Name: 隔离和脂质A的化学表征革兰氏阴性菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学习从革兰氏阴性菌中分离脂多糖并进行脂质A的化学表征，采用串联质谱技术解析其结构特征。该方法有助于深入理解细菌抗生素耐药机制及宿主免疫反应。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI064184 和 AI76322 以及美国陆军研究办公室资助项目 61789-MA-MUR（授予 M.S.T.）的支持。研究还获得了Welch基金会资助项目 F1155 和 NIH 资助项目 R01GM103655（授予 J.S. B.）的支持。

所有溶液均应使用超纯水以及HPLC级甲醇和氯仿配制。含有甲醇、氯仿或吡啶等有机溶剂或浓酸、浓碱的溶液，必须在化学通风橱内配制和使用。所有溶液均可在室温下保存。溶剂应使用带刻度的玻璃量筒量取，并储存于带聚四氟乙烯（PTFE）衬里瓶盖的玻璃溶剂瓶中。含氯仿的溶剂若需长期保存，应置于棕色遮光玻璃瓶中，以避免生成高反应性的酸氯化物光气。聚四氟乙烯（PTFE）离心管和旋转蒸发仪烧瓶在使用前应先用甲醇和氯仿冲洗。处理溶剂和/或放射性废物时，应遵守必要的联邦、州和/或机构废物处置法规。
1. 大规模脂质A提取（50 ml至1.5 L）
<ol>
	<li>制备单相 Bligh-Dyer 混合液：氯仿-甲醇-1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4；体积比为 1:2:0.8（v/v）。在 1 L 溶剂瓶中加入 200 ml 氯仿、400 ml 甲醇和 160 ml PBS。盖紧瓶盖，通过倒置混匀。&gt;30倍体积）。混匀过程中需定期松开瓶盖以排气，并密封保存。</li>
	<li>制备预平衡的Bligh-Dyer两相混合液——氯仿:甲醇:水（2:2:1.8 v/v）。将400 ml氯仿、400 ml甲醇和180 ml水加入1 L溶剂瓶中。盖紧瓶盖，通过倒置混匀，混匀过程中需定期松开瓶盖排气。室温过夜平衡后密封保存。</li>
	<li>配制弱酸水解缓冲液（50 mM 醋酸钠，pH 4.5；1% 十二烷基硫酸钠（SDS））。配制 500 ml 缓冲液时，称取 2.05 g 醋酸钠，转移至 500 ml 烧杯中，加入约 350 ml 水并搅拌溶解，然后加入 50 ml 10% SDS 溶液。混匀后调节 pH 至 4.5，转移至量筒中，加水定容至 500 ml。</li>
	<li>配制氯仿:甲醇（4:1，v/v）：量取100 ml氯仿，转移至溶剂瓶中；量取25 ml甲醇，与氯仿混合。储存于棕色玻璃瓶中。</li>
	<li>从单个细菌菌落接种5 ml培养基（LB培养基或其他培养基），37℃过夜培养。 &deg;C，或按需 &deg;用于生长的 C。提取步骤的示意图如图所示 图2.</li>
	<li>第二天，测定OD值600 并用5 ml过夜培养物接种200 ml培养液，起始OD600 0.05。培养细胞至OD600 达到 0.8-1.0 时。</li>
	<li>通过离心收集细胞，10,000 × g 离心 10 分钟。对于沉淀效果较差的菌株，可能需要更长的离心时间。倒去上清液。</li>
	<li>用50 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀。再次离心以收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀于-20℃保存。 &deg;C，或继续进行步骤 1.9。</li>
