Name: 一个微流控芯片单细胞的多功能化学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 了解微流控芯片单细胞多功能化学分析方法，通过荧光免疫测定法定量检测细胞内蛋白质。该技术利用抗体涂层微室实现高灵敏度特异性分析，有助于深入研究细胞异质性和分子机制。

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作者衷心感谢 Tom Robinson 对手稿的校对，感谢 C. Bärtschi 和 H. Benz 设计并搭建了定制的压力控制系统。我们还要感谢苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的 FIRST 洁净室设施和光学显微镜中心（LMC）的使用支持。本研究由 Merck Serono 和欧洲研究理事会（ERC）第七框架计划（ERC 起步基金，项目编号 203428，nμLIPIDs）资助。

1. SU-8 母版制作
采用以下方案制备通道（流体和控制）的两个主模具（示意图和尺寸参见图2），但使用不同的掩模图案。该过程如图3a所示。
<ol>
	<li>首先将一片4英寸的硅片在180 °C下加热10分钟。将脱水后的硅片装入旋涂仪中，并按照以下程序对SU-8 2015进行旋涂：
	<ol>
		<li>以100 rpm转速旋转硅片20秒（打开旋涂仪盖子，在此步骤中滴加SU-8，滴加完毕后关闭盖子）。</li>
		<li>以500 rpm转速旋转硅片10秒（使光刻胶均匀铺展至整个硅片表面）。</li>
		<li>以1,750 rpm转速旋转硅片30秒（使光刻胶厚度定义为20 µm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用丙酮（使用棉签）去除硅片边缘的光刻胶，否则在下一步中会粘附到加热板上。将硅片转移至95 °C的加热板上，加热4分钟。软烘结束后，在掩模对准仪中通过贴附于钠钙玻璃上的光掩模，用紫外光（365 nm处测量为150 mJ/cm2）照射光刻胶。</li>
	<li>曝光后，再次将硅片置于加热板上，在95 °C下加热5分钟。随后将硅片冷却至室温，再浸入SU-8显影液中4分钟。轻轻摇晃以去除未曝光的SU-8。用洁净室级异丙醇清洗硅片，并用氮气吹干。在显微镜下检查显影是否成功（特别是细胞捕获结构）。若细胞捕获结构已完全显影，则应能观察到硅片表面的反射光。如有需要，可再延长显影数分钟。</li>
	<li>将硅片放入烘箱中，在180 °C下烘烤2小时&#160;，以彻底去除残留溶剂。使用台阶仪检测微通道的高度。若高度与预期不符，则更换新硅片并从步骤1.1开始重复本方案，调整旋涂速度（步骤1.1.3）。最后，在干燥器中使用1H,1H,2H,2H-全氟癸基二甲基氯硅烷对硅片进行过夜硅烷化处理，完成母模的制备。</li>
</ol>
2. 微接触印刷用主模板的制备
<ol>
	<li>为了制备用于微接触印刷的主模具，将硅片在 180 °C 下脱水 10 分钟。以 7,500 rpm 的转速在该硅片上旋涂 1 ml HDMS，持续 30 秒（光刻胶在硅烷化表面上附着性更好）。使用以下程序在硅片上旋涂 2 ml AZ1518 正性光刻胶：
	<ol>
		<li>将光刻胶静态滴加到硅片表面。</li>
		<li>以 500 rpm 转速旋涂 5 秒。</li>
		<li>以 4000 rpm 转速旋涂 60 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在热板上于 100 °C 进行 50 秒的前烘后，通过掩膜版和掩膜对准仪将光刻胶暴露于紫外光下（365 nm 波长，剂量为 21 mJ/cm2）。将硅片浸入 AZ 726 显影液中显影 75 秒。用去离子水冲洗显影后的硅片，并用氮气吹干。在 115 °C 下加热 50 秒以去除残留溶剂。将硅片置于真空条件下过夜进行硅烷化处理。</li>
</ol>
3. 微流控芯片的制备
