Name: 氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 了解利用微流控装置对单个胰岛进行间歇性低氧预处理的定量调控方法。该技术通过实时显微成像监测钙信号与线粒体膜电位变化，为研究胰岛移植中的低氧损伤机制及改善移植效果提供新途径。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目R01 DK091526（JO）、美国国家科学基金会项目0852416（DTE）以及芝加哥糖尿病项目提供支持。

1. 小鼠胰岛的制备
<ol>
	<li>解剖 C57BL/6 小鼠，通过胶原酶消化和 Ficoll 密度梯度分离法分离胰岛。（参见文中引用的 JOVE 文章）2,3).</li>
	<li>在含有10% FBS、1%青霉素/链霉素和20 mM HEPES的RPMI-1640培养基中孵育胰岛&#160;培养皿（37 °C，5% CO₂）2分离后，将胰岛在实验使用前培养24小时。为确保结果稳定，应在1-2天内使用胰岛。</li>
</ol>
2. 制作微流控平台
<ol>
	<li>为每个器件层在透明光刻掩模上生成微结构几何图形：1）入口和出口，2）含葡萄糖灌注腔室（8 mm 直径 × 3 mm 高，150 μl）的葡萄糖微流控层，3）带微孔阵列（500 μm 直径，100 μm 深）的 200 μm 膜，以及 4）气体微流控层。</li>
	<li>制作入口和出口层时，将脱气并预混的 PDMS 倒入空白培养皿中，使其厚度达到 1.5 mm，并在 80 °C 下固化 2 小时。用打孔器打出直径为 2 mm 的输入/输出端口。</li>
	<li>制作葡萄糖微流控层时，在 4 英寸&#160;硅片上旋涂两层 350 μm 厚的 SU8-2150，形成单层 700 μm 厚的结构。
	<ol>
		<li>通过相应的光刻掩模对 SU8 进行紫外光曝光，显影后将微通道图案转移至 SU8 上，制得高度为 700 μm 的母模。</li>
		<li>将脱气并预混的 PDMS 倒在该母模上，高度达 3 mm，在 80 °C 下固化 2 小时。用剃刀片将 PDMS 切割成所需形状。</li>
		<li>打孔直径为 2 mm 的输入/输出端口，以及直径为 8 mm 的腔室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作带微孔阵列的 200 μm 膜时，将 SU8-2100 旋涂至 100 μm 厚度。采用相同的紫外光刻工艺，将微孔图案转移至该 100 μm 高的母模上。
	<ol>
		<li>将脱气并预混的 PDMS 以 900 rpm 转速旋涂在该母模上，持续 30 秒，随后在 80 °C 下固化 10 分钟。在第一层之上以相同条件旋涂第二层，最终形成厚度为 200 μm 且带有微孔图案的 PDMS 膜。</li>
		<li>通过该膜打直径为 2 mm 的输入/输出端口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作气体微流控层时，将 SU8-2100 旋涂至 100 μm 厚度。采用相同的紫外光刻工艺，将气体微流控图案转移至该 100 μm 高的母模上。
	<ol>
		<li>将脱气并预混的 PDMS 倒在该母模上，高度达 1.5 mm，并在 80 °C 下固化 2 小时。用剃刀片将 PDMS 切割成所需形状。</li>
		<li>通过该层打直径为 2 mm 的输入/输出端口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为键合多层结构，先用透明胶带清洁各层表面，进行电晕放电处理，然后手动按以下顺序对齐。
	<ol>
		<li>将带有微孔阵列且孔口朝上的膜键合至底部的气体层。</li>
		<li>将葡萄糖微流控层键合在微孔膜上方。</li>
		<li>将入口和出口层键合在最顶层，以封装整个器件。</li>
		<li>在器件顶部施加 1 kg 重物以增强键合强度，并在 100 °C 下烘烤 3 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向水相层注入水，然后将整个器件浸入水中进行漏液测试。随后，使用空注射器向气体层通入空气。</li>
	<li>对无泄漏的器件，通过水相层用 70% 乙醇灭菌，再用 PBS 缓冲液冲洗，并将器件储存在 4 °C 下待用。</li>
</ol>
3. 微量分配器设置
<ol>
	<li>准备2个微流体分配器、5 V和20 V直流电源以及数字I/O板，用于构建氧气混合与输送系统。
