氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制
2013年11月17日
微流控氧赋予的不仅仅是方便和速度超过低氧室的生物实验。通过扩散穿过膜实现的，特别是当，微氧可以在微尺度级同时提供液相和气相的调制。这项技术使动态多参数实验的关键学习islet病理生理学。
该程序的总体目标是将微小鳞片间歇性缺氧应用于微小的胰孔，以研究预处理效果。这是通过首先制造具有薄透气膜的多模态微流体装置来实现的。第二步是创建计算机化的氧气调制系统。
接下来，将孔眼小心地装入设备中，然后连接液体和氧气微流体。最后一步是将显微镜与多模式微流体协调，以便可视化氧调制过程中变化的孔眼参数。最终，使用孔眼间歇性缺氧技术来显示葡萄糖反应在缺氧时明显受损。
而缺氧的时间调节可以训练孔眼以较小的损伤做出反应。与溶解氧或使用低氧室等现有方法相比，该技术的主要优点是准确。氧气浓度可以在快速、微小的时间间隔内输送到眼睑，而不会因复杂的流动而产生巨大的压力。
它还允许使用地板和显微镜进行实时监控。该硕士可以帮助回答 Alli 移植领域的关键问题，例如定义移植部位的缺氧损伤或预处理方案以改善移植结果。所以这种方法可以提供对 Alli 缺氧的见解。
它也可以应用于其他组织和系统，例如中枢神经系统、心脏组织、肾脏和其他移植器官。这种方法的视频演示与许多设备制造和孔眼手柄一样至关重要。由于该技术新颖的跨学科性质，这些步骤很难学习，但固有的挑战性或熟悉的 Begin 制造微流体设备的覆盖层。
为此，将 DGA 预混合的 PDMS 倒入 1.5 毫米高的空白培养皿中，并在 80 摄氏度下固化 2 小时。接下来，通过在 4 英寸硅片上旋涂两个 350 微米厚的 SU 8 21 50 层，在四个 700 微米的硅片上形成一个 700 微米层，从而使用 profusion 室母子制造葡萄糖微流体层。然后使用葡萄糖微流体层光掩模将其暴露在紫外线下，将微通道图案转移到 SU 八层上。
用 SU 8 显影剂冲洗掉未曝光的区域。接下来，将预混的 DGA 倒入 MA 上，最高高度为 3 毫米，并在 80 摄氏度下固化 2 小时。固化后，将葡萄糖微流体层切割成形状，并使用 2 毫米的冲头形成入口和出口，并使用直径为 8 毫米的冲头形成主腔。
接下来，通过在干净的 4 英寸硅片上旋涂 100 微米厚的 SU 8 2100 层来制造用于眼睑固定的微孔母版，然后使用 UV 光刻将微孔图案转移到该层上。当微孔母版完成后，用显影剂冲洗掉未曝光的区域。通过以 900 RPM 的速度旋涂 30 秒，然后在 80 摄氏度下固化 10 分钟，添加两层 100 微米的 PDMS，以生产每一层。
完成后，在出口处打入两个毫米直径的入口。最后，像前一层一样，通过旋转 SU 8 2100 至 100 微米厚度来制造气体微流控母子，并使用 UV 光刻技术再次转移气体微流控图案。用显影剂冲洗掉未曝光的区域。
接下来，将 1.5 毫米厚的 PDMS 层倒在气体微流体母子上，并在 80 摄氏度下固化 2 小时。然后用剃须刀片将 PDMS 切割成形状。然后将两个直径为毫米的入口和出口打入覆盖层，使其与其他层的位置对齐，以将多层粘合在一起。
首先，通过用透明胶带清洁表面，将它们暴露在电晕弧中，然后按以下顺序手动对齐各层来准备它们。首先，将膜粘合到底部气体层上，微孔朝上。然后将葡萄糖微流控层粘合在微孔膜的顶部。
最后，将入口和出口层粘合在最顶部，封装整个组件。通过在组件顶部添加 1 公斤的重物并在 100 摄氏度下烘烤 3 小时，帮助形成紧密粘合。然后泄漏。
通过将水加载到水层中，浸没设备并使用注射器使空气流过气体层，同时寻找泄漏来测试设备。最后，让 70% 乙醇通过水层 1 到 2 分钟，对无泄漏设备进行消毒。首先将微型分配器控制引线连接到随附的驱动单元，以设置微型分配器。
然后将驱动程序连接到与其实验室视图控件相对应的端口上的数字 IO 板。接下来，将 5 V 和 20 V 直流电源连接到驱动单元上的相应触点，并将数字 IO 连接到笔记本电脑，以便执行气体控制的实验室视图代码，如随附文本协议的附录中所述。然后将一个微型分配器连接到氮气，另一个连接到压缩空气，两者都含有 5% 的二氧化碳，并将两种气体设置为 2 PS。在进入微流体设备之前，我将分配器输出连接到 T 型结中。
接下来，将设备安装到倒置显微镜的加热载物台上，将 0% 和 21% 氧气连接到设备上。接下来，在设备的流体输出处放置一个光纤氧传感器，以实时测量输出范围内的溶解氧。然后将设备连接到蠕动泵，开始以每分钟 250 微升的速度流过设备。
通过在 5% 和 21% 氧气之间循环微型分配器来表征氧调制的瞬态响应。将蠕动泵连接到微流体装置，并将管道放在 37 摄氏度的热板上，以便在流体进入微流体装置之前对其进行加热。此外，将葡萄糖微流控的输出端口连接到馏分收集器，开始解剖 C 57 黑色六只小鼠，并通过胶原酶消化和 F ccal 密度梯度分离分离胰眼，如分离后 JoVE 提供的以下视频中所述。
将孔眼在含有 10% FBS、1% 青霉素链霉素和 20 毫摩尔堆的 RPMI 1640 培养基中，在培养皿中孵育 24 至 48 小时。在两天内使用孔眼以确保效果一致。接下来，按照随附文本方案中的说明制备新鲜的 Krebs 林格氏咖啡氢盐缓冲液，其中一种溶液含有 2 毫摩尔葡萄糖，另一种溶液含有 14 毫摩尔葡萄糖。