本实验采用双层装置设计。这两层需分别制备，然后键合在一起，最后将芯片键合到玻璃载片上（图3b）。此步骤描述了PDMS层以及用于微接触印刷的PDMS印章的制备过程。
<ol>
	<li>制备 PDMS 与固化剂按 10:1 比例的混合物。总共准备约 80 g PDMS（使用我们的设计可制作 10 个芯片）。充分混合两组分，并对 PDMS 进行脱气处理，直至混合物中无气泡（约 30 分钟）。</li>
	<li>将带有控制层的晶圆放入培养皿中，并用胶带固定于底部。随后，在其表面倒入 &#160;约 50 g PDMS，并将晶圆置于 80 °C 烤箱中至少 2 小时&#160;，以确保 PDMS 完全固化。对用于微接触印刷的晶圆重复相同操作，此步骤约需 20 g PDMS。</li>
	<li>在带有流体层的晶圆上以 2,000 rpm 的转速进行旋涂 PDMS，形成厚度约为 40 µm 的 PDMS 层。将 PDMS 在 80 °C 烤箱中固化至少 1 小时&#160;。</li>
	<li>当两部分均完成固化后，将控制层从晶圆上取下，并用剃刀片切割成小片。使用 1 mm 组织打孔器打孔以形成压力连接孔。储存时，建议在通道上覆盖一片胶带。</li>
	<li>为键合两层，取旋涂后的晶圆和上层部分，放入等离子清洗仪23中。经等离子处理后，迅速在长工作距离显微镜下对准两部分。在上层部分周围添加少量备用 PDMS。此步骤非必需，但有助于后续将 PDMS 从晶圆上剥离。将晶圆置于 80 °C 烤箱中至少 1 小时。</li>
	<li>使用手术刀小心地将 PDMS 从晶圆上剥离，并切割成微芯片。使用 1.5 mm 组织打孔器为流体连接处打孔。</li>
	<li>PDMS 芯片现已完成，可长期储存数月。可选步骤：若芯片需与储液池配合使用，可截取 200 µl 移液枪头的上半部分，并用少量半固化 PDMS 将其粘接在芯片顶部。再次将芯片放入 80 °C 烤箱中至少 1 小时。</li>
</ol>
4. 与玻片的粘合
若要将该装置用于直接酶法测定，键合后唯一需要的步骤是表面封闭。对于本方案，请继续进行步骤A。然而，若要将微流控芯片用于免疫测定或ELISA，请参考方案B，以将结合位点仅限制在玻璃载玻片上（即 用于全内反射荧光显微镜或表面等离子体共振）。如果此限制不重要，请参考步骤A，但在步骤4.3中使用生物素化偶联物，并继续进行方案B中的步骤4.8，以构建一个完全功能化的表面。
在执行方案 A 和 B 之前：建议在将所有蛋白质溶液引入芯片前进行过滤。否则，杂质和蛋白质聚集体可能会堵塞细胞捕获结构，从而减少可用于分析的腔室数量。为此，应在将所有溶液引入通道前，使用非蛋白质吸附型滤器装置对溶液进行过滤。
方案 A（酶学测定）
<ol>
	<li>为完成微流控装置，需将PDMS部件键合到玻璃载片上。首先，用肥皂、蒸馏水和乙醇清洗玻璃载片，然后用氮气流吹干。用透明胶带清洁PDMS部件。</li>
	<li>将PDMS部件和已清洁的玻璃载片放入等离子清洗仪中，在18 W条件下处理45秒。为确保牢固键合，将芯片置于加热板（100 °C）上加热5分钟。</li>
	<li>键合完成后，向芯片内填充液体。一种简便的方法是利用离心力。剪去200 µl移液器吸头的底部。对于流体通道，使用封闭溶液（牛血清白蛋白（4% w/v）或聚-L-赖氨酸）接枝的聚乙二醇（0.05% w/v）填充，并将吸头插入入口。控制层的入口则填充水或等渗溶液，e.g. PBS。将芯片放入离心机中（800 × g）离心5分钟。此时通道应已完全充满液体。若未完全填充，请重复此步骤。</li>
	<li>在室温下孵育封闭溶液至少30 min&#160;。使用注射泵以10 µl/min的流速用PBS冲洗流体层中的溶液。该装置现在可用于细胞实验。</li>
</ol>
方案B（免疫测定）
有关从步骤 4.7 开始的表面修饰的完整概述，请参见表 1。
<ol start="5">
	<li>将用于微接触印刷的PDMS印章与bBSA/BSA溶液孵育（例如 1–100）。30 分钟后，用蒸馏水彻底清洗印模，并用氮气流吹干印模。迅速将印模放置在已清洁的玻璃载片上（图4).</li>
