单个胰岛水平下氧气微环境的定量与时间控制

本实验的总体目标是将分钟级的间歇性低氧应用于微尺度的胰岛组织，以研究其预处理效应。首先，通过制备一种带有薄型透气膜的多模态微流控装置来实现该目标；第二步是构建一个计算机控制的氧气调节系统。

随后将下一个眼状结构小心地装入装置中，然后连接液体和氧气的微流控系统。最后一步是将显微镜与多模态微流控系统协调同步，以观察在氧气调节过程中发生变化的眼状结构参数。最终，利用眼状结构间歇性缺氧技术表明，在缺氧条件下葡萄糖反应明显受损。

尽管低氧的时间调制可训练眼睑对低氧产生较轻的损伤反应。与现有的溶解氧法或使用低氧舱等方法相比，该技术的主要优势在于能够以精确的氧气浓度，在快速、微小的时间间隔内将氧气输送至眼睑，且不会因复杂的气流而产生剪切应力。

它还允许通过培养箱和显微镜进行实时监测。该技术有助于回答异基因移植领域的关键科学问题，例如定义移植部位的缺氧损伤或优化预处理方案以改善移植效果。因此，该方法可为异基因移植中的缺氧研究提供重要见解。

该方法也可应用于其他组织和系统，例如中枢神经系统、心脏组织、肾脏及其他移植器官。此方法的视频演示至关重要，因为许多设备的制作和小孔操作步骤难以掌握。由于该技术具有新颖的跨学科特性，这些步骤学习起来较为困难，但通过不断实践或熟悉后可逐步掌握。首先开始制作微流控装置的覆盖层。

为此，将预混的PDMS倒入空白培养皿中，厚度为1.5毫米，并在80摄氏度下固化两小时。接着，通过在四英寸硅片上旋涂两层350微米厚的SU-8 2150，形成单层700微米厚的结构，制备含灌注腔母模的葡萄糖微流控层。然后使用葡萄糖微流控层光刻掩模，通过紫外光曝光，将微通道图案转移至SU-8层。

用SU8显影剂冲洗掉未曝光的区域。接着，将预混好的DGA PDMS倒入微结构模板上，高度约为3毫米，在80摄氏度下固化2小时。固化完成后，将葡萄糖微流控层裁剪成所需形状，并使用2毫米打孔器制备进样口和出样口，使用直径为8毫米的打孔器制备主腔室。

接下来，通过在洁净的四英寸硅片上旋涂一层100微米厚的SU 8 2100，制备用于眼睑固定的微孔模具。然后采用紫外光刻技术将微孔图案转移至该涂层上。微孔模具完成后，用显影剂冲洗去除未曝光区域。再通过在900 RPM转速下旋涂30秒，随后在80摄氏度下固化10分钟，依次添加两层100微米厚的PDMS，以形成每一层。

完成后，在入口和出口端口处打孔，直径为2毫米。最后，通过将SU 8 2100旋涂至100微米厚度（与前一层相同）来制备气体微流控模具，并再次使用紫外光刻技术转移气体微流控图案。用显影剂冲洗掉未曝光区域。

接下来，将一层厚度为1.5毫米的PDMS倒入气体微流控模具中，并在80摄氏度下固化两小时。然后用剃刀刀片将PDMS切割成所需形状。随后，在盖层上打两个直径为2毫米的进样口和出样口，使其与其他层上的对应位置对齐，以便将多层结构键合在一起。

首先，通过使用透明胶带清洁表面，暴露于电晕电弧中，然后手动按以下顺序对齐各层，以进行准备。首先，将膜与底部气体层粘合，使微孔朝上；然后将葡萄糖微流控层粘合在微孔膜的上方。

最后，将入口层和出口层粘合至最顶层，以封装整个组件。通过在组件上方施加1千克重物，并在100摄氏度下烘烤3小时，以促进形成紧密的粘合。然后进行泄漏测试。

通过向水相层注入水，将装置浸入水中，并用注射器使空气流经气相层以检查泄漏情况，从而测试装置。最后，让无泄漏的装置通过水相层流通70%乙醇一到两分钟以进行灭菌。首先将微量分配器的控制导线连接至配套的驱动单元，以完成微量分配器的设置。

