Name: 在斑马鱼幼虫的高通量自动化的行为分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解斑马鱼幼虫高通量自动化行为分析技术，用于检测环境毒物或药物暴露后的行为变化。该方法结合延时摄影与ImageJ图像分析，可识别回避行为、游泳速度及静止状态的差异，为行为神经科学与发育毒理学研究提供高效工具。

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感谢 Sean Pelkowski 在行为检测优化方面提供的帮助。本研究由美国国立儿童健康与人类发育研究所（R01 HD060647）以及美国国立环境卫生科学研究所（F32 ES021342 和 R03 ES017755）资助。

1. 斑马鱼胚胎的收集与幼鱼培养
<ol>
	<li>应在黎明时将带有“假”草（由绿色纱线制成）的玻璃派热克斯培养皿插入水箱中，并保留两小时以收集斑马鱼胚胎。图1。应将含有胚胎的玻璃培养皿倒入手持筛网中，并用去离子水冲洗。随后将胚胎在卵水中培养。卵水由去离子水中含60 mg/L Instant Ocean和0.25 mg/L的亚甲蓝组成，后者用作霉菌抑制剂。</li>
	<li>根据具体实验的假设，胚胎可在特定发育阶段立即处理，或使用毒物或药物进行处理。毒物和药物通常溶解于DMSO中（浓度为1,000倍），并应在卵水培养基中直接进一步稀释。</li>
	<li>在胚胎和幼体阶段使用药物或毒物处理期间，可将幼体和胚胎饲养在深型培养皿中，密度约为每50 ml 50–60尾幼体，直至7 dpf进行行为分析（应至少每隔一天更换一次卵水溶液，以避免死胚胎引起的真菌/细菌生长）。</li>
</ol>
2. 行为学分析用模具的制备
<ol>
	<li>专门设计的塑料模具尺寸为 11.7 cm x 7.6 cm x 5 mm，由本实验室定制。这些模具用于在 Thermo Scientific 的单孔塑料板（尺寸为 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm）中倒入琼脂糖以形成泳道。</li>
	<li>模具内含五个泳道，其侧壁呈 60° 倾斜。泳道高度为 3.5 mm，顶部宽度（最宽处）为 18 mm，底部宽度为 14 mm。模具中相邻泳道之间间距为 4 mm（图 2）。</li>
	<li>制备泳道时，将 50 ml 融化的琼脂糖（含 0.8% 琼脂糖的去离子水，添加 60 mg/L Instant Ocean）倒入单孔板中。随后应缓慢地将模具置于液态琼脂糖表面，以避免产生气泡；待琼脂糖冷却凝固（约需 45 分钟）后，即可取出模具。</li>
	<li>琼脂糖泳道应在行为学实验开始前不超过一天的时间内制备（以防止琼脂糖干燥）。带盖的培养皿可在室温下保存泳道，最长保存时间约为 36 小时。琼脂糖泳道仅可用于一次实验，使用后应丢弃。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>每个孔中最多可放置 20 条幼鱼。通常每个孔使用 5 条幼鱼，以便更准确地追踪游泳速度，并减少每次实验所需的幼鱼数量。根据实验需要，孔中可加入含或不含药物或毒物的养卵水。然而，在将孔板放入成像箱之前，不应将液体加满；这可以防止溢出。为保证一致性，幼鱼在被放入琼脂糖模具并置于笔记本电脑屏幕上方后，应有十分钟的适应期。高效地将幼鱼从培养皿转移到琼脂糖孔道中，有助于减少幼鱼的应激反应。当幼鱼饲养在较浅的培养皿或水箱中时，操作最为方便。</li>
	<li>成像箱包含一台用于延时摄影的佳能数码相机和一台笔记本电脑。相机应放置在成像箱顶部，镜头朝下，对准箱底朝上放置的 15.6 英寸屏幕笔记本电脑（图 3）。四个孔板应手动直接放置在笔记本电脑屏幕上方。此时可将养卵水或化学处理液加至与孔道顶部齐平（以消除图像中孔道边缘的阴影）。</li>
	<li>使用 PowerPoint 演示文稿作为对幼鱼的厌恶刺激。过去曾向斑马鱼幼鱼呈现移动的红色圆球，用于 6 或 12 孔多孔板实验15,17,18。当前的 PowerPoint 演示文稿首先显示 15 分钟的纯白色背景，随后在孔板上半部分显示 15 分钟移动的红色条带（图 4）。为避免幼鱼过热，建议选用屏幕温度不超过 28 °C 的笔记本电脑。为防止琼脂糖孔道内液体蒸发，最大成像时间应控制在 1 小时以内。</li>
	<li>数码相机应设置为延时摄影模式，每 6 秒拍摄一张照片，每次实验共采集 300 张图像。然而，拍摄频率和时长可根据具体实验和行为量化需求进行调整。过去曾采用较长的时间间隔以实现更长的成像时间。相机也可设置为较低分辨率，以视频速度（每秒 30 帧）进行成像。虽然较低分辨率仅能覆盖单个多孔板区域，但视频记录适用于捕捉快速游泳事件15。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>应使用 ImageJ 打开图像，并配合实验室内部专门编写的宏进行操作。该宏可自动分离颜色通道以去除红色，进行背景扣除，应用阈值，并通过颗粒分析识别幼鱼。目前用于五通道幼鱼分析的最新宏为 Zebrafish_macro25k。请根据宏中的提示设置图像数量、需扣除的颜色、图像阈值等参数。</li>
	<li>所有图像完成 ImageJ 宏处理后，将显示一个结果文件，其中包含每幅图像中各个幼鱼的 x、y 坐标，以及对应的图像编号和通道编号。</li>
	<li>结果文件应以 Excel 格式保存，并根据空白背景与移动条纹背景、以及孔位编号进行排序。应使用内置公式的 Excel 模板，该模板可自动计算幼鱼在孔板中的位置、幼鱼间的距离、运动速度及静止时间。目前最新的 Excel 模板为 Creton 实验室开发的 25ib，可应要求提供。应在 Excel 表格中构建显示各处理组的图表，并包含处理组与对照组之间比较的 t 检验结果。进一步的统计分析可使用 SPSS 完成。</li>
</ol>

