一个微流控芯片单细胞的多功能化学分析
2013年10月15日
在这篇文章中，我们提出了一个微流控芯片单细胞分析。它使细胞内的蛋白质，酶，辅因子，以及第二信使通过荧光测定法或免疫测定装置的量化。
以下实验的总体目标是使用荧光或免疫测定分析单细胞裂解物。这是通过首先创建一个微流控装置并用抗体涂覆内腔来实现的。然后将单个细胞固定在陷阱中，并暴露于各种试剂中，以刺激细胞反应进行第二步。
快速关闭环形阀，裂解缓冲液流经装置。环形阀短时间打开，细胞在微室内裂解，由于体积小，允许释放的蛋白质以高浓度与抗体结合。接下来，打开环形阀。
洗涤腔室，并在密闭的微腔室中引入检测试剂。使用荧光显微镜监测荧光强度随时间的增加，结果表明该系统能够定量可靠地检测从单个细胞释放的目标分析物。该方法可以帮助回答单 A 细胞分析领域的关键问题。
特别是，它对细胞对化学环境变化的反应进行了系统研究。我们可以看到由于化学刺激而导致细胞内分子的上调或下调。这种技术有两个主要优点。
首先，我们可以将固定化细胞暴露在恒定或周期性变化的指定化学环境中。其次，我们可以对沉积物进行高灵敏度和特异性分析，而不会因运输而产生任何交叉污染或分析物损失。要开始制造三个不同的 SU 8 主晶圆，如随附的文本协议中所述。
一个将用于创建流体层，一个用于控制层，第三个用于微触点印记。然后制造微流体芯片，从制备 PDMS 和固化剂的 10 比 1 混合物开始。将两部分剧烈混合，并将溶液脱气 30 分钟或直到混合物无气泡。
接下来，将晶片放在培养皿内的控制层内，并将其贴在底部。在上面倒入大约 50 克 PDMS，形成 4 到 5 毫米厚的层，并将晶圆放入 80 摄氏度的烘箱中至少两个小时，以确保 PDMS 完全固化。对微接触打印晶圆重复相同的步骤，但使用大约 20 克 PDMS 而不是 50 克，从而产生 4 到 5 毫米厚的 PDMS 层。
为了准备底层，在带有微流体层的晶圆上旋涂 40 微米高的 PDMS 层。使用 2000 RPM 的转速 60 秒。当所有部件都固化后，将 PDMS 层在 80 摄氏度的烘箱中固化 1 小时。
从晶圆上取下控制层，然后用剃须刀片辅助将其切成小块。然后使用 1 毫米的活检穿刺打孔，并用胶带覆盖通道以进行储存。接下来，从微接触打印晶圆上取下 PDMS，并准备与腔室面积大小相同的印章。
将它们无尘存放在抽屉中，直到使用。然后将旋涂晶圆和 4 到 5 毫米厚的控制层放入等离子清洗机中。使用 0.75 毫巴的氧气等离子体以 18 瓦的功率将碎片曝光 45 秒。
等离子体处理后，在大工作距离的显微镜下快速对齐两层。在放置的顶部部件周围添加一些备用的 PDMS，以便于从晶圆上移除 PDMS。然后将威化饼放入 80 摄氏度的烤箱中至少一小时。
固化后，使用手术刀小心地从晶片上去除 PDMS，并用 1.5 毫米的活检穿刺切出微芯片穿孔，用于流体连接。此外，通过切割 200 微升移液器吸头的上部并使用一些备用的半固化 PDMS 在微芯片中创建一个储液器。把它粘在上面。
然后将芯片放入 80 摄氏度的烤箱中固化至少一小时。首先清洁载玻片和 PDMS 部件。用肥皂清洁载玻片。
用蒸馏水冲洗，然后再次用乙醇冲洗。使用氮气流干燥载玻片。使用胶带清除 PDMS 上的任何碎屑和灰尘颗粒。
然后放置 PDMS 部件和清洁的玻璃。以 18 瓦的功率滑入等离子清洗机中 45 秒，以确保紧密粘合，等离子处理后将芯片放在热板上 5 分钟粘合后，切下几个 200 微升移液器吸头的下部。用 10 至 15 微升含 4% BSA 的过滤 PBS 填充它们，然后将它们放入设备的入口中。
然后使用添加 10 至 15 微升 PBS 的切割尖端，并将其放入控制通道中。接下来，将薯片放入离心机中，以 800 倍重力旋转 5 分钟，使通道充满液体。如果任何通道中仍有空气，请重复此步骤，直到通道完全充满。
在室温下孵育封闭溶液至少 30 分钟。然后用 PBS 以每分钟 10 微升的流速将溶液从液体层中洗出。使用注射泵，该设备现在可用于细胞实验，以预印用于免疫测定的载玻片，在干净的培养皿中用 0.5% 生物素化的 BSA 孵育 PDMS 微接触打印印章。
半小时后，用蒸馏水彻底快速清洁邮票，并在氮气流下擦干邮票。干燥后，将印章快速放在干净的载玻片上，以沉积有图案的生物素化 BSA。放置后请勿移动印章，并检查印章是否与载玻片接触。
如果不是轻轻点击邮票，但不要用力按下。然后将邮票与微流体芯片的顶部一起放入等离子体室中，并将它们暴露在 18 瓦的氧气等离子体中 45 秒。等离子体处理后，从载玻片上去除印章。
在表面上呼吸将使图案可见。将微室对准打印表面的顶部。对齐后，将芯片放在 50 摄氏度的热板上 30 分钟以堵塞剩余表面，如前所述，用离心机将 PBS 中的 4% 无菌过滤 BSA 溶液引入芯片中，将微芯片孵育至少 30 分钟，然后用 PBS 以每分钟 10 微升的流速将溶液从液体层中洗出。
使用注射泵，直接使用芯片或在 4 摄氏度的潮湿箱中存放长达两周。接下来，通过将 PBS 中的 avadon 引入储液槽中来创建一个功能齐全的结合表面。然后使溶液流动，将 avadon 吸过流体通道。
彻底冲洗储液槽并用 PBS 冲洗通道。然后将蛋白 G 添加到储液槽中并将其拉过通道。通过用 PBS 冲洗储液槽和芯片来洗去任何多余的蛋白 G。
接下来，将目标抗体添加到储液槽中，并使其流经通道。然后停止流路以允许结合，然后再用 PBS 荧光洗涤通道，在将细胞引入通道之前，可以使用标记的类似物来检查打印过程的质量。使用无酶解离缓冲液收获粘附的细胞，例如此处所示的 HE 2 9 3 细胞，然后过滤它们以减少细胞簇的数量，过滤后将它们装入注射器中。
以每毫升 300， 000 个细胞的速度，使用注射泵上的正向流将细胞加载到芯片上，以每分钟 10 至 20 微升的速度加载细胞，对于此类粘附细胞，为了防止在陷阱填充时细胞的非特异性附着，通过用三个杆对顶层加压来关闭腔室。然后使用显微镜检查腔室。如果发现许多细胞非特异性粘附在腔室内的表面，请快速打开它们并尝试用细胞解离缓冲液以每分钟 10 至 30 微升的流速洗去。