然后将驱动器连接到数字IO板上，对应其在LabVIEW控制界面中的端口。接着，将5伏和20伏直流电源分别连接至驱动单元上对应的触点，并将数字IO连接至笔记本电脑，以执行随附文本方案附录中所述的用于气体控制的LabVIEW代码。随后，将一个微型分配器连接至氮气，另一个连接至压缩空气，两种气体均含有5%二氧化碳，并将两种气体压力均设定为2 psi。在进入微流控装置之前，通过T型接头将两个分配器的输出端连接在一起。

接下来，将装置安装到倒置显微镜的加热载物台上，同时将装置连接至提供0%和21%氧气的气体源。随后，将光纤氧传感器置于装置的液体出口处，以实时测量流出液中的溶解氧浓度。然后将装置连接至蠕动泵，并以每分钟250微升的流速开始向装置内泵入液体。

通过在5%和21%氧气之间循环微分配器，表征氧气调节的瞬态响应。将蠕动泵连接至微流控装置，并将管路置于37摄氏度的加热板上，以在流体进入微流控装置前对其进行预热。同时，将葡萄糖微流控系统的出口端连接至组分收集器，开始解剖C57BL/6小鼠，并通过胶原酶消化及Ficoll密度梯度分离法分离胰岛，具体操作详见JoVE网站提供的以下视频。

将小室置于含有10% FBS、1%青霉素-链霉素和20毫摩尔HEPES的RPMI 1640培养基中，在培养皿中孵育24至48小时。为确保结果一致，请在两天内使用这些小室。接下来，按照随附文本方案配制新鲜的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液，其中一种溶液含2毫摩尔葡萄糖，另一种含14毫摩尔葡萄糖。

将溶液置于50毫升锥形管中，并放入37°C水浴中预热。然后通过向含有2毫摩尔葡萄糖的2毫升Krebs缓冲液中加入5微摩尔的4:02 AM和DMSO以及2.5微摩尔的RH 123和100%乙醇，制备用于分离眼状体的染色液。接着用10微升移液器吸取眼状体，并在37°C条件下于染色液中孵育30分钟。

染色后，通过葡萄糖微通道入口将约20个眼片装入装置中。通过从出口向入口注入预平衡缓冲液，引导眼片进入腔室。随后灌注眼片和缓冲液10分钟，以洗去多余的染料。

首先，将2毫摩尔的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液通过系统循环5分钟，以建立正常的脉搏基线。随后，用14毫摩尔的葡萄糖缓冲液刺激反应室15分钟，接着用2毫摩尔的葡萄糖缓冲液冲洗15分钟。在此过程中，通过以340纳米和380纳米激发，记录510纳米处的双发射信号。

此外，在480纳米波长激发染料时，记录RH 123的530发射。为在氧浓度调节过程中尽量减少对流干扰，在刺激和洗涤步骤中施加缓冲液流，测试期间的其他步骤务必停止流动。使用本视频所示的微流控方法，以一分钟为间隔从葡萄糖出口收集流出液，用于后续分析。通过计算机控制的微注射器，可快速调节流经薄PDMS膜的氧气百分比。

以下是这种调节的一个示例，范围从一分钟到六分钟。通过输送5%至21%的氧气，还可以实现每百万分之二到8.5的亚分钟级定量调节。蓝线表示输送氧气的百分比，绿线表示以百万分之一为单位的溶解氧浓度。当该循环作用用于在小孔处产生间歇性缺氧时，可以观察到小孔经预处理后对缺氧的耐受性提高，相较于不规则的常氧脉冲，可通过治疗后钙瞬变的过冲和振荡衰减情况来观察缺氧与间歇性缺氧的影响。此处蓝色表示常氧条件下的响应。

红色表示缺氧反应，绿色线条表示条件化缺氧反应。此处显示的是钙离子、线粒体膜电位和胰岛素的检测结果。这些数据来自实时荧光显微成像，并结合使用系统微流控流出液进行的芯片外 ELISA 检测。综合这些结果，开始构建出在短暂缺氧条件下葡萄糖-胰岛素反应的多模态视图。

一旦掌握，该技术若操作得当可在两天内完成：一天用于装置的制备及眼睑细胞的分离，另一天用于眼睑实验本身。在实施该程序时，重要的是务必在装置开发完成后，通过校准装置的气体混合器来验证所输送的氧气浓度。该技术为研究胎儿娩出及其他组织微生理领域的研究人员铺平了道路，使其能够探索缺氧和暂时性氧模式如何影响糖尿病、心血管疾病及神经系统疾病等病症。

观看本视频后，您应能充分理解如何控制氧气调节、操控微组织，以及如何利用多模态微流控装置对组织缺氧进行可重复且具有意义的测量。