斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

本实验的总体目标是鉴定斑马鱼幼鱼在接触毒物或药物后出现的行为缺陷。首先，在发育的前七天内收集胚胎或幼鱼并用化学物质进行处理。第二步是使用专门设计的模具制作琼脂糖泳道。

接下来，将处理后的幼虫放入农杆菌泳道中，利用延时摄影进行行为学分析。最后一步是将图像导入ImageJ，并使用实验室自行编写的特定宏程序，以获取幼虫在泳道中的XY坐标数据。最终，通过该高通量行为分析实验，比较不同处理组在回避行为和趋光性行为，以及游泳速度和静止状态方面的差异。

与现有商业化方法相比，该技术的主要优势在于能够利用该方法观察更复杂的行为。此外，该装置构建成本低廉且易于搭建。该方法有助于回答行为神经科学领域的一些关键问题，例如在早期胚胎暴露期间，有毒物质如何影响大脑发育及行为表现。

该方法还可揭示人类大脑中其他现有毒性筛查手段无法发现的细微缺陷。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为捕获幼虫可能具有挑战性。由于该方案涉及自行构建的系统，操作步骤具有一定学习难度，因此对该方法的可视化演示至关重要。

开始此操作时，将装有由绿色纱线制成的假草的玻璃Pyrex培养皿放入水箱中。在黎明时分，将培养皿置于水箱内两小时，以收集斑马鱼胚胎。将含有胚胎的玻璃培养皿倒入手持滤网中，并用去离子水冲洗。

接下来，将胚胎培养在含有60毫克/升Instant Ocean（溶于去离子水中）和0.25毫克/升亚甲蓝的卵水培养基中，其中亚甲蓝用作防霉剂。胚胎可饲养于50毫升水中50至60尾幼体的条件下，或置于更大的繁殖缸中，直至胚胎准备好接受毒性物质处理。根据具体实验的假设，可在胚胎发育的特定阶段立即或选择性地加入毒性物质或药物进行处理，这些化合物通常先溶于DMSO，再直接稀释至卵水培养基中。

在胚胎和幼虫处理过程中，蓝色用于视频演示目的。胚胎和幼虫可饲养于深型培养皿中，密度约为每50毫升50至60条幼虫，直至受精后第七天进行行为学分析。为避免死亡胚胎滋生真菌或细菌，应至少每隔一天更换一次卵水溶液。使用塑料模具制备通道，将aros倒入Thermo Scientific的单孔塑料板中成型。

模具包含五个侧面呈60度角的通道。有关模具和平板的尺寸，请参见本视频附带的文字方案。首先，通过将0.8%琼脂糖溶于含有60毫克/升Instant Ocean的去离子水中来制备琼脂糖凝胶。

接下来，通过将50毫升融化的琼脂倒入单孔板中来制备泳道。然后非常缓慢地将模具放置在液态琼脂上方，以避免产生气泡。待琼脂冷却后，移去模具。

aros 小道可置于培养皿中并盖上盖子，在室温下保存最多 36 小时。对于高通量行为分析，需准备成像柜，在柜子顶部安装一台 1500 万像素的数码相机，镜头朝下对准柜底。将一台 15.6 英寸屏幕的笔记本电脑放置于柜内，屏幕朝上。

为避免幼虫过热，最好使用屏幕温度不超过 28 摄氏度的笔记本电脑。将塑料漫射器放置在笔记本电脑屏幕上方，用于承载琼脂平板。漫射器可防止采集的图像中出现额外的干扰图案。

开始图像采集时，小心地将幼虫从培养皿转移到琼脂通道中，以减少幼虫应激。每个通道最多可放置20条幼虫，但通常每个通道放置5条幼虫，以便更准确地追踪游泳速度，并减少每次实验所需的幼虫数量。用卵水填充通道，根据实验需要可添加药物或有毒物质。在将通道放入成像柜之前，不要完全注满液体，以防止溢出。

在适应期结束后，让幼虫静置10分钟以完成适应。用手将四个培养板直接放置在笔记本电脑屏幕上方。此时，可在泳道中补加卵、水或化学处理液，使其液面与泳道顶部齐平，以消除泳道边缘产生的阴影。

在成像程序中，设置计算机进行延时摄影，每个实验每隔六秒拍摄一张图像，共拍摄300张图像。将相机设置为较低分辨率以实现视频速度成像。较低的分辨率将记录范围限制为单个多功能微孔板。

视频记录适用于快速游泳行为的成像。在本演示中，使用 PowerPoint 演示文稿作为幼虫的厌恶刺激。PowerPoint 演示开始时为纯白色背景，持续 15 分钟，随后在培养板上半部分出现一个移动的红色条形，持续 15 分钟。

为避免微流控通道内液体蒸发，最大成像时间应控制在一小时以内。本演示中使用 ImageJ 打开图像。采用一种内部开发的用于五通道幼虫分析的宏，该宏可根据需要向任何用户提供。

使用宏中的提示设置参数，例如图像数量和需要减去的颜色。该宏会自动拆分颜色通道，从而去除红色。随后减去背景，应用阈值，并通过颗粒分析识别幼虫。

所有图像完成 ImageJ 宏程序处理后，将显示一个结果文件，其中包含每张图像中每条幼虫的 XY 坐标、图像编号以及泳道编号。将结果文件以 Excel 格式保存，并根据空白背景与移动条纹背景、以及孔编号进行分类排序。使用内置公式的 Excel 模板，自动计算幼虫在孔中的位置、幼虫之间的距离、运动速度以及静止时间。

目前由 Cretin 实验室创建的最新 Excel 模板可根据要求提供，该模板可在 Excel 表格中构建显示不同处理组的图表，并包含处理组与对照组之间比较的 T 检验。进一步的统计分析可使用 SPSS 统计软件进行。结果显示了以卵水和 DMSO 作为对照处理的幼虫，以及用非有机食品中常见的一种有机磷农药不同浓度处理的幼虫的实验结果。

此处白色柱状图显示幼虫在空白背景下获得的数据，红色柱状图显示幼虫在红色移动条刺激下获得的数据。对照组：在卵水中培养的幼虫，当给予移动的红色条刺激后，表现出更强的趋向培养皿底部的偏好。当幼虫在含有每毫升一微克DMSO的卵水中培养时，也获得类似结果，DMSO是一种常用于溶解多种药物和有毒物质以配制1000倍储备液的溶剂。

图中显示了行为分析可获得的测量指标，包括幼虫位于泳道下方的百分比、幼虫位于泳道末端的百分比、幼虫位于泳道边缘的百分比、幼鱼游泳速度之间的距离，以及幼虫处于静止状态的时间百分比。所示结果来自一次实验的取样。然而，重复实验的结果表明，低浓度的有机磷类农药会改变游泳速度和幼虫行为，该浓度水平与人类食物中的残留量相当。一旦掌握，成像及成像分析过程若操作得当，可在一个半小时内完成。

该操作步骤中最重要的方面是务必记得通过每天更换新鲜培养基来保持培养基的清洁。