<ol><li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+zebra+fish+%28Danio+rerio%29+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li>
<li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos%3A+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).</li>
<li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neuroscience. 11, 90(2010).</li>
<li>Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLevin%2C+ED+%22Methods+of+behavioral+analysis+in+neuroscience%22">Methods of behavioral analysis in neuroscience</a>. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).</li>
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<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kokel, D., Bryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavior-based+identification+of+neuroactive+small+molecules+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).</li>
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<li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Neurophenotyping+of+Adult+Zebrafish+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior.</a> PLoS ONE. 6, e17597(2011).</li>
<li>Sledge, D., Yen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+duration+of+exposure+for+developmental+chlorpyrifos-induced+neurobehavioral+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).</li>
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<li>Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure%3A+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li>
<li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. (20), e923(2008).</li>
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<li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+developmental+toxicity+by+automated+analyses+of+behavior+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Unpublished+observations%22%5BJournal%5D)">Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae.</a> Unpublished observations. , (2012).</li>
<li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+edge%3A+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li>
<li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li>
<li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li>
<li>Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColwill%2C+R+%22Zebrafish+protocols+for+neurobehavioral+research%22">Zebrafish protocols for neurobehavioral research</a>. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

尽管我们仍在持续改进这种新型的行为检测方法，但它始终可用于检测斑马鱼幼鱼的回避行为和趋触性行为15。我们已开展多次试验以优化该检测的结果，例如所用刺激的颜色、每条通道中幼鱼的理想数量以及行为检测的持续时间。此前，我们使用多孔板（6孔或12孔）进行实验15,17,18。然而，最近我们设计了一种新型通道模具，为幼鱼提供了更大的游泳空间，从而能够在单次检测中获取更多的行为数据16（图5）。其他改进还包括所用PowerPoint演示内容的变化（如调整运动方式或检测时长）以及通道尺寸的调整（我们也制备了适用于更窄通道的模具）。
目前，该高通量自动化系统在同时测量斑马鱼幼鱼多种行为方面具有独特优势，例如在多通道孔板中测量运动速度、避让行为、与其他幼鱼的接近程度以及趋触性等。系统可在成像的同时快速获得结果，并对大量幼鱼进行分析。该系统的构建成本低廉，安装快速且操作简便。该系统的一个局限性在于无法评估斑马鱼幼鱼的三维运动。能够追踪成年斑马鱼的自动化系统具备三维检测能力，可识别更广泛的行为，例如在水体中上下移动的行为10,19。另一个局限性是，我们的成像系统目前尚未针对视频速度下的高通量分析进行优化。虽然通过将相机设置为较低分辨率可实现视频速度成像15，但这会将分析限制在单个孔板上。
使用新创建的“泳道”方法时，实验的多个步骤必须精确操作。将幼虫放入泳道时，必须确保液体量非常少，直到将培养板放置在笔记本电脑屏幕上方。如果泳道中液体过多，幼虫会逃逸至培养板的边缘区域。此外，将模具插入琼脂糖时，必须缓慢地降低模具。如果插入速度过快，琼脂糖中会产生气泡，并被Image J宏识别为额外的幼虫。建议即使琼脂糖泳道中仅存在少量气泡，也最好重新制备新的泳道。
未来，我们希望优化行为检测方法，以分析斑马鱼幼鱼的其他复杂行为，例如学习能力，并研究早期发育阶段暴露于有毒物质和药物对学习能力的影响。目前，我们正在开发可用于分析学习行为的检测方法，其行为结果可能有助于确定特定有毒物质或药物在发育过程中影响了哪些脑区。已有研究开发出用于测量斑马鱼幼鱼学习行为的自动化检测方法20，这些检测方法可通过多通道培养板中的强效回避反应，进一步改进用于高通量筛选。
我们建议，该行为检测方法可在未来的研究中用于测试大量药物和有毒物质对发育的影响。此类研究将提供有关特定风险因素的大量信息，并有助于为孕妇和儿童制定更完善的健康与安全指南。

斑马鱼正成为遗传学、发育学和行为学研究的流行模式生物1-4。它们在受精后2-3天（dpf）从绒毛膜中孵化，到4-5 dpf时器官已完全发育并具备功能，并在7 dpf时表现出多种行为5,6。由于体型微小，斑马鱼幼体非常适合进行高通量分析7,8。目前已有商业软件可用于斑马鱼幼体及成体行为的自动化分析9-14。然而，这些软件价格昂贵，且在检测多孔板中斑马鱼幼体复杂行为方面功能有限。
我们开发了一种新型的高通量成像系统，该系统构建成本低廉，可对7天龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为进行定量分析15,16。该系统使我们能够快速、高效地检测胚胎期暴露于多种药物和环境毒物后出现的细微行为异常16-18。
该系统采用木制柜体构建，在柜体顶部安装一台数码相机。相机向下拍摄，正对柜体底部放置的笔记本电脑屏幕，屏幕朝上显示内容15。通过延时成像记录幼虫在通道中的位置变化。最多可将四个多孔板或多通道板置于笔记本屏幕上方，用于容纳幼虫。我们使用 PowerPoint 演示文稿作为厌恶刺激，诱导幼虫产生远离刺激区域（回避行为）并游向边缘区域（趋触行为）的反应15,17。所采集的图像导入 ImageJ 软件，利用自动宏程序分离颜色通道、扣除背景，并应用阈值以识别单个幼虫。每幅图像中每个幼虫的坐标被逐一列出，并可导入 Excel 文件，用于量化分析回避行为与趋触行为、个体间距离、游泳速度以及静止时间等指标16。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>That Pet Place</td><td>198262</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>那家宠物店</td><td>214325</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>一块六孔板</td><td>Fisher</td><td>12-565-493</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>佳能</td><td>EOS Rebel T1i</td><td></td></tr><tr><td>成像柜</td><td>木工塔楼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>宏碁 非凡</td><td>只要具有15.6英寸LCD屏幕、1366 x 768像素分辨率和220 cd/m²亮度，任何型号均可&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;.</td><td></td></tr><tr><td>相机镜头</td><td>佳能</td><td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS 变焦镜头</td><td></td></tr><tr><td>塑料扩散器</td><td>Pendaflex</td><td>52345</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PowerPoint 2010</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/&quot; 目标=&quot;_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr><tr><td>统计软件</td><td>SPSS 20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