将 50 毫升锥形管中的溶液放入 37 摄氏度的水浴中加热。然后，通过将 5 微摩尔的 4：02 AM 和 DMSO 以及 2.5 微摩尔的 RH 1：23 和 100% 乙醇加入 2 毫升含有 2 毫摩尔葡萄糖的 Krebs 缓冲液中，为分离的孔制备染色剂。接下来，用 10 微升移液管吸取孔眼，并在 37 摄氏度下在染色中孵育 30 分钟。
染色后，通过葡萄糖微通道入口将大约 20 个孔眼加载到装置中。通过将缓冲液从出口灌注回入口，将孔眼引导至腔室中。然后灌注孔眼和缓冲 10 分钟以洗去多余的染料。
首先，通过系统抽取 2 毫摩尔的 Krebs 林格碳酸氢盐缓冲液 5 分钟，以建立正常的脉搏基线。然后用 14 毫摩尔葡萄糖缓冲液刺激腔室 15 分钟，然后用 2 毫摩尔葡萄糖缓冲液洗涤 15 分钟。在此过程中，通过激发饮食 340 纳米和 380 纳米来记录两次发射的 510 纳米。
此外，通过在 480 纳米处激发染料来记录 RH 1 23 的 530 发射。为了最大限度地减少氧气调制过程中的对流干扰，请在刺激和洗涤步骤中应用缓冲流，并确保在测试期间停止其他步骤中的流。使用本视频中所示的微流体方法，每隔一分钟从葡萄糖出口收集流出物，用于其他分析，可以使用计算机化的微注射器快速调节流过 PDMS 薄膜的氧气百分比。
下面是此调制的示例，范围从 1 分钟到 6 分钟。还可以通过输送 5% 到 21% 的氧气来提供百万分之 2 到 8.5 之间的亚微量氧气定量调制蓝线表示输送氧气的百分比，绿线表示产生的溶解氧（以百万分之几为单位）。当这种循环应用于在孔眼处产生间歇性缺氧时，通过观察缺氧和间歇性缺氧的治疗后改善比值，可以观察到在钙瞬变的过冲和振荡阻尼中观察到孔眼对缺氧的预处理与不规则常氧脉冲相比对缺氧的好处，如此处蓝色所示是常氧反应。
红色是低氧反应，绿线是条件性低氧反应。钙、线粒体电位和胰岛素的测量值显示在此处。它们是实时荧光显微镜和 off chipp EISA 分析的结果，同时使用系统的微流体流出物，它们开始构建低氧瞬时下葡萄糖胰岛素反应的多模式视图。
一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两天内完成，一天用于制造设备和隔离眼睑细胞，一天用于眼睑实验本身。在尝试此过程时，重要的是要记住通过在设备开发后连接设备的气体发生器来验证输送的氧气浓度。这项技术为胎儿出口和其他组织微生理学的研究人员探索缺氧和临时氧气模式如何影响糖尿病、心血管和神经系统疾病等疾病铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何使用多模态微流体设备控制氧气调节、作微组织以及生成可重复、有意义的组织缺氧测量有很好的了解。
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概述
本研究探讨了微流控氧气控制在动态调节胰岛缺氧中的应用。该技术允许实时监测和精确的氧气输送，增强了对胰岛病理生理学的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞生物学
- 胰岛生理学
背景
- 间歇性缺氧可以影响胰岛的葡萄糖反应。
- 传统的缺氧室在精确度和速度上有限。
- 微流控装置可以提供同时的液相和气相调节。
- 这种方法可以应用于胰岛以外的各种组织。
研究目的
- 调查间歇性缺氧对胰岛的预处理效果。
- 开发用于精确氧气调节的微流控装置。
- 可视化氧气调节过程中胰岛参数的变化。
使用的方法
- 制造具有气体透过膜的多模态微流控装置。
- 创建计算机化氧气调节系统。
- 将胰岛加载到装置中进行实验。
- 在氧气调节过程中使用显微镜进行实时监测。
主要结果
- 在缺氧条件下，胰岛的葡萄糖反应受损。
- 时间上的缺氧调节可以增强胰岛的反应。
- 微流控技术允许快速和准确的氧气输送。
- 实时监测提供了对不同氧气水平下胰岛行为的洞察。
结论
- 微流控方法比传统方法有显著优势。
- 这种技术可以帮助定义移植部位的缺氧损害。
- 它在其他器官系统和移植研究中具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise, real-time modulation of oxygen microenvironments at the single islet level addresses a critical gap in modeling pathophysiological hypoxia relevant to islet transplantation and metabolic disease research. This microfluidic platform enables simultaneous control and monitoring of both gas and aqueous stimuli, supporting high-fidelity interrogation of stimulus-secretion coupling and cellular adaptation. The approach enhances predictive confidence for translational studies and informs risk-adjusted decisions in early discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by dissecting oxygen-dependent pathways in islet function.