	<ol>
		<li>将微流体分配器的控制线连接至配套的驱动单元。</li>
		<li>将驱动单元连接至数字I/O板上对应Labview控制的端口。</li>
		<li>将5 V和20 V电源分别连接至驱动单元上对应的电源触点。</li>
		<li>将数字I/O板连接至笔记本电脑，以运行用于气体控制的Labview程序（见附录）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个微流体分配器连接至氮气源，另一个连接至含5% CO2的压缩空气源，两路气体压力均设定为2 psi。在进入微流控装置前，将两个分配器的输出端通过T型接头汇合。</li>
	<li>使用经过泄漏测试的装置，通过在5%至21%氧气浓度之间循环切换微流体分配器，表征氧气调节的瞬态响应，同时利用光纤氧传感器测量水中溶解氧浓度（参见设备清单及代表性结果）。</li>
</ol>
4. 显微镜设置
<ol>
	<li>将装置安装到倒置显微镜的加热载物台上。</li>
	<li>将0%和21% O2气体连接至装置，并使用氧气传感器进行校准。</li>
	<li>将葡萄糖微流控系统的输出端口连接至组分收集器。</li>
	<li>配制Krebs Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRB）：129 mM NaCl、5 mM NaHCO3、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1 mM CaCl2·2H2O、1.2 mM MgSO4·7H2O、10 mM HEPES（pH 7.35–7.40）、2 mM基础葡萄糖和5%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>在37 °C水浴中，分别用50 ml锥形管配制含2 mM和14 mM葡萄糖的两种缓冲液。</li>
	<li>连接蠕动泵，以250 μl/min的流速将缓冲液泵入管路，并使管路经过37 °C加热板后再进入微流控装置。</li>
	<li>为染色胰岛，将Fura-2 AM溶于DMSO，Rh123溶于100%乙醇，加入2 ml KRB中，使染料终浓度分别为5 μM和2.5 μM。</li>
	<li>用10 μl移液器吸取胰岛，在37 °C下与染料共同孵育30分钟。</li>
	<li>通过葡萄糖微通道入口将约20个胰岛加载至装置中，并通过从出口向入口回灌缓冲液的方式引导胰岛进入检测腔室。</li>
	<li>用缓冲液灌注胰岛10分钟，以洗去多余的染料。</li>
</ol>
5. 同时进行氧气和葡萄糖刺激实验
<ol>
	<li>使用KRB2建立5分钟的基础期，随后进行15分钟14 mM葡萄糖刺激，再用KRB2冲洗15分钟，完成一次葡萄糖刺激脉冲。</li>
	<li>记录Fura-2在340/380 nm激发波长下的信号以及Rh123在534 nm处的发射信号。</li>
	<li>每次实验前均需测量一次正常脉冲（14 mM常氧）作为对照。</li>
	<li>进行氧浓度调节（低氧/间歇性低氧）时，仅在刺激和冲洗步骤中施加缓冲液流动，其他步骤不流动，以尽量减少对系统的对流干扰。</li>
	<li>在葡萄糖出口处以1分钟为间隔收集流出液，用于ELISA胰岛素检测。</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该胰岛缺氧技术整合了多种模式，其中存在若干需要注意的故障排查要点。首先，分离的胰岛在培养过程中会因腺泡细胞释放的消化酶而持续降解和解体，因此将实验标准化为胰岛分离后的1至2天内进行，对于获得一致的结果至关重要。其次，在缺氧和间歇性缺氧期间，需停止水相流动，以防止层流与扩散界面处的对流清除效应，但这似乎限制了胰岛预处理的持续时间。未来可在水相通道中集成气体交换装置，以消除这种轻微的清除作用，同时仍允许在膜界面快速调节气体浓度。第三，在装载胰岛时，应小心地按相反顺序重新连接水相管路（先出口后入口），以避免截留气泡。最后，未来的装置可增加一个扇形分布的微流控分配器，有助于将胰岛簇分布至整个腔室底部，而腔室底部可设计成带有阵列式捕获口袋的结构。这种微流控分布与口袋阵列相结合，将有助于构建胰岛的空间阵列，从而实现高通量实验。
在本微流控胰岛缺氧技术出现之前，最快实现间歇性缺氧调节的方法是使用小型定制缺氧室并配合高压气体高流速通气，其周期为一至三分钟。然而，这些方法仅适用于整体动物实验，无法应用于单个胰岛水平的研究。此外，整体动物胰腺中实际达到的缺氧水平（在呼吸平衡后）存在不确定性，且无法在实...