	<li>将带有印章的载玻片与微流控芯片的上部一同置于等离子清洗仪中，在最大功率（18 W）下进行氧气等离子体处理45秒。等离子处理后，取下印章，将印有图案的一面与器件的微腔区域对齐。将芯片置于50 °C加热板上30分钟。</li>
	<li>为封闭剩余表面，使用离心机将经无菌过滤的牛血清白蛋白溶液（4% (w/v) 溶于 PBS）引入芯片（参见步骤 4.2）。孵育 1 小时后，用 PBS 洗去流体层中的溶液（参见步骤 4.3）。芯片可立即使用，或置于湿盒中于 4 °C 保存最多 2 周。</li>
	<li>为获得完全功能化的结合表面，将亲和素（0.025% (w/v)，溶于PBS）引入储液池中，以5 µl/min的流速作用30分钟。&#160;通过流体通道抽出亲和素溶液。随后用 PBS 冲洗 10 分钟。彻底清洗储液池。</li>
	<li>随后，加入蛋白G（PBS中0.0025% (w/v)），冲洗30分钟。再用PBS洗涤10分钟。&#160;随后，加入目标抗体（PBS 中浓度为 0.0001% (w/v)），孵育 10 分钟。10 分钟后，停止流动，静置 15 分钟。&#160;以促进结合。随后，用PBS洗涤10分钟。</li>
</ol>
5. 细胞实验
由于可能的检测方法种类繁多，本方案以通用形式撰写。以下以G6PDH毒性检测所需的试剂为例进行说明。该装置的初始细胞捕获效率约为2.5%，即&#160;每200个细胞中约有5个被成功捕获。细胞捕获腔的最终占据率在很大程度上取决于所使用的细胞系、细胞系的悬浮处理方法以及细胞流经通道的时间。对于天然悬浮生长的细胞（如U937），在数分钟后约75%的微腔中可观察到单个细胞。其余微腔则要么未被填充，要么被两个或更多细胞占据。通常情况下，贴壁细胞系的单细胞占据率较低。当采用本文所述的较为温和的悬浮处理方法时，单细胞占据率下降至约30%（HEK、MLT细胞）。可通过胰酶处理细胞来提高单细胞占据率，但这可能同时改变实验结果。
根据目标分子的不同，吸附或吸收至PDMS可能会影响实验结果。可通过使用BSA或PLL-g-PEG封闭表面来减少吸附。大多数亲水性生物分子不易发生吸收，但应检查（小分子）亲脂性细胞组分是否存在吸收情况。
<ol>
	<li>根据特定方案准备细胞（例如 药物添加）。对于悬浮细胞，直接将细胞加入芯片中；对于贴壁细胞系，使用无酶解离缓冲液制备细胞悬液。在将细胞引入芯片前进行过滤，以减少细胞团块的数量。</li>
	<li>使用注射泵以正向流的方式将细胞加载到芯片上，而不是回抽细胞悬液。悬浮细胞系的流速为 5 µl/min&#160;对于粘附性细胞，使用10–20 µl/min的较高流速，以减少细胞在通道壁上的非特异性黏附。</li>
	<li>当捕获装置充满后，关闭腔室。若大量细胞非特异性地黏附于表面，可尝试使用细胞解离缓冲液以10-30 µl/min的流速冲洗去除。</li>
</ol>
方案 A（酶学测定）
<ol start="4">
	<li>通过芯片抽吸裂解缓冲液。本示例中，该缓冲液为低渗缓冲液，含有添加的Tween 20（10 mM Tris-HCl，10 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1% (v/v) Tween 20）。进行裂解时，快速开启并关闭腔室（即 在流速为10–50 µl/min时，持续约500毫秒7,21）。对于G6PDH测定，需在裂解缓冲液中加入2 mM葡萄糖-6-磷酸、0.5 mM NADP、0.5 U/ml 甲臜还原酶（diaphorase）和0.3 mM刃天青（resazurin）。裂解后应立即开始监测动力学反应。</li>
</ol>
注意：可选择任何适用于检测的缓冲液，但需注意强效去污剂（如Triton、SDS）会立即裂解细胞，导致在打开检测室时分析物丢失。
方案B（免疫测定）
ELISA 细胞实验的简要描述（流速、腔室状态， 等等。），请参阅 表1.