我们开发了一种新型高通量成像系统，用于分析7日龄斑马鱼幼鱼在多通道板中的行为。该系统可测量幼鱼的自发行为以及对厌恶刺激的反应，厌恶刺激通过PowerPoint演示呈现给幼鱼。via该系统记录的图像使用ImageJ宏进行分析，该宏可自动分离颜色通道、扣除背景，并应用阈值识别幼鱼在通道中的位置。随后，我们可以将坐标导入Excel表格，以量化游泳速度、对通道边缘或侧壁的偏好、静止行为、接触趋向性（thigmotaxis）、幼鱼间的距离以及回避行为。利用本系统可轻松检测行为的细微变化，因此适用于环境毒物或药物暴露后的行为学分析。

在我们早期的实验中，使用弹跳球作为厌恶刺激，未经处理的野生型幼鱼在受到移动小球刺激时会向孔板底部游动（回避行为）并向孔板边缘移动（接触趋向行为）15。我们随后证实，在该实验中，接触趋向行为可作为斑马鱼幼鱼焦虑相关行为的指标17。与空白白色背景相比，幼鱼在远离小球和偏好边缘区域方面的行为存在显著差异。这些行为在我们新建立的移动红条实验中也得到了验证，且表现更为显著16。此外，我们现在可在单次实验中检测更多种类的行为，包括游泳速度、静止时间、对孔板末端或侧边的偏好，以及个体鱼之间的距离（图5）。在卵水中培养的对照组幼鱼在受到厌恶刺激（移动红条）后，表现出更强的向孔板底部和通道边缘聚集的偏好。当幼鱼在含有1 μg/ml DMSO的卵水中培养时，也获得类似结果；DMSO是一种常用于溶解多种药物和毒物以配制1,000倍浓缩储备液的溶剂。
代表性结果如图5所示，为使用卵水和DMSO（作为对照）以及不同浓度有机磷农药处理的幼虫实验结果。所示数据来自一次实验的取样。然而，重复实验结果表明，低浓度有机磷农药可改变幼虫的游动速度和趋触行为，该浓度范围模拟了人类食品摄入中的实际暴露水平18。
<img alt="鱼缸中的斑马鱼繁殖装置；水产养殖实验，生殖行为研究。" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 收集托盘。 使用玻璃Pyrex培养皿从成年斑马鱼鱼缸中收集胚胎。将Pyrex培养皿的盖子裁剪后嵌入塑料网格，并在塑料网格上缝上绿色纱线。通过模拟自然环境，为成年斑马鱼营造繁殖氛围。
<img alt="凝胶电泳板比较，蛋白质分离方法，实验室实验。" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 塑料模具与琼脂糖加样孔。A) 左侧显示模具。将 0.8% 琼脂糖倒入单孔板中；缓慢插入模具，待琼脂糖冷却后将其取出。B) 右侧平板显示由塑料模具在琼脂糖中形成的加样孔。
<img alt="垂直光路光谱装置；用于发射分析的相机；封闭系统。" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 成像柜。 成像柜由本实验室专门设计，用于高通量行为学分析。一台1500万像素的数码相机安装在柜体顶部，镜头朝下，用于采集放置在笔记本电脑屏幕上的多通道培养板中幼虫的时间序列图像。在培养板与屏幕之间放置有一层塑料漫射片，以防止采集的图像中出现莫尔条纹。
<img alt="比较光照环境与无光照环境的幼鱼趋光性实验。" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 空白背景与 PowerPoint 厌恶刺激。 该 PowerPoint 当前用于诱导斑马鱼幼鱼的行为变化。它在 A) 空白背景与 B) 移动的红色条形刺激之间产生显著的行为差异。
<img alt="行为分析柱状图；向下百分比、潜水末端、区域边缘、鱼距离、游泳速度、静止状态。" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 高通量检测中量化的行为指标。 本图展示了从幼鱼行为检测中通过记录其x,y坐标所量化的各项行为指标示例。白色柱状图表示在空白背景刺激下幼鱼的数据，红色柱状图表示在PowerPoint中移动的红色条形刺激下幼鱼的数据。图中显示了行为分析可获得的测量结果：A) 位于通道底部的幼鱼百分比，B) 位于通道末端的幼鱼百分比，C) 位于通道边缘的幼鱼百分比，D) 鱼体间距离（mm），E) 幼鱼游泳速度（mm/min），F) 幼鱼静止时间百分比。本图所示数据来自以DMSO作为对照处理，并用浓度范围为0.001至0.1 μM（相当于人类饮食中常见水平）的农药处理幼鱼的实验结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