动态低氧在生物学中具有重要意义，特别是对于胰岛移植而言
动态低氧是多种生物组织中重要的生理及病理生理参数。例如，氧气的变化是血管生成过程中一种强有力的发育信号。此外，低氧在空间和时间上的分布模式可调节HIF1-α，并在胰腺癌等疾病中发挥作用。低氧也是影响胰岛移植效果的混杂因素。最近，低氧的时间振荡或间歇性低氧（IH）已被证明在&#34;预处理&#34;胰岛方面具有益处1。然而，静态和瞬时低氧对胰岛生理功能的影响仍缺乏充分的理解和研究，主要原因是缺乏适当的工具来调控胰岛的微环境。
胰岛具有丰富的血管化 体内
胰岛是直径50–400 μm的球形内分泌细胞聚集体，包含负责葡萄糖稳态的β细胞和α细胞。当胰岛暴露于血液中的刺激性葡萄糖时，葡萄糖被摄取并进行糖酵解，从而产生ATP，进而打开ATP敏感性钾（KATP）通道，导致钙离子内流，从而触发胰岛素颗粒的胞吐作用。氧气对于驱动这一高度依赖代谢的过程至关重要，除葡萄糖浓度梯度外，血流动力学和氧气供应情况也显著影响胰岛素的分泌。胰岛能够有效地执行这种葡萄糖-胰岛素响应 体内 由于胰岛在胰腺中血流灌注丰富，每个胰岛均位于距离毛细血管一个细胞长度的范围内。然而，在胰岛分离过程中，胰岛内密集的毛细血管网络会被胶原酶降解去除。2,3因此，由于扩散限制，氧气和营养物质的供应被限制在100 μm的范围内。
现有技术在重建胰岛微环境方面效果有限
重建胰岛原生的氧气和葡萄糖动态环境对于模拟生理及病理生理条件至关重要，但使用标准的缺氧培养箱难以实现，因为这类设备需要复杂的气流控制，且无法连续监测胰岛功能。此外，针对1型糖尿病的移植疗法会使分离的胰岛暴露于肝门静脉系统中，该环境的氧分压（pO2）显著低于生理状态下的胰腺组织（&#60;2%，5–15 mmHg，而正常胰腺为5.6%，40 mmHg）4。移植后，胰岛移植物需要两周或更长时间才能完成再血管化。已有研究表明，缺氧暴露会损害胰岛的葡萄糖-胰岛素耦联机制。在刺激-分泌耦联因素中，钙信号、线粒体膜电位和胰岛素动力学可通过微流控技术进行便捷监测。我们先前开发的微流控技术已实现了对单个胰岛周围水相微环境的精确调控，并可同步进行实时监测5,6。然而，由于缺乏能够同时施加刺激并进行监测的技术手段，目前对胰岛缺氧损伤的量化研究仍受到限制。因此，将氧气的微流控调控与胰岛功能监测相结合，有望显著提升胰岛缺氧相关研究的水平。
微流控技术可以重建并调控水相和氧气的微环境
组织和细胞培养缺氧研究的标准技术一直基于缺氧舱。通常情况下，缺氧舱可提供单一氧浓度，平衡时间约为10–30分钟，无法满足分钟级动态缺氧的需求。最近有两项研究使用小型定制舱对整只小鼠进行间歇性缺氧暴露，但在葡萄糖诱导的胰岛素反应方面得出了相互矛盾的结果7,8。需要注意的是，在整体动物水平上，呼吸氧浓度并不会直接转化为胰岛毛细血管的氧分压（pO2），因为呼吸系统存在调控机制。此外，这些研究既未实现氧浓度的标准化，也未提供胰岛组织水平上的实时氧浓度测量。
另一方面，氧气微流控技术可通过气体通道网络来控制氧气，从而克服上述局限性。此外，微流控技术可在氧气调节过程中兼容活细胞成像，而这一功能在目前的标准低氧培养箱中尚无法实现。多种新型微流控方法利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的气体通透性，将氧气浓度溶解到微通道中，并使培养基流经目标细胞9-14。这些装置还集成了多个独立的氧气浓度梯度、基于荧光的氧气传感器，甚至实现了芯片上的化学产氧。
基于液体溶解的微流控技术难以维持稳定且连续的梯度，因其依赖对流混合，而该过程对流动条件十分敏感。相比之下，本研究所采用的技术侧重于缩短氧气输送的扩散路径。通过让氧气直接穿过接种有细胞或胰岛组织的膜进行扩散，从而消除了气体溶解和剪切流的影响。这种方法省去了用于控制溶解过程的额外微流控装置，同时避免了对胰岛产生不必要的剪切应力——这种应力本身可能诱发胰岛素释放。该平台已被用于证明在细胞培养中，无论是高氧还是低氧极端条件（2–97% O2），均可引起活性氧（ROS）的上调1,15。由于实现了氧气的直接输送并消除了剪切流，我们基于扩散的微流控平台为研究胰岛缺氧提供了最优解决方案。
多模态刺激与监测
基于扩散的微流控技术在用于研究胰岛微生理学时也带来了额外的优势。通过使用膜作为扩散屏障，可以将液体与氧气浓度变化隔离，从而实现对水相葡萄糖刺激和缺氧刺激的独立控制。这形成了一种类似“三明治”结构的同步刺激方式，能够在空间上精确定位递送至胰岛。此外，由于气体通过计算机控制的微注射器进行时间上的调控，我们能够以小于60秒的瞬态时间，将氧气浓度从21%至0%进行数字化调节。在显微镜下对氧气和葡萄糖微环境的动态控制，使得实时多模态实验方案成为可能，而这一过程若使用传统的缺氧舱则无法实现或极为繁琐。利用该装置，研究人员监测了钙信号（Fura-AM）、线粒体膜电位（Rhodamine 123）以及胰岛素动力学（ELISA），从而全面揭示了在缺氧条件下葡萄糖-胰岛素响应的动态过程。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>劳雷尔</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>数字加热板</td><td>PMC 数据板</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>紫外固化灯</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>陶氏化学</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona Wand</td><td>早期T细胞前体</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>真空室</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>微量分配器</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V 和 20 V 直流电源</td><td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>国家仪器公司</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>氧气传感器</td><td>海洋光学</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&amp;mu;l</td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 荧光染料</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗丹明123荧光染料</td><td>Molecular Probes，Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 英寸硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 英寸 × 1/8 英寸</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 英寸和 4 毫米</td></tr><tr><td>注射器连接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>雌性鲁尔接头 1/16 英寸</td></tr><tr><td>直连连接器</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 英寸</td></tr><tr><td>肘形接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 英寸</td></tr></tbody></table>