	<li>将细胞重悬于 40 ml 1× PBS 中，并分装至两个 250 ml 聚四氟乙烯（PTFE）离心管中（每管 20 ml 细胞悬液）。向每管中加入 25 ml 氯仿和 50 ml 甲醇，形成单相 Bligh-Dyer 溶剂体系（氯仿:甲醇:水；1:2:0.8 v/v）图2）。倒置混匀，室温孵育 &gt;20 分钟，以确保细胞完全裂解。</li>
	<li>在 2,000 × g 条件下离心混合物 20 分钟。LPS 将与蛋白质和核酸一同形成沉淀。图2）；然而，磷脂、异戊二烯脂质和小的疏水性肽将保留在上清液中。弃去上清液。</li>
	<li>用约100 ml单相Bligh-Dyer混合液洗涤LPS沉淀。在2,000 × g下离心20分钟。弃去上清液。当从脂多糖中分离脂质A时 E. coli 或 沙门氏菌仅需一次洗涤；然而，在从某些生物体中分离脂质A时，可能需要增加洗涤步骤以减少磷脂污染。</li>
	<li>向LPS沉淀中加入27 ml温和酸水解缓冲液（50 mM醋酸钠，pH 4.5；1% SDS；见步骤1.3），用移液器反复吹打混匀，直至仅剩微小颗粒。使用探头超声仪在恒定占空比下，以50%输出功率超声处理20秒，使LPS沉淀均匀重悬于溶液中。重复超声处理样品2次（每次20秒脉冲，脉冲间间隔约5秒）。</li>
	<li>在水浴中煮沸样品 30 分钟。注意：确保管盖拧紧，但不要完全密封。某些生物体，如 霍乱弧菌（V. cholerae） 需要更长的孵育时间（1小时）以提高脂质A的总产量。将瓶子从水浴中取出，在继续下一步操作前让样品冷却至室温。</li>
	<li>水解后为提取脂质，将SDS溶液转化为两相Bligh-Dyer体系（图2通过加入30 ml氯仿和30 ml甲醇，形成氯仿:甲醇:水（2:2:1.8，v/v）混合液。颠倒混匀后，在2,000 × g条件下离心10分钟。使用玻璃移液管将下层相转移至洁净的PTFE离心管中。</li>
	<li>向步骤1.14获得的上相中加入30 ml预平衡的Bligh-Dyer双相混合液的下相（步骤1.2），进行第二次提取。混匀后，以2,000 × g离心10分钟。收集下相，并与步骤1.14中提取的下相合并。</li>
	<li>将合并的下相（总体积60 ml）用114 ml预平衡的双相Bligh-Dyer上相（步骤1.2）洗涤，形成双相Bligh-Dyer混合液（氯仿:甲醇:水；2:2:1.8，v/v）。混匀后，于2,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>将下层相转移至洁净的玻璃旋转蒸发瓶中，并使用旋转蒸发仪干燥样品（图2).</li>
	<li>加入5 ml 氯仿:甲醇（4:1，v/v）至旋转烧瓶中，进行水浴超声处理（&gt;30 秒），以帮助将瓶壁上的脂质悬浮。使用玻璃移液管将脂质转移至洁净的玻璃管（13 × 100 mm 或更大）中，管口用聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的酚醛树脂螺旋盖密封。使用氮气干燥器，在氮气气流下将样品干燥。</li>
	<li>将干燥的脂质在1 ml氯仿:甲醇（4:1，v/v）中重悬。转移至底部锥形的小型玻璃样品瓶（12 x 32 mm），以便使用小体积溶剂进行更定量的重悬（参见设备/试剂表）。使用氮气干燥仪干燥。</li>
	<li>干燥样品可在 -20 保存 &deg;C，以备后续薄层色谱分析（方案2）或质谱分析（方案3、4或5）。（注意：后续方案中建议分离和使用的材料用量是基于对大多数生物体而言足够的量而提出的。同一样品脂质可用于方案2至5，需注意每次取样所占的百分比。详见讨论部分。）</li>
</ol>
2. 通过薄层色谱法可视化脂质A物种
<ol>
	<li>配制薄层色谱（TLC）流动相溶剂体系（氯仿:吡啶:88%甲酸:水；50:50:16:5 v/v）。在1 L溶剂瓶中加入200 ml氯仿、200 ml吡啶、64 ml 88%甲酸和20 ml水。盖紧瓶盖，多次倒置混匀，并适时排气。</li>