本实验室开发了一种新型高通量自动成像系统，可用于检测7日龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为。该系统适用于在幼鱼暴露于环境毒物或药物后，检测其行为发生的细微变化。

我们开发了一种新型高通量成像系统，用于在多通道板中对7日龄斑马鱼幼虫的行为进行分析。该系统……

本实验的总体目标是鉴定斑马鱼幼鱼在接触毒物或药物后出现的行为缺陷。首先，在发育的前七天内收集胚胎或幼鱼并用化学物质进行处理。第二步是使用专门设计的模具制作琼脂糖泳道。接下来，将处理后的幼虫放入农杆菌泳道中，通过延时摄影进行行为学分析。最后一步是将图像导入ImageJ软件，并使用实验室自行编写的特定宏程序，以获取幼虫在泳道中的XY坐标数据。最终，通过该高通量行为分析实验，可检测不同处理组之间在避害行为、趋触性行为、游泳速度以及静止状态等方面的差异。与现有商业化方法相比，该技术的主要优势在于能够利用我们的方法观察更复杂的行为。此外，该装置构建成本低廉且易于搭建。该方法有助于回答行为神经科学领域的一些关键问题，例如在早期胚胎暴露期间，有毒物质如何影响大脑发育及行为。该方法还可揭示人类大脑中一些细微的缺陷，而这些缺陷是目前其他毒性筛查手段无法发现的。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为捕获幼虫可能具有挑战性。由于实验步骤涉及自行搭建的系统，学习过程存在一定的难度，因此对该方法进行可视化演示至关重要。开始此操作时，将装有绿色纱线制成的假草的玻璃派热克斯培养皿放入水箱中。在黎明时分，让培养皿在水箱中停留两小时，以收集斑马鱼胚胎。将含有胚胎的玻璃培养皿倒入手持滤网中，并用去离子水冲洗。接下来，将胚胎培养在含有60毫克/升Instant Ocean（溶于去离子水）和0.25毫克/升亚甲蓝的卵水（egg water）中，其中亚甲蓝用作防霉剂。胚胎可饲养于50毫升水中含50至60尾幼体的容器中，或置于更大的繁殖缸中，直至胚胎准备好接受毒性物质处理。根据具体实验的假设，可在胚胎发育的特定阶段或立即使用毒性物质或药物进行处理，这些化合物通常先溶于DMSO，再直接稀释至卵水培养基中。在胚胎和幼虫处理过程中，蓝色用于视频演示目的。胚胎和幼虫可饲养于深型培养皿中，密度约为每50毫升50至60条幼虫，直至受精后第七天进行行为学分析。为避免死亡胚胎滋生真菌或细菌，应至少每隔一天更换一次卵水溶液。使用塑料模具制备通道，将 aros 倒入赛默飞世卡公司（Thermo Scientific）的单孔塑料板中形成。模具包含五个侧面呈60度角的通道。有关模具和平板的尺寸，请参见本视频附带的文字方案。首先，通过将0.8%琼脂糖溶于含有每升60毫克Instant Ocean的去离子水中来制备琼脂糖。接下来，通过将50毫升融化的琼脂倒入单孔板中来制备泳道。然后非常缓慢地将模具放置在液态琼脂上方，以避免产生气泡。待琼脂冷却后，移去模具。琼脂泳道可盖上培养皿盖，在室温下保存长达36小时。对于高通量行为分析，需准备成像柜，在柜子顶部安装一台1500万像素的数码相机，镜头朝下对准柜底。将一台15.6英寸屏幕的笔记本电脑放置在柜内，屏幕朝上。为避免幼虫过热，最好使用屏幕温度不超过 28 摄氏度的笔记本电脑。