单个胰岛水平下氧气微环境的定量与时间控制

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

在单一技术中同时实现氧合及对葡萄糖刺激-分泌耦联因子的监测，对于模拟胰岛缺氧的病理生理状态（尤其是在移植环境中）至关重要。传统的缺氧培养箱技术无法同时调节两种刺激，也无法实时监测葡萄糖刺激-分泌耦联因子。为解决这些问题，我们采用了一种多层微流控技术，通过扩散膜整合水相和气相的调控。该方法在透明的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置内为微尺度胰岛构建了“刺激三明治”环境，从而可通过荧光显微镜监测上述耦联因子。此外，气体输入由一对微流控分配器控制，可在0–21%范围内实现定量、亚分钟级的氧气浓度调节。这种间歇性缺氧处理被用于研究胰岛预处理的新现象。同时，结合多模态显微镜技术，我们能够详细观察钙离子及KATP 缺氧事件期间的通道动力学。我们设想微流控缺氧技术，尤其是这种同时双相技术，可作为研究胰岛以及许多其他 离体 组织。

该胰岛缺氧技术的核心在于能够在同一微流控腔室中对液相和气相刺激进行调节，并实现分钟级的快速瞬变。图1展示了在胰岛腔室内测得的 a) 双相刺激和 b) 快速调节的代表性结果。通过向腔室内引入荧光素所显示的液相调节，可在3至4分钟的混合时间内达到平衡。此外，氧气浓度可在5%至21%之间快速切换，瞬变迅速，可实现最短周期为2分钟的氧气循环。不同的循环深度和频率也可实现，如图2所示。
当将这种循环应用于胰岛以产生间歇性缺氧时，与常规的常氧脉冲相比，可以观察到缺氧预处理对胰岛的保护作用，图3a。由于细胞内钙离子流——胰岛素分泌的信号机制——是实时监测的，因此可以在钙瞬变的超调和振荡衰减中观察到缺氧和间歇性缺氧（IH）的影响，图3b。这些是与KATP通道相关的重要参数，该通道被认为调控着预处理过程。此外，通过使用Rh123监测线粒体膜电位，可直观反映线粒体与代谢及缺氧之间的关联。最后，收集微流控流出液可用于ELISA检测总胰岛素含量。钙离...

与缺氧培养箱相比，微流控氧气控制技术不仅提供了更高的便捷性和更快的操作速度。尤其是通过膜扩散方式实现时，微流控氧气系统能够在微尺度上同时调节液体和气体环境。该技术为研究胰岛病理生理学所必需的动态多参数实验提供了有力支持。