对于葡萄糖 6 磷酸脱氢酶或 G 6 PDH 测定，向裂解缓冲液中加入 2 毫摩尔葡萄糖、6 0.5 毫摩尔磷酸盐和 DP 0.5 单位/毫升 DIA 阵列和 0.3 毫摩尔 RIN，并确保其充分混合。清除通道后，以每分钟 30 微升的流速将 G six PDH 裂解缓冲液吸过芯片。当裂解缓冲液流动时，快速打开和关闭腔室，让腔室打开 500 毫秒，以便裂解液在裂解开始监测动力学反应后立即进入腔室。
在本例中，可以监测荧光产物随时间的变化。这里显示的是一系列腔室，这些腔室充满了橙色食用染料，然后通过对微腔室上方的控制层加压来关闭。腔室关闭后，通过通道冲洗绿色食用染料，以显示腔室的密封性。
每个腔室仅包含 625 pgo 升的液体，可将 lys 细胞释放的分子浓度保持在足够高的水平以进行分析。此外，阀门可以以某种方式打开和关闭，以消除腔室之间的交叉污染。在这些腔室中，可以测量分析物，例如从单个 PMA 激活的 U 9 37 细胞释放的溶酶体的量，因为它在腔室内酶促催化荧光分子的产生。
绿线表示一个细胞所占据的腔室的荧光强度随时间的变化。还显示了由黑色虚线表示的无细胞腔室的荧光强度。为了进行比较，该测定通过测量细胞内酶 G six PDH 来显示毒性分子对膜完整性的影响。
黑线代表没有毒性影响的对照样品，而橙色线代表受所示毒素影响的细胞。这是细胞内蛋白免疫测定的一个例子。将 GFP 抗 GFP 抗体固定在表面，一旦细胞裂解，即可使用 Turf 显微镜观察 GFP 蛋白的结合动力学。
时间 0.1 标志着在时间 0.2 GFP 开始在表面上积累，这意味着细胞裂解已经发生，GFP 已经扩散到表面。GFP 与抗体的结合在时间 0.3 完成。在最后一个例子中，释放的 GA DH 与表面的捕获抗体结合，然后加入 HRP 偶联检测抗体。
洗去所有未结合的检测抗体后，引入检测试剂，反应随时间推移。以下是使用该方法测量的 U 9 37 和 HEC 2 93 细胞之间动物数量中以前细胞内 GA DH 的量的比较。看完这个视频后，您应该对如何制备微流控芯片、如何修改表面以实现免疫测定以及最后如何使用该设备进行单细胞分析有一个很好的了解。
这种方法可以帮助回答单细胞生物学领域的许多触发问题。
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概览
本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片，能够实现细胞内蛋白质和其他生物分子的定量分析。该方法利用荧光分析或免疫分析进行详细的细胞分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 单细胞分析
- 荧光分析
背景
- 单细胞分析对于理解细胞异质性至关重要。
- 微流控设备允许精确操控小体积。
- 荧光和免疫分析有效用于检测特定蛋白质。
- 抗体涂层增强了蛋白质检测的特异性。
研究目的
- 开发一种用于分析单细胞裂解物的微流控设备。
- 定量细胞内蛋白质和酶。
- 提高细胞反应刺激的效率。
使用的方法
- 创建一个带有抗体涂层腔室的微流控设备。
- 在微流控陷阱中固定单个细胞。
- 使细胞暴露于试剂以刺激反应。
- 使用裂解缓冲液释放蛋白质以供分析。
主要结果
- 在设备中成功固定和裂解单个细胞。
- 释放的蛋白质高浓度结合到抗体上。
- 证明了微流控芯片在定量分析中的有效性。
- 在细胞分析中具有广泛应用的潜力。
结论
- 微流控芯片是单细胞分析的一种有前景的工具。
- 荧光分析提供了蛋白质的准确定量。
- 该方法可以增强我们对细胞机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell chemical analysis is critical for deconvoluting cellular heterogeneity and understanding functional responses to chemical stimuli in early drug discovery. This microfluidic chip platform enables quantitative, high-sensitivity measurement of intracellular biomolecules from individual cells, supporting mechanistic de-risking and target validation. Its parallelized, reproducible format enhances predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cellular responses to defined chemical environments at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying intracellular proteins, enzymes, and second messengers.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing up- or down-regulation of molecular pathways in response to stimuli.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing analyte loss and maximizing sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free microenvironments for downstream quantitative assays.
