通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

本实验的总体目标是通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞。首先，使用灌注套管对肝组织中的血管进行插管，随后利用胶原酶对肝组织进行灌注和消化。

第三步是去除光泽膜囊，从而释放解离的肝细胞。最后一步是低速离心，以分离肝细胞。最终，可通过相差显微镜观察肝细胞，或通过免疫细胞化学法进行白蛋白染色来鉴定肝细胞，细胞活力和得率则通过台盼蓝排斥实验测定。

该方法的可视化演示至关重要，因为插管和消化步骤较难掌握。这是因为插管需要一定的技巧，而判断消化是否完成也较为困难。对于初次接触该技术的人员，本实验操作将由我实验室的技术员 Natalie Lun 进行演示。

在本演示中，我们将使用一段灯鱼肝脏来代替人肝组织。按照以下方式设置肝脏组织灌流所需的设备：调节水浴温度，使溶液到达肝脏组织时保持在37摄氏度。溶液一、二、三的适宜温度为41摄氏度，而用于夹套式玻璃冷凝器的溶液四则应保持在37摄氏度，以减少胶原酶活性的损失。在灌流开始前不久，打开供氧装置的气体调节阀。从病理学家处获取一段肝脏组织，理想情况下应具有大部分或完全完整的格利森囊，且仅有一个切割面。

将含有带孔滤膜的布氏漏斗上的肝组织块，需使用低流速灌注系统进行预灌注。具体操作为：将带有橄榄形头端的弯曲灌注套管插入肝组织切面较大的血管中，并用溶液一进行灌注。随着血液从肝脏中被冲洗出来，灌注充分的区域组织颜色会逐渐变浅。根据肝脏大小不同，所使用的套管数量也有所差异。

通常，对于重量在20克以下至80克以上的肝脏，应使用四到八根套管。选择套管的规格时，应确保其与血管紧密且牢固贴合。保留较小的血管开放，以便缓冲液从组织中排出。

现在，将蠕动泵的流速提高至每分钟 110 至 460 毫升。在整个流速范围内，若肝组织呈现较浅的颜色，则表明灌注效果良好。灌注速率应根据肝组织的大小进行调整，较大的肝脏需使用较高的灌注速率。

一般来说，对于不同重量的肝脏，每根插管以每分钟 44 毫升的平均灌注速度为宜。所选择的流速应使肝组织略微膨胀。灌注过程中用浸有生理盐水的纱布覆盖肝组织，以保持其湿润。

用一升溶液灌注组织，以冲洗掉肝组织中残留的血液。将灌注液更换为溶液二，继续灌注10分钟。随后，将灌注液更换为溶液三，用半升溶液进行灌注。

现在将灌注液更换为含有胶原酶的溶液四。以循环灌注方式持续灌注9至12分钟，或直至肝脏组织消化充分。在有光泽的包膜下，肝组织应呈现轻微破裂分离的状态。

用手术刀的钝端探查时，肝脏也应感觉质地变软。肝组织块的消化时间必须恰当，因为消化过度会导致肝细胞活力降低，而消化不足则会导致肝细胞产量减少。首先关闭蠕动泵，并将套管从肝组织块上移除。

然后将组织放入含有100至200毫升溶液的结晶皿中。五、小心地去除光泽囊膜，并轻轻振荡以释放细胞。如果存在灌注不良的区域，可使用手术刀切开这些区域，以释放其中的细胞。

在操作过程中根据需要添加更多溶液五，最终将溶液五的体积补至 500 毫升。现在将细胞悬液过滤两次。首先，将细胞通过 210 微米的尼龙滤网过滤至一个 1 升的锥形瓶中。

然后将细胞通过70微米的尼龙滤网过滤至一个1升的锥形瓶中。将细胞悬液均分为两份，分别倒入200毫升离心管中。随后在4摄氏度条件下，以72 ×g离心5分钟。

吸出上清液，并在细胞沉淀中加入约200毫升溶液，轻轻重悬。重复离心和重悬步骤三次。最后一次离心后，将细胞重悬于冷保存液中，最终浓度为每毫升200万至500万个肝细胞。可使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板准确测定细胞数量。

图中显示了来自 648 次分离的台盼蓝染色肝细胞。分离的人肝细胞平均活力为 77 ± 10%。通过免疫荧光法测定，肝细胞的平均得率为每克肝脏 13 ± 11 × 10⁶ 个肝细胞。通过绿色荧光标记白蛋白阳性染色确定肝细胞纯度，纯度为 94 ± 1%。

免疫荧光染色进行了四次，每次试验包含五个重复样本。相差显微镜显示了肝细胞的形态学特征，例如其较大的细胞体积和多边形形状。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用两步胶原酶灌注法分离人肝细胞。