电机神经切断和时间推移成像胶质细胞行为在现场斑马鱼

该程序的总体目标是对活斑马鱼幼虫周围神经损伤后的神经胶质细胞行为进行延时成像。这是通过首先将麻醉斑马鱼幼虫安装在玻璃底培养皿上的低熔点 aro 中并用解剖针定位它们来实现的。接下来，将安装的幼虫放在共聚焦显微镜上。

选择神经进行消融，并获取未受伤神经的轴突和神经胶质细胞的图像。然后沿神经选择 ROI 并发射激光以消融选定的区域，从而形成神经横断面。最后，在神经横断后对轴突和神经胶质细胞进行延时成像。

最终，可以通过延时共聚焦显微镜获得显示神经退化和再生过程中动态神经胶质细胞行为的结果。这种方法可以帮助回答再生和神经胶质细胞生物学领域的关键问题，例如神经胶质细胞如何对神经损伤做出反应？不同的神经胶质细胞亚型在退化和再生过程中如何协调它们的行为？

杂交含有荧光标记运动神经元和感兴趣的神经胶质细胞类型的转基因的成年斑马鱼并将胚胎孵育至受精或 HPF 后 24 小时后，去除蛋水并用蛋水中的一个 pH 齿阈值或 PTU 代替，然后再将胚胎送回培养箱。从这个时间点到大约 96 HPF，使用荧光解剖镜筛选胚胎是否存在所需的荧光基因。将阳性胚胎转移到新鲜的 PTU 鸡蛋水中，然后将它们放回培养箱中。

当幼虫在受精或 DPF 后达到 6 天时，选择一些胚胎进行安装并将它们转移到较小的培养皿中。从培养皿中取出水，并立即用 0.02%trica 代替 在 PTU 蛋水中，将幼虫在麻醉剂中孵育约 5 分钟。将先前根据文本协议制备的 0.8% 低熔点 agros 的 Eloqua 放入装有自来水和微波炉的烧杯中。

让烧杯冷却 30 秒或直到 agros 融化，直到 agros 管摸起来不冷不热。接下来，将麻醉的幼虫转移到 35 毫米的玻璃底培养皿中。去除培养皿中的水。

然后立即用足够温暖的 aros 覆盖幼虫，以填满培养皿的玻璃底部分。随着 agros 变硬，使用解剖针将幼虫侧放。然后将其稍微向后倾斜，确保安装的幼虫接触培养皿底部的玻璃，这对于受伤和成像是必要的。

使用针头将幼虫保持在原位，直到 agro 凝固并且幼虫被固定。然后慢慢地将足够的 trica 水移入培养皿中，以完全覆盖 agros 和幼虫。打开所有共聚焦显微镜仪器、用于激发斑马鱼转基因的适当二极管激光器以及氮泵染料激光器。

确保空白分束器就位，并且 435 纳米焦晶和染料池就位。完全打开激光衰减器，然后打开带有 63 x 1.2 na 水浸透镜和带有一个镜面的载玻片的成像软件。使用明场照明查找并聚焦镜子中的划痕或蚀刻。

使用成像软件，从控制激光校准和功率设置的窗口查看并聚焦在计算机屏幕上的蚀刻。从主工具栏将脉冲数设置为 1，将衰减设置为 3%透射。选择椭圆工具，然后单击计算机屏幕上的图像。

要创建单个循环 ROI，请再重复该过程 3 次，直到图像上随机分布有四个圆形 RI。接下来，发射激光。如果激光器正常工作并正确校准，这将产生四个小点蚀刻，每个圆形 ROI 内一个然后从显微镜载物台上取下载玻片并清洁物镜。

用 100%ILL 分束器替换空白分束器，以使用激光消融术横切运动神经。在物镜上滴一小滴水浸介质，并使用夹子将装有幼虫的培养皿放在适当的载物台上，以使用目镜和宽场照明将其稳定下来。专注于幼虫并定位运动神经元。

扫描半节段 10 至 20 中的神经，并选择一条运动神经进行横断。接下来，在计算机屏幕上显示神经的实时视图。选择 Z 平面并获取未受伤神经的轴突和神经胶质细胞的图像。

然后准备延时成像设置，以 5 到 30 分钟的间隔捕获所有细胞类型的 Z 投影。根据实验，移除 100%ILL 分束器并替换为空白。返回神经的实时视图，并使用适当的荧光通道查看将要横切的轴突。

使用椭圆工具，在要烧蚀的区域创建一个薄的椭圆 ROI。然后在控制激光设置的窗口中的选定区域内创建较小的 ROI。将脉冲数设置为 2，将衰减板设置为 18% 透射。

然后在选定的 ROI 内触发激光。等待 10 秒或更长时间，然后再次检查烧蚀区域的荧光。请注意，当 ROI 实际上是光漂白时，它最初可能看起来被烧蚀，并且在烧蚀过程中可能需要稍微修改 ROI 以实现完全横断面。

如果荧光恢复，请增加激光功率并发射激光。同样，重复此作，直到荧光在 R OIS 中消失并且在 10 秒内不返回。消融完成后，延时拍摄完成后开始延时成像。

使用成像软件编译数据并为每个时间点创建彩色复合 Z 投影。制作一个快速时间影片，同时分析轴突神经胶质细胞的行为。此处描述的测定可用于评估神经胶质细胞和其他神经相关细胞群对体内轴突损伤的反应。

这里显示的是使用这种方法造成的神经损伤和周围神经胶质细胞反应的示例。该实验在 6 条 DPF 转基因斑马鱼中进行，这些鱼在神经周围 ggl 中表达靶向 EGFP 的膜，在运动神经元中表达胞质 DS red。损伤是沿着躯干运动神经的喙部投影造成的，然后在 EGFP 和 DS 红色通道中进行延时成像。

这允许在受伤后立即同时可视化轴突和神经胶质细胞的行为。这些图像是从延时影片中获取的静态时间点。虚线椭圆显示在一分钟内使用激光烧蚀的 ROI。

横断或 MPT 后，消融区域缺乏荧光，损伤区从近端到远端残端测量约为 3.5 微米。可以通过对远端神经残端进行成像并寻找壁状变性的迹象来确认横断的成功，包括远端轴突断裂和快速清除。在 120 MPT 时沿远端残端没有轴突荧光，表明这些轴突确实发生了沃勒变性，并且交易成功。

在进行激光烧蚀实验时，将激光功率调整到理想设置至关重要。理想的激光功率设置只会在选定的 ROI 内干净地消融神经，而激光功率设置太低或太高将产生次优结果，这里看到的是在激光功率过低的情况下造成的损伤。发射激光后，荧光保持在 ROI 内，导致横切不完全。

另一方面，如图所示，过高的激光功率会产生非常大的消融。看完这个视频，你应该对如何安装斑马鱼进行激光横断面实验有了很好的了解。使用氮泵染料激光器创建横断面，并使用延时共聚焦成像评估周围细胞的反应。