在单一技术中同时实现氧合及对葡萄糖刺激-分泌耦联因子的监测，对于模拟病理生理状态至关重要……

本实验的总体目标是将分钟级的间歇性低氧应用于微尺度的胰岛组织，以研究其预处理效应。首先，通过制备一种带有薄型透气膜的多模态微流控装置来实现该目标；第二步是构建一个计算机控制的氧气调节系统。随后将下一个眼状结构小心地装入装置中，然后连接液体和氧气的微流控系统。最后一步是将显微镜与多模态微流控系统协调同步，以观察在氧气调节过程中发生变化的眼状结构参数。最终，利用眼状结构间歇性缺氧技术表明，在缺氧条件下葡萄糖反应明显受损。尽管低氧的时间调制可训练眼睑对低氧产生较轻的损伤反应。与现有的溶解氧法或使用低氧舱等方法相比，该技术的主要优势在于能够以精确的氧气浓度，在快速、微小的时间间隔内将氧气输送至眼睑，且不会因复杂的气流而产生剪切应力。它还允许通过培养箱和显微镜进行实时监测。该技术有助于回答异基因移植领域的关键科学问题，例如定义移植部位的缺氧损伤或优化预处理方案以改善移植效果。因此，该方法可为异基因移植中的缺氧研究提供重要见解。该方法也可应用于其他组织和系统，例如中枢神经系统、心脏组织、肾脏及其他移植器官。此方法的视频演示至关重要，因为许多设备的制作和小孔操作步骤难以掌握。由于该技术具有新颖的跨学科特性，这些步骤学习起来较为困难，但通过不断实践或熟悉后可逐步掌握。首先开始制作微流控装置的覆盖层。为此，将预混的PDMS倒入空白培养皿中，厚度为1.5毫米，并在80摄氏度下固化两小时。接着，通过在四英寸硅片上旋涂两层350微米厚的SU-8 2150，形成单层700微米厚的结构，制备含灌注腔母模的葡萄糖微流控层。然后使用葡萄糖微流控层光刻掩模，通过紫外光曝光，将微通道图案转移至SU-8层。用SU8显影剂冲洗掉未曝光的区域。接着，将预混好的DGA PDMS倒入微结构模板上，高度约为3毫米，在80摄氏度下固化2小时。固化完成后，将葡萄糖微流控层裁剪成所需形状，并使用2毫米打孔器制备进样口和出样口，使用直径为8毫米的打孔器制备主腔室。接下来，通过在洁净的四英寸硅片上旋涂一层100微米厚的SU 8 2100，制备用于眼睑固定的微孔模具。然后采用紫外光刻技术将微孔图案转移至该涂层上。微孔模具完成后，用显影剂冲洗去除未曝光区域。再通过在900 RPM转速下旋涂30秒，随后在80摄氏度下固化10分钟，依次添加两层100微米厚的PDMS，以形成每一层。完成后，在入口和出口端口处打孔，直径为2毫米。最后，通过将SU 8 2100旋涂至100微米厚度（与前一层相同）来制备气体微流控模具，并再次使用紫外光刻技术转移气体微流控图案。用显影剂冲洗掉未曝光区域。接下来，将一层厚度为1.5毫米的PDMS倒入气体微流控模具中，并在80摄氏度下固化两小时。然后用剃刀刀片将PDMS切割成所需形状。随后，在盖层上打两个直径为2毫米的进样口和出样口，使其与其他层上的对应位置对齐，以便将多层结构键合在一起。首先，通过使用透明胶带清洁表面，暴露于电晕电弧中，然后手动按以下顺序对齐各层，以进行准备。首先，将膜与底部气体层粘合，使微孔朝上；然后将葡萄糖微流控层粘合在微孔膜的上方。最后，将入口层和出口层粘合至最顶层，以封装整个组件。通过在组件上方施加1千克重物，并在100摄氏度下烘烤3小时，以促进形成紧密的粘合。然后进行泄漏测试。通过向水相层注入水，将装置浸入水中，并用注射器使空气流经气相层以检查泄漏情况，从而测试装置。最后，让无泄漏的装置通过水相层流通70%乙醇一到两分钟以进行灭菌。首先将微量分配器的控制导线连接至配套的驱动单元，以完成微量分配器的设置。然后将驱动器连接到数字IO板上，对应其在LabVIEW控制界面中的端口。接着，将5伏和20伏直流电源分别连接至驱动单元上对应的触点，并将数字IO连接至笔记本电脑，以执行随附文本方案附录中所述的用于气体控制的LabVIEW代码。