<ol start="5">
	<li>对于ELISA，加入所需的检测试剂（例如 二抗、标记抗原）直接加入裂解缓冲液中。此处添加的Tween 20可减少非特异性吸附。按照步骤5.4裂解细胞。孵育混合物10–15分钟，以促进结合（孵育时间取决于所用抗原和抗体）。</li>
	<li>非特异性吸附在通道壁上的抗体-酶偶联物可能导致储液池和通道内已存在的检测试剂发生转化。为减少此类吸附带来的问题，可在孵育期间（在加入检测试剂前，关闭腔室）将所用检测试剂酶的永久性抑制剂冲洗通过芯片。对于辣根过氧化物酶（HRP），可使用20 mM盐酸水溶液以永久失活非特异性吸附的酶。</li>
	<li>孵育结束后，加入检测试剂（例如 Amplex Red 和过氧化氢用于 HRP）加入芯片。短暂打开反应室，洗去未结合的二抗，并加入检测试剂。立即开始监测动力学反应。</li>
	<li>校准：固定针对目标分子的抗体，封闭反应室。在芯片外使用缓冲液或细胞裂解液配制不同浓度的分析物。将某一浓度的分析物施加到芯片上，并快速置换反应室内的液体体积（开启时间为500毫秒）。该开启时间足够短，可确保在冲洗过程中分析物不会额外累积，仅检测微室体积内特定数量的分子。根据溶液中抗原的已知浓度和反应室体积（625皮升），计算反应室内分子的数量。随后，继续执行步骤5.5，引入检测组分。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

微流控技术为单细胞分析开辟了崭新而引人入胜的可能性。特别是利用微流控工具对细胞进行单个捕获和固定，使得针对单细胞特性及其响应的系统性短期和长期研究成为可能。此外，在芯片上生成的高频微液滴中封装细胞，实现了单细胞分泌研究，而这是传统流式细胞仪无法完成的。然而，当分析流程需要孵育和洗涤步骤时，微液滴方法存在一定的局限性。我们的方法结合了细胞捕获与隔离两种理念，因而有助于开展更为复杂的检测，包括基于表面固定化抗体的免疫分析。此外，该方法在应用和目标分析物方面具有很高的灵活性。
该微芯片的设计具有以下特点：(i) 高效捕获细胞，(ii) 可供给多种缓冲液和试剂，以及 (iii) 在需要时可在极小体积下实现可靠隔离。通过这种方式，可避免目标分子被稀释。单个装置上设有六十个（至数百个）微腔室，可同时进行大量平行实验。用于封闭微腔室的圆形阀门可通过行或列的方式统一或独立控制，这在需要防止相邻腔室之间发生交叉污染时尤为重要。当微腔室处于封闭状态时，通道可用盐酸等有害溶液进行清洗处理，而不会影响已被捕获的细胞。另一方面，微腔室内部体积的快速置换也是可行的。目前，完全打开腔室并引入新试剂所需的最短时间...