- Delivers reproducible, high-sensitivity readouts suitable for assay standardization and platform reuse.
- Enables parallel analysis of multiple single cells, supporting scalable screening workflows.
- Provides robust quantitative outputs for reliable compound evaluation and comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis of primary or engineered cell types.
- Supports translational biomarker discovery through absolute and relative quantification of intracellular analytes.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by minimizing sample loss and dilution.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on high-fidelity single-cell data.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative single-cell analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled chemical perturbation and measurement of cellular responses.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible microchambers for high-sensitivity detection of intracellular molecules.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence and immunoassay readouts for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity by supporting both relative and absolute quantification in disease-relevant cells.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, array-based platform adaptable to diverse cell types and analytical targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows with reproducible, high-sensitivity single-cell assays.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing analyte loss and maximizing data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on robust single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, immunoassay design, and fluorescence microscopy.
- Needs access to microfabrication facilities and high-sensitivity optical detection systems.
- Demands rigorous cross-team standardization for chip preparation and assay execution.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific biological systems.
- Throughput is limited by array size and optical instrumentation; scalability depends on platform configuration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:13
Fabrication of the Microfluidic Chip
5:31
Chip Preparation for Enzymatic Assays
7:15
Additional Chip Preparation for Immunoassays
10:05
Cell Harvesting and Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Assay
12:08
Results: Enzymatic and Antibody Analysis of Single Cells
15:08
Conclusion