- Supports functional target validation through real-time monitoring of calcium and KATP channel dynamics under hypoxic stress.
- Facilitates hypothesis testing on preconditioning regimens to improve transplant outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible microenvironment for quantitative assessment of glucose stimulus-secretion coupling.
- Delivers standardized, sub-minute oxygen modulation for robust assay development.
- Enables high-content, multimodal readouts via fluorescence microscopy and effluent analysis.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant hypoxic conditions for islet and other ex vivo tissue systems.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling real-time measurement of functional outputs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in metabolic and transplant research.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling controlled, quantitative hypoxia studies at the single tissue level.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of oxygen-sensitive mechanisms in islet biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound or regimen evaluation under defined hypoxic conditions.
- Analytics: Delivers real-time, multimodal measurements of calcium, mitochondrial potential, and insulin secretion.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking transplant-relevant hypoxic microenvironments.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems and tissue types for broader R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in hypoxia-driven studies.
- Operational Value: Standardizes oxygen delivery and monitoring, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for preconditioning strategies and transplant interventions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and transplant-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and multimodal microscopy.
- Demands access to precision gas control systems and fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for device handling and data interpretation.
- Adaptable to various tissue types with protocol modifications as supported by the source.
- Practical limitations include device fabrication complexity and the need for real-time oxygen verification.