过去许多研究揭示了大量细胞群体中细胞与细胞之间的差异1-3，特别是信号传导过程4&#160;以及细胞内生物分子（如蛋白质5,6、代谢物和辅因子7,8）的含量差异。这些异质性被认为对细胞的适应与进化具有根本性的重要意义9，同时在癌症等疾病的发生及治疗中也发挥着关键作用10-13。因此，在生物学和药理学研究中，单细胞水平的研究具有高度重要性，尤其是当这些研究能够揭示细胞在生物活性化学物质处理后所表现出的不同响应时。
近年来，已开发出多种分析平台，用于促进对单个活细胞或细胞内化学成分的分析。尽管荧光激活细胞分选（FACS）是高通量分析单个活细胞的金标准方法，但该方法无法用于细胞内或分泌化合物的定量分析。微流控平台的出现为单细胞的定位、处理和观察提供了新的分析策略。Quake 及其同事将柔性 PDMS 阀集成到微流控系统中，成为微流控技术发展的一个里程碑14,15。这些阀门非常有用，因为它们可以在芯片上隔离特定区域，例如 分隔两个细胞培养体系16。此外，它们特别适用于单细胞分析，从而有助于减轻分析物稀释的问题。Hansen 及其同事最近展示了该方法在单细胞分析中的强大能力，实现了对数百个单细胞基因表达的并行分析17。
在靶向蛋白质和代谢物时，由于缺乏合适的扩增方法、存在大量不同类型的化合物以及这些化合物在化学性质上的多样性，分析过程非常困难。此外，大多数细胞内生物分子的拷贝数预计仅为数万个量级18，因此所采用的分析方法必须具有高灵敏度。诸如免疫测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）等更强大的检测方法难以整合到微流控装置中，因为它们需要多个洗涤和孵育步骤，以及表面固定化过程。
由于这些挑战，目前仅有少数研究报道了在单细胞水平上对蛋白质或代谢物进行定量分析。例如，已有研究报道了对荧光化合物分泌的检测19,20。最近，有研究将ELISA技术应用于细胞培养物（THP-1细胞）21以及单个（免疫）细胞10分泌的（非荧光）蛋白质分析。针对细胞内蛋白质，Shi et al. 开发了一种微流控装置，通过免疫分析法实现了肿瘤细胞信号通路相关细胞内蛋白质的鉴定11。然而，这些方法仅测定了蛋白质的相对含量，且未采用酶促扩增手段来增强低丰度蛋白质的检测信号。
最近，我们成功地将单细胞捕获微装置与荧光分析8和免疫分析22相结合（图1）。细胞被动捕获在微米级障碍结构中，可在细胞不发生移动的情况下实现培养基及其他化学试剂的供给和（快速）更换。每个捕获位点周围设有环形阀门，可将细胞隔离至极小体积的“微室”中。在加入细胞裂解（低渗）缓冲液后，该阀门立即启动，从而防止细胞内分子或分泌分子扩散流失。尤为重要的是，由于微室体积很小（625 pl），可避免分子被大幅稀释。此外，由于裂解和分析均在芯片的同一位置进行，因此不会因样品转移造成分析物损失。本文所述芯片设计包含8排交替排列的微室，每排分别有7个或8个微室，共60个微室。微室按排进行控制，从而避免沿同一排发生交叉污染。
该平台可与荧光检测以及免疫学检测联用（图1d）。对于后者，我们建立了与芯片制备和组装过程兼容的抗体固定化方案。因此，该平台为在单细胞水平上开展高灵敏度、可靠且可定量的检测开辟了途径。迄今为止，我们已将该装置用于分析细胞内及分泌的酶（通过酶学检测进行相对定量）、细胞内辅因子、蛋白质和小分子（通过终点法检测或ELISA进行绝对定量）。下文将描述利用多层软光刻技术进行芯片制备的过程，以及通过微接触印刷和表面化学实现抗体图案化的相关方案。此外，还提供了一些芯片使用与操作的实例。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>评论（可选）</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem公司（美国马萨诸塞州牛顿市）</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-全氟癸基二甲基氯硅烷</td><td>ABCR（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基伞形基 &amp;beta;-D-N,N&amp;prime;二乙酰基壳二糖苷水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>默克 VWR（德国达姆施塔特）</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>亲和素</td><td>AppliChem（Axon Lab AG）</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ电子材料（德国威斯巴登）</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>AZ 726 显影液</td><td>AZ电子材料公司（德国威斯巴登）</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HDMS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>默克 VWR（德国达姆施塔特）</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR显影剂600</td><td>Microresist technology GmbH（德国柏林）</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG 接枝</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;本多夫，瑞士</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG 接枝生物素</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;本多夫，瑞士</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>蛋白G，生物素</td><td>Sigma精细化学品</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Si-Mat（德国考弗灵）</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）</td><td>道康宁</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>评论（可选）</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES 注射器滤器</td><td>瞬时受体电位</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 mm 活检穿孔器</td><td>Miltex，约克，宾夕法尼亚州，美国</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 滤膜 20 &amp;micro;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 3-18K 离心机</td><td>Kuehner</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate HP 160 III BM</td><td>Sawatec，Sax，瑞士</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>MA-6 掩模对准器</td><td>Karl Suess</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>多焦距AZ100M显微镜</td><td>尼康公司</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>英国埃塞克斯米克罗利托</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机 PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>甩涂机型号 WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>Spin Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec，Sax，瑞士</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>台阶仪 Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>未提供</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

我们介绍了一种微流控装置，可实现对多个单细胞内生物分子进行并行的定量测定。该装置通过被动捕获的方式将细胞固定于微腔室中央。当控制层被激活时，细胞被隔离于一个微小腔室内，使其与周围环境分离。随后可在不影响被隔离细胞的情况下更换周围液体环境。通过短暂开启和关闭腔室，可在数百毫秒内完成腔室内溶液的置换。由于腔室操作具有可逆性，细胞可按需依次暴露于不同的溶液环境中，且调控精度极高。 例如 用于孵育、洗涤，最终进行细胞裂解。密封良好的微腔可有效保留裂解液，并在细胞裂解后最小化且可控地减少稀释效应。由于裂解和分析在同一位置进行，分析物在转移过程中不会发生进一步稀释或损失，因而保持了高灵敏度。因此，该微腔设计能够对单个细胞释放的极少量细胞内分子（zeptomoles，attomoles）进行可靠且可重复的定量分析。此外，多个微腔可排列成阵列形式，只要采用适当的光学仪器进行监测，即可实现对大量细胞的并行分析。我们已利用该平台开展概念验证研究，以相对或绝对定量的方式分析细胞内蛋白质、酶、辅因子以及第二信使。

我们的平台能够分析存在于单个细胞内或由单个细胞分泌的多种分子。在此，我们展示不同的示例研究，以突出该检测方法的广泛应用范围。我们将分别举例说明一种分泌型酶（图5a）、一种细胞内酶（图5b）以及细胞内蛋白（图5c 和 图5d）。有关辅因子或小分子等其他示例，请参见 Eyer et al. (2012) 和 Eyer et al. (2013)。
首先，我们介绍一种针对分泌型酶的检测方法（图5a）。在佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）激活后，人单核细胞会诱导分泌溶菌酶，这是一种可导致细菌细胞裂解的酶。在该检测中，细胞缓冲液含有4-甲基伞形基-β-D-N,N′-二乙酰壳二糖苷（4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside），它是溶菌酶的弱荧光底物。当酶切解糖残基后，荧光基团被释放，可在微室内部被检测到。此处，微室的优势在于显著减少了...