在放置培养板的笔记本电脑屏幕上方放置一个塑料漫射器。该漫射器可防止所采集图像中出现额外的图案。开始图像采集时，小心地将幼虫从培养皿转移到琼脂通道中，以尽量减少幼虫的应激反应。每个通道最多可放置20条幼虫，但通常每个通道放置5条幼虫，以便更准确地追踪游泳速度，并减少每次实验所需的幼虫数量。根据实验需要，用含或不含药物或有毒物质的卵水填充通道。在将通道放入成像柜之前，不要完全注满液体，以免发生溢出。在适应期结束后，让幼虫再适应10分钟。手动将四个培养板直接放置在笔记本电脑屏幕上。此时，可用卵、水或化学处理液将泳道加满至与泳道顶部齐平，以消除泳道边缘的阴影。在图像程序中设置计算机进行延时摄影，每个实验每隔六秒拍摄一张照片，共拍摄300张图像。将相机设置为较低分辨率以实现视频速度成像。较低的分辨率将记录限制为仅一个多功能微孔板。视频记录适用于成像快速游泳事件。在本演示中，使用 PowerPoint 演示文稿作为幼虫的厌恶刺激。PowerPoint 首先以空白白色背景持续 15 分钟，随后在培养板上半部分显示一个移动的红色条形，持续 15 分钟。为避免微流控通道内液体蒸发，最大成像时间应控制在一小时以内。本演示中使用 ImageJ 打开图像。采用一种内部开发的用于五通道幼虫分析的宏，该宏可根据要求向任何用户提供。使用宏中的提示设置参数，例如图像数量和需要减去的颜色。该宏随后会自动拆分颜色通道，以去除红色。通过减去背景、应用阈值，并利用颗粒分析识别幼虫。所有图像完成 ImageJ 宏程序处理后，将显示一个结果文件，其中包含每幅图像中每条幼虫的 XY 坐标、图像编号以及泳道编号。将结果文件保存为 Excel 格式，并根据空白背景与移动条纹背景、以及孔编号进行分类排序。使用内置公式的 Excel 模板，自动计算幼虫在孔中的位置、幼虫之间的距离、运动速度以及静止时间。可在提出请求后获取Cretin实验室最新创建的Excel模板，该模板可用于在Excel工作表中构建包含不同处理组的图表，并进行处理组与对照组之间的T检验比较。可使用SPSS统计软件进行进一步的统计分析。结果显示了以卵水和DMSO作为对照组、以及用常见于非有机食品中的有机磷农药不同浓度处理的幼虫实验结果。此处白色柱状图显示幼虫在空白背景下获得的数据，红色柱状图显示幼虫在红色移动条刺激下获得的数据。对照组：在卵水中培养的幼虫，当给予移动的红色条刺激后，表现出更强的趋向培养皿底部的偏好。当幼虫在含有每毫升一微克二甲基亚砜（DMSO）的卵水中培养时，也获得类似结果，DMSO 是一种常用于溶解多种药物和有毒物质以配制1000倍储备液的溶剂。图中显示了行为分析可获得的测量指标，包括幼虫位于泳道下方的百分比、幼虫位于泳道末端的百分比、幼虫位于泳道边缘的百分比、幼鱼游泳速度之间的距离，以及幼虫处于静止状态的时间百分比。所示结果来自一次实验的取样。然而，重复实验的结果表明，低浓度的有机磷类农药会改变游泳速度和运动行为，该浓度水平与人类食物中的残留量相当。一旦掌握，成像及成像分析过程若操作得当，可在一个半小时内完成。该操作步骤中最重要的方面是务必记得通过每天更换新鲜培养基来保持培养基的清洁。

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