优化的实验方案 Mycobacterium leprae 品系管理：裸鼠冷冻保种与维持

本研究的目的是展示如何制备高活性的分枝杆菌脂质悬液，用于注射至裸鼠体内。我们将从感染小鼠中获取基础生命物质，最好是在感染的早期阶段进行。

为确保获得高活力的器官产量，应在生物安全柜内实施动物安乐死。用止血钳夹住后肢足垫。用剪刀剪下后肢，并将其浸入2%碘溶液中20分钟进行消毒，操作时保持足垫朝上的体位。

使用手术刀片收集软组织，去除第一和第五节指骨的骨骼，以便于组织的匀浆化。将组织置于无菌的培养皿中。刮除表皮。

用剪刀将肉芽肿组织切成小块，留待后续进行组织产量计算程序。将组织小块转移至含有1 ml Hank's平衡盐溶液的离心管中。再加入1 ml Hank's溶液，于4号速度下每次匀浆15秒，共匀浆三次。

将细胞筛置于一个50 ml无菌锥形管中。用移液器将悬液加至细胞筛上，让溶液依靠重力自然滤过。为去除碎片，向悬液中再加入两份hanks的MLS，再次进行匀浆处理。

使用相同的循环，将悬液通过该滤器过滤。通过添加成纤维细胞来包绕滤器。为使悬液总体积达到 9 ml，向悬液中加入 1 ml 0.5% 胰蛋白酶溶液，以获得 0.05% 的终浓度。

轻轻倒置试管，混匀后于37摄氏度孵育60分钟。孵育结束后，加入无菌生理盐水将悬浮液体积调至4 mL，于1700 ×g 离心30分钟（温度为4摄氏度），弃去上清液，通过轻敲试管重悬沉淀。加入1 mL血清生理盐水并混匀。

将悬液转移至新管中。在将悬液转移至新管的同时，使用带有26号针头的1 ml胰岛素注射器对血管悬液进行匀浆处理。通过滴加两滴18号培养基和七滴H九脑心浸液培养基，对悬液进行微生物学对照。

11 Stein Genesen 在37摄氏度下孵育。然后按照常规微生物学控制程序进行操作。用于Z染色。

用生理盐水将S悬液进行1至10和1至100的稀释。在制备计数用样品前，需将每种稀释液充分混匀，并使用永久性记号笔在每张载玻片表面画出三个内径为10毫米的圆圈，共制备三张载玻片。

现在用免疫组化笔围绕这些圆圈画线。使用2号铅笔标记载玻片，为三种血清浓度做好准备：未稀释、1:10 和 1:100。

用移液器向每个圆圈内加入5 µL酚血清溶液和10 µL唾液悬液，混匀并将悬液均匀涂布于圆圈区域内。使用一次性接种环的柄部，将这些载片置于水平桌面上晾干。待干燥后，将载片悬液面朝上，通过蓝色火焰灼烧三次，以固定样本。

执行一次祖尼维持代码操作。检查这些玻片。三个稀释度。

选择最适合的稀释比例进行细菌计数。通过在121摄氏度下高压灭菌30分钟，制备200微升的灭活细菌悬液。使用L 7 0 0 7活死荧光染色试剂盒对微生物脂质进行荧光染色。

使用前，将溶液A进行1:10稀释，将溶液B进行1:20稀释。向每200微升未稀释的原始血管悬液及灭活样本中，分别加入3.6微升稀释后的溶液A和6微升稀释后的溶液B。在避光条件下孵育15分钟后，于4摄氏度、10,600 ×g离心5分钟。用移液器小心吸除上清液。

将沉淀重悬于50微升10%甘油中，通过反复吹打混匀。取每种悬液8微升置于玻片上，加盖一张小的盖玻片，避光保存。

在荧光显微镜下观察悬浮液。用每毫升含10至七个BA脂质体的浓度制备悬浮液，每个冻存管中加入1 ml冻存液。然后向1 ml冻存液中加入150微升S悬浮液，并通过倒置试管使其充分混匀。

将冻存管放入冻存盒中，在负80摄氏度条件下保存至少24小时。将冻存管转移至储存盒中，并在负80摄氏度条件下保存以备解冻使用。

将冷冻悬液在37摄氏度的水浴中解冻。将悬液转移至含有20毫升无菌生理盐水的锥形管中。拒绝浓缩。

将巴林氏菌按照Z维持方案进行计数，并采用荧光染色方案测定其变异性。制备每餐含有10至8个BA的悬液，在接种每只动物前将悬液充分匀质化。用胰岛素注射器吸取100微升，向每只动物的后足垫接种30微升，用于活力测定。

在所有BAI中均观察到绿色荧光，而红色荧光仅在该BAI中出现。当该BAI为无菌对照时，观察到的绿色和红色BAI荧光强度相同。将不同保存时间的M. lepar冻存菌株进行接种，七个月后回收的BAI数量增加了10至1000倍。

最后需要说明的是，由于 IL leid 无法在体外培养，本方案提供了一种快速且简便的方法，可在实验室中维持具有活性的 yl Leid，以便后续使用。