随后，将一个微型分配器连接至氮气，另一个连接至压缩空气，两种气体均含有5%二氧化碳，并将两种气体压力均设定为2 psi。在进入微流控装置之前，通过T型接头将两个分配器的输出端连接在一起。接下来，将装置安装到倒置显微镜的加热载物台上，同时将装置连接至提供0%和21%氧气的气体源。随后，将光纤氧传感器置于装置的液体出口处，以实时测量流出液中的溶解氧浓度。然后将装置连接至蠕动泵，并以每分钟250微升的流速开始向装置内泵入液体。通过在5%和21%氧气之间循环微分配器，表征氧气调节的瞬态响应。将蠕动泵连接至微流控装置，并将管路置于37摄氏度的加热板上，以在流体进入微流控装置前对其进行预热。同时，将葡萄糖微流控系统的出口端连接至组分收集器，开始解剖C57BL/6小鼠，并通过胶原酶消化及Ficoll密度梯度分离法分离胰岛，具体操作详见JoVE网站提供的以下视频。将小室置于含有10% FBS、1%青霉素-链霉素和20毫摩尔HEPES的RPMI 1640培养基中，在培养皿中孵育24至48小时。为确保结果一致，请在两天内使用这些小室。接下来，按照随附文本方案配制新鲜的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液，其中一种溶液含2毫摩尔葡萄糖，另一种含14毫摩尔葡萄糖。将溶液置于50毫升锥形管中，并放入37°C水浴中预热。然后通过向含有2毫摩尔葡萄糖的2毫升Krebs缓冲液中加入5微摩尔的4:02 AM和DMSO以及2.5微摩尔的RH 123和100%乙醇，制备用于分离眼状体的染色液。接着用10微升移液器吸取眼状体，并在37°C条件下于染色液中孵育30分钟。染色后，通过葡萄糖微通道入口将约20个眼片装入装置中。通过从出口向入口注入预平衡缓冲液，引导眼片进入腔室。随后灌注眼片和缓冲液10分钟，以洗去多余的染料。首先，将2毫摩尔的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液通过系统循环5分钟，以建立正常的脉搏基线。随后，用14毫摩尔的葡萄糖缓冲液刺激反应室15分钟，接着用2毫摩尔的葡萄糖缓冲液冲洗15分钟。在此过程中，通过以340纳米和380纳米激发，记录510纳米处的双发射信号。此外，在480纳米波长激发染料时，记录RH 123的530发射。为在氧浓度调节过程中尽量减少对流干扰，在刺激和洗涤步骤中施加缓冲液流，测试期间的其他步骤务必停止流动。使用本视频所示的微流控方法，以一分钟为间隔从葡萄糖出口收集流出液，用于后续分析。通过计算机控制的微注射器，可快速调节流经薄PDMS膜的氧气百分比。以下是这种调节的一个示例，范围从一分钟到六分钟。通过输送5%至21%的氧气，还可以实现每百万分之二到8.5的亚分钟级定量调节。蓝线表示输送氧气的百分比，绿线表示以百万分之一为单位的溶解氧浓度。当该循环作用用于在小孔处产生间歇性缺氧时，可以观察到小孔经预处理后对缺氧的耐受性提高，相较于不规则的常氧脉冲，可通过治疗后钙瞬变的过冲和振荡衰减情况来观察缺氧与间歇性缺氧的影响。此处蓝色表示常氧条件下的响应。红色表示缺氧反应，绿色线条表示条件化缺氧反应。此处显示的是钙离子、线粒体膜电位和胰岛素的检测结果。这些数据来自实时荧光显微成像，并结合使用系统微流控流出液进行的芯片外 ELISA 检测。综合这些结果，开始构建出在短暂缺氧条件下葡萄糖-胰岛素反应的多模态视图。一旦掌握，该技术若操作得当可在两天内完成：一天用于装置的制备及眼睑细胞的分离，另一天用于眼睑实验本身。在实施该程序时，重要的是务必在装置开发完成后，通过校准装置的气体混合器来验证所输送的氧气浓度。该技术为研究胎儿娩出及其他组织微生理领域的研究人员铺平了道路，使其能够探索缺氧和暂时性氧模式如何影响糖尿病、心血管疾病及神经系统疾病等病症。观看本视频后，您应能充分理解如何控制氧气调节、操控微组织，以及如何利用多模态微流控装置对组织缺氧进行可重复且具有意义的测量。