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。&#160;

我们介绍了一种微流控装置，可实现对多个单细胞内生物分子进行并行的定量测定。为此……

以下实验的总体目标是利用荧光或免疫分析方法分析单细胞裂解物。首先制备微流控装置，并在内腔表面包被抗体；然后在第二步中将单个细胞固定在捕获结构中，并暴露于多种试剂以刺激细胞产生响应。环形阀门迅速关闭，裂解缓冲液流经装置。环形阀门短暂打开，细胞在微腔室内裂解，由于体积微小，释放的蛋白质得以在高浓度下与抗体结合。随后，环形阀门再次打开。对反应室进行清洗后，将检测试剂引入封闭的微反应室中。使用荧光显微镜随时间监测荧光强度的增加，结果表明该系统能够定量且可靠地检测来自单个细胞的目标分析物。该方法有助于回答单个A细胞分析领域的关键科学问题。特别是，它对细胞在化学环境变化下的响应进行了系统性研究。我们可以观察到，由于化学刺激导致细胞内分子的上调或下调。该技术具有两个主要优势。第一，我们可以使固定化的细胞暴露于一个确定的化学环境中，该环境可以是恒定的或周期性变化的。第二，我们可以在没有交叉污染或分析物因运输而损失的情况下，对分析物进行高灵敏度和高特异性的重新分析。首先，按照随附文本方案中所述，制备三种不同的SU-8母体晶圆。其中一个用于制作流体层，一个用于控制层，第三个用于微接触印章。然后开始制备微流控芯片，首先准备10:1的PDMS与固化剂混合物。充分混合两部分，并将溶液脱气30分钟，直至混合物中无气泡。接下来，将晶圆置于培养皿内的控制层中，并用胶带固定在底部。倒入约50克PDMS，形成4至5毫米厚的层，然后将晶圆放入80摄氏度的烘箱中至少2小时，以确保PDMS完全固化。对微接触印刷用晶圆重复相同操作，但使用约20克PDMS而非50克，从而形成4至5毫米厚的PDMS层。制备底层时，将一层40微米高的PDMS涂覆在带有微流控层的晶圆上进行旋涂。旋涂参数为2000 RPM转速，持续60秒。当所有部件均完成固化后，在80摄氏度的烘箱中将PDMS层烘烤一小时。用刀片辅助将控制层从晶圆上取下并切成小片。然后使用1毫米的活检穿孔器打孔以制备压力连接孔，并用胶带覆盖通道用于储存。接着，从微接触印刷晶圆上方取下PDMS，并制备与腔室区域大小相同的印章。将它们存放在无尘抽屉中，直至使用。然后将旋涂晶圆和4至5毫米厚的控制层放入等离子清洗仪中。在0.75毫巴的氧气等离子体条件下，以18瓦功率处理45秒。等离子处理后，在具有较大工作距离的显微镜下迅速对齐两层。在已放置的上层部件周围添加一些多余的PDMS，以方便后续从晶圆上剥离PDMS。然后将晶圆置于80摄氏度的烘箱中至少一小时。固化后，使用解剖刀小心地将PDMS从晶圆上剥离，并用1.5毫米的活检穿刺针在微芯片上打孔，以留出用于流体连接的穿孔。此外，通过剪下200微升移液器吸头的上半部分，并使用一些备用的半固化PDMS，制作微芯片中的储液池，并将其粘接在顶部。然后将芯片在 80 摄氏度的烘箱中固化至少一小时。首先清洁载玻片和 PDMS 部件。用肥皂清洁载玻片。用蒸馏水冲洗，然后再用乙醇冲洗。使用氮气流干燥载玻片。用胶带去除PDMS上的任何碎屑和灰尘颗粒。然后将PDMS部分和清洗后的玻璃片放入等离子清洗仪中，在18瓦功率下处理45秒，以确保牢固键合。等离子处理后，将芯片置于加热板上加热5分钟。键合完成后，剪去几个200微升移液器吸头的下端，用含4% BSA的过滤PBS溶液填充10至15微升，并插入装置的进样口。然后使用剪去尖端的吸头，加入 10 至 15 微升 PBS，并将其插入对照通道中。接着将芯片放入离心机，以 800 ×g 离心 5 分钟，使液体充满通道。如果通道中仍有气泡残留，请重复此步骤，直至通道完全充满液体。将封闭液在室温下孵育至少30分钟。然后以每分钟10 µL的流速用PBS洗去流体层中的封闭液。使用注射泵，该装置现已准备好进行细胞实验。为免疫测定预印载玻片，将PDMS微接触印刷印章与0.5%生物素化BSA在洁净的培养皿中孵育。半小时后，用蒸馏水彻底且快速地清洗印章，并用氮气流吹干印章。干燥后，迅速将印章放置在已清洁的玻璃载片上，以转移图案化的生物素化BSA。放置后切勿移动印章，并检查印章是否与玻璃载片完全接触。