进行肽类表面修饰的逐步技术。...

湿化学法及聚四氟乙烯表面肽固定化以增强细胞黏附

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。...

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。...

一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

现有的双层培养模型无法实现功能性 体外 模拟研究 体内 微环境。利用聚乙二醇和氧化锌模板法，本方案描述了一种超薄仿生基底膜的构建方法，该基底膜具有可调控的刚度、孔隙率和生化组成，可高度模拟 体内...

超薄多孔弹性水凝胶作为双细胞共培养的仿生基底膜

报道了利用高分辨率光刻工具通过光降解水凝胶分离细菌细胞的方法。综述了该方法的关键实验步骤、结果及其优势。该方法能够从异质性菌群或种群中快速、低成本地分离出具有稀有或独特功能的目标细菌。...

光可降解水凝胶界面用于细菌筛选、选择与分离

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。...

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

了解利用惰性气体喷射技术对贴壁细胞进行可逆性通透化处理的方法。该技术通过机械力破坏细胞膜，实现遗传物质和生物大分子的高效递送，适用于细胞生物学与基因工程研究。

使用惰性气体射流对贴壁细胞进行透化处理

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