运动神经切断及活体斑马鱼中胶质细胞行为的延时成像

本实验的总体目标是对活体斑马鱼幼鱼在周围神经损伤后胶质细胞的行为进行延时成像。首先将麻醉后的斑马鱼幼鱼固定在玻璃底培养皿中的低熔点琼脂糖中，并用解剖针调整其位置。随后，将固定好的幼鱼置于共聚焦显微镜下进行观察。

选择一条神经进行消融，并获取未损伤神经的轴突和胶质细胞图像。随后沿神经选定感兴趣区域（ROI），发射激光消融所选区域，从而制造神经横断。最后，对神经横断后的轴突和胶质细胞进行延时成像观察。

最终，可以通过时间序列共聚焦显微镜获得显示神经变性与再生过程中胶质细胞动态行为的结果。该方法有助于回答再生生物学和胶质细胞生物学领域中的关键科学问题，例如：胶质细胞如何响应神经损伤？以及在神经变性与再生过程中，不同亚型的胶质细胞如何协调其行为？

在获得携带可荧光标记运动神经元及目标胶质细胞类型的转基因成年斑马鱼并交配后，将受精卵孵育至受精后24小时（HPF），移除养卵用水，并替换为含1 pH牙科线或PTU的养卵用水，随后将胚胎放回培养箱。自此时间点起至约96 HPF期间，使用荧光解剖显微镜筛选胚胎中是否存在目标荧光基因。将呈阳性的胚胎转移至新鲜的含PTU养卵用水中，并放回培养箱继续培养。

当幼鱼达到受精后六天（DPF）时，挑选少量胚胎用于制片，并将其转移至较小的培养皿中。吸去培养皿中的水，立即替换为含有0.02%三卡因（trica）的PTU卵水，将幼鱼在麻醉剂中孵育约五分钟。将一个按照文本方案预先配制好的0.8%低熔点琼脂糖（agros）置于烧杯中，加入自来水后放入微波炉加热。

将烧杯冷却30秒，或直至琼脂融化，直至琼脂管摸起来温热。接着，将一只麻醉的幼虫转移至一个35毫米的玻璃底培养皿中。移除培养皿中的任何水分。

然后立即用足量温热的琼脂糖覆盖幼虫，填满培养皿的玻璃底部区域。待琼脂糖凝固过程中，使用解剖针将幼虫调整至侧卧位置，再略微倾斜使其背部朝上，确保固定好的幼虫与培养皿底部的玻璃面接触，这是进行损伤处理和成像所必需的。

用针固定幼虫，直至琼脂凝固并使幼虫完全固定。然后缓慢加入足量三蒸水至培养皿中，完全覆盖琼脂和幼虫。打开共聚焦显微镜所有仪器设备、用于激发斑马鱼转基因的合适二极管激光器，以及氮气泵浦染料激光器。

确保空白分束器已安装到位，并且435纳米染料激光器和染料池已正确放置。将激光衰减器完全打开，然后使用63倍、数值孔径1.2的水浸物镜，以及一侧带有镜面的玻片，打开成像软件。使用明场照明找到镜面上的划痕或刻痕，并对其进行聚焦。

使用成像软件，在控制激光校准和功率设置的窗口中查看并聚焦计算机屏幕上的刻蚀图像。将脉冲数设置为1，从主工具栏中将衰减设置为3%透射率。选择椭圆工具，然后单击计算机屏幕上的图像。

重复此过程三次，共创建四个圆形 ROI，使四个圆形 ROI 在图像上随机分布。接下来，发射激光。如果激光器工作正常且已校准，将在每个圆形 ROI 内产生四个微小的蚀刻点。然后从显微镜载物台上取下玻片，并清洁物镜。

将空白分束器替换为100%ILL分束器，以通过激光消融切断运动神经。在物镜上滴加少量浸油介质，并使用夹具将固定有幼虫的培养皿置于合适的载物台上，通过目镜和宽场照明进行固定。聚焦于幼虫样本，并定位运动神经元。

扫描第10至20半节段的神经，并选择一条运动神经进行横断。接着，在计算机屏幕上调出该神经的实时图像。选择Z平面，并获取未损伤神经的轴突和胶质细胞的图像。

然后设置延时成像参数，以每5至30分钟一次的间隔采集所有细胞类型的Z轴投影图像。根据实验需要，取下100% ILL分光镜并更换为遮光板。返回神经的实时成像画面，使用适当的荧光通道观察将要进行切断的轴突。

使用椭圆工具，在待消融区域创建一个细长的椭圆形 ROI。然后在控制激光设置的窗口中，在选定区域内创建更小的 ROI。将脉冲次数设置为两次，衰减板设置为 18% 透射率。

然后在选定的 ROI 内发射激光。等待 10 秒或更长时间，再次检查消融区域的荧光情况。注意，某些 ROI 可能最初看似已被消融，但实际上仅为光漂白所致，因此在消融过程中可能需要对 ROI 略作调整，以实现完全的切断。

如果荧光恢复，增加激光功率并发射激光。重复此步骤，直至 ROI 内的荧光消失且在 10 秒内不恢复。完成消融后，在时间序列成像结束后开始采集图像。

使用成像软件整合数据，并为每个时间点生成彩色复合Z投影图像。制作快速时间序列视频，以同时分析轴突和胶质细胞的行为。本文所述的实验方法可用于评估胶质细胞及其他与神经相关的细胞群体在活体中对轴突损伤的反应。

此处展示的是使用该方法制造的神经损伤示例以及周围胶质细胞的反应。实验在六条转基因斑马鱼中进行，这些斑马鱼在被膜靶向的EGFP标记的周围神经胶质细胞（perineural ggl）中表达EGFP，同时在运动神经元中表达胞质DS red。损伤位于躯干运动神经的头侧投射区域，随后对EGFP和DS red两个通道进行延时成像。

这使得在损伤后立即同时观察轴突和胶质细胞的行为成为可能。这些图像是从延时电影中截取的静态时间点。虚线椭圆显示了在第1分钟时使用激光消融的感兴趣区域（ROI）。

在横断或显微手术后（MPT），被消融区域无荧光信号，损伤区域从近端到远端断端的长度约为 3.5 微米。可通过成像观察远端神经断端并检查沃勒变性（wallerian degeneration）的迹象（包括远端轴突断裂和快速清除）来确认横断是否成功。在 MPT 120 分钟时，远端断端未见轴突荧光，表明这些轴突确实已发生沃勒变性，说明横断操作成功。

在进行激光消融实验时，将激光功率调整至理想设置至关重要。理想的激光功率设置应仅在选定的 ROI 范围内精确地消融神经，而过低或过高的激光功率设置均会导致次优结果。此处显示的是使用过低激光功率进行损伤的示例：激光激发后，荧光信号仍保留在 ROI 内，导致截断不完全。

另一方面，如本图所示，过高的激光功率会产生极大的消融区域。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何对斑马鱼进行固定以开展激光切断实验，学会使用氮泵染料激光器创建切断，并通过延时共聚焦成像评估周围细胞的反应。