如果稍有不稳，轻敲印章，但不要用力按压。然后将印章连同微流控芯片的上部一起放入等离子体腔室中，在18瓦功率下暴露于氧气等离子体中45秒。等离子体处理后，将印章从玻璃载片上取下。在表面呼吸会使图案显现。将微型腔室对准并放置在打印好的表面上。对准后，将芯片置于50摄氏度的加热板上30分钟，以封闭剩余表面；随后用离心机将4%经无菌过滤的PBS BSA溶液注入芯片中（操作如前所示），孵育微芯片至少30分钟，然后以每分钟10微升的流速用PBS冲洗流体层中的溶液。使用注射泵，可直接使用该芯片，或在4°C的湿盒中保存长达两周。接下来，将avidin加入PBS缓冲液并注入储液池，以形成完全功能化的结合表面。随后使溶液流动，将avidin通过流体通道输送。用 PBS 充分冲洗储液池，并冲洗通道。然后向储液池中加入蛋白 G，并使其流经通道。再用 PBS 冲洗储液池和芯片，以洗去未结合的过量蛋白 G。接下来，将目标抗体加入储液池，并使其流经微通道。然后停止流动，孵育以促进结合，再用 PBS 洗涤通道。在将细胞引入通道之前，可使用荧光标记的类似物来检测打印过程的质量。使用无酶解离缓冲液收获贴壁细胞（如此处所示的 HEK 293 细胞），然后过滤以减少细胞团簇的数量。过滤后，将细胞悬液装入注射器中。每毫升300,000个细胞，在注射泵上以正向流体加载细胞，流速为每分钟10至20微升，持续约3分钟，适用于此类贴壁细胞，以防止细胞在捕获结构填满后非特异性地附着；当捕获结构充满细胞后，通过向顶层施加3 bar压力来关闭腔室。随后使用显微镜观察腔室。若发现大量细胞非特异性地黏附于腔室内表面，则迅速打开腔室，并以每分钟10至30微升的流速用细胞解离缓冲液尝试冲洗去除。对于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）检测，向裂解缓冲液中加入2毫摩尔葡萄糖-6-磷酸、0.5毫摩尔NADP⁺、0.5单位/毫升DIA阵列以及0.3毫摩尔RIN，确保充分混匀。通道清洗完成后，以30微升/分钟的流速将G6PDH裂解缓冲液通过芯片。在裂解缓冲液流动过程中，迅速打开并关闭各个反应室，保持开启状态500毫秒，以使裂解液立即进入反应室，并在裂解开始后立即监测动力学反应。在此示例中，可随时间监测荧光产物。图中显示的是一组微腔室阵列，腔室内填充了橙色食用染料，然后通过加压微腔室上方的控制层将其封闭。腔室封闭后，用绿色食用染料冲洗通道，以验证腔室的密封性。每个腔室仅含有625皮升的液体体积，可使裂解细胞释放的分子浓度保持在足以进行分析的高水平。此外，可通过控制阀门的开关方式，有效消除腔室之间的交叉污染。在这些腔室中，可检测单个PMA激活的U 937细胞所释放的溶酶体等分析物，该细胞可在腔室内通过酶促反应催化生成荧光分子。绿色线条代表由单个细胞占据的腔室中荧光强度随时间的变化。图中还显示了无细胞腔室的荧光强度，以黑色虚线表示。作为对比，本实验通过测量细胞内酶G六PDH来显示有毒分子对膜完整性的效应。黑线代表无毒性影响的对照样品，而橙线代表受所示毒素影响的细胞。这是一个针对细胞内蛋白的免疫测定示例。将GFP抗GFP抗体固定在表面，细胞裂解后，利用turf显微镜观察GFP蛋白的结合动力学。时间点0.1标志着在时间0时裂解缓冲液的加入。0.2时，GFP开始在表面积累，表明细胞裂解已经发生，GFP已扩散至表面。在时间点0.3，GFP与抗体的结合完成。在此最后一个示例中，释放的GA DH与表面的捕获抗体结合，随后加入HRP标记的检测抗体。一旦所有未结合的检测抗体被洗去，便加入检测试剂，并随时间推移完成反应。以下是利用该方法测定的U 9 37和HEC 2 93细胞中先前存在于细胞内的GA DH在动物数量上的比较结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备微流控芯片、如何对表面进行修饰以实现免疫分析，以及最终如何利用该装置进行单细胞分析。该方法可用于帮助回答单细胞生物学领域中的许多引发性问题。

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生物工程

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