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制

开发了一种微流控胰岛灌注装置，用于评估多个胰岛的动态胰岛素分泌，同时进行钙离子内流和线粒体膜电位变化的荧光成像。...

一种用于微流控灌注装置的多参数胰岛灌注系统

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本实验方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法，在天然化合物存在的条件下，测量葡萄糖介导的线粒体呼吸变化对完整832/13...

高分辨率呼吸测定法测量天然化合物存在下完整β细胞的线粒体功能

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。...

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。...

单细胞RNA测序及人胰岛分析

本方案展示了非人灵长类动物胰岛中氧气消耗量的准确且可重复的测量方法。胰岛加样技术及微孔板的包被为其他类型培养类球体的呼吸作用高效测量提供了框架。...

非人灵长类胰岛氧耗分析

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。...

活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

本方案描述了一种利用腺病毒递送环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和cAMP差异检测器，对原代人源拟胰岛中细胞内信号传导事件与胰岛素及胰高血糖素分泌进行同步采集与共定位分析的方法。 原位 （cADDis）和微型灌流系统。...

用于同步评估荧光生物传感器动态与激素分泌谱的人类伪胰岛系统

本文提供了通过小鼠完整血管系统灌注以进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验的详细步骤，作为一种评估胰腺内分泌功能的附加技术，可减少潜在混杂因素的影响。...

通过完整胰腺小鼠血管灌注进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌

本方案介绍了一种用于制造双层微流控芯片并在快速氧浓度波动条件下分析微生物生长的方法。通过在流体通道中进行氧气检测和微生物培养，验证了该装置的性能。...

使用微流控双层装置在微生物单细胞生长分析中实现快速氧气振荡

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外...

采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

了解利用微流控装置对单个胰岛进行间歇性低氧预处理的定量调控方法。该技术通过实时显微成像监测钙信号与线粒体膜电位变化，为研究胰岛移植中的低氧损伤机制及改善移植效果提供新途径。

单个胰岛水平下氧气微环境的定量与时间控制

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