	<li>使用可容纳20 × 20 cm薄层板的TLC展开槽。在TLC槽内壁贴上约40 cm的层析滤纸。</li>
	<li>向TLC槽中加入200 ml氯仿:吡啶:88%甲酸:水（50:50:16:5, v/v）混合溶剂。让展开槽预平衡&gt;3小时，通常过夜（O/N）更为理想且方便。</li>
	<li>从冰箱中取出步骤1.20中干燥的脂质样品，使其升至室温。</li>
	<li>用剃刀刮去硅胶60薄层板顶部边缘的硅胶。使用钝头铅笔在距板底2 cm处画一条与底边平行的线，作为点样原点。沿此参考线标记间隔1 cm的点样位置。</li>
	<li>将步骤2.4中获得的干燥脂质溶解于200 μl氯仿:甲醇（4:1, v/v）中，涡旋混匀并超声处理（3次，每次约15秒）。若脂质A来源于E. coli，则所得浓度约为100–500 ng/μl。</li>
	<li>使用微量玻璃毛细管移液器，取上述溶液的十分之一体积（20 μl），点样至步骤2.5中标记的位置。让样品在薄层板上自然风干约15分钟。（注意：小玻璃小瓶中的样品可用氮气吹干，并于-20 °C保存，供后续第3–5步方案使用。需记录所取样品的比例。）</li>
	<li>将点好样品的薄层板放入已预平衡的展开槽中。待溶剂前沿迁移至薄层板顶端（约2.5–3小时）后，取出薄层板并风干（&gt;60分钟）。可使用冷风枪确保完全干燥。</li>
	<li>在薄层板干燥过程中，将加热板预热至250 °C，用于炭化显色。</li>
	<li>在通风良好的化学通风橱中，配制10%硫酸-乙醇混合液，用于对硅胶薄层板上分离的脂质进行炭化显色（浓硫酸:100%乙醇；1:9 v/v）。量取10 ml浓硫酸，缓慢加入90 ml 100%乙醇中。小心混匀后转移至玻璃层析试剂喷雾器中。</li>
	<li>在通风橱中，使用玻璃层析试剂喷雾器将10%硫酸-乙醇混合液均匀喷洒在已干燥的薄层板表面。</li>
	<li>将薄层板置于250 °C加热板上，直至脂质样品呈现黑色或棕色斑点（&lt;1分钟）。避免过度加热，否则整块板会变棕，导致脂质A组分难以观察。</li>
</ol>
3. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对脂质A进行结构表征
<ol>
	<li>从步骤 1.20（或步骤 2.7）中取出脂质 A 样品，从冰箱中取出并使其升至室温。若样品来源于 E. coli，则将干燥的脂质 A 样品重悬于约 20 μl 氯仿:甲醇（4:1, v/v）中，并涡旋以获得浓度约为 1–5 μg/μl 的脂质 A 溶液。（注意：若使用步骤 2.7 所得材料，则浓度应降低 10%）。</li>
	<li>准备 ATT 基质组分。饱和 6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶的 50% 乙腈溶液：向 1.5 ml 微量离心管中加入 500 μl 水和 500 μl 乙腈，然后加入 &gt;10 mg 的 6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶，使 50% 乙腈溶液达到过饱和状态。饱和的三碱基柠檬酸铵溶液：向 500 μl 水中加入 &gt;1 mg 三碱基柠檬酸铵，应明显出现沉淀。使用前涡旋并离心各溶液；仅使用饱和上清液。</li>
	<li>配制 ATT 基质混合液：将饱和的 6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶 50% 乙腈溶液与饱和的三碱基柠檬酸铵溶液按 20:1（v/v）比例混合。在 500 μl 微量离心管中，加入 20 μl ATT 溶液至 1 μl 饱和三碱基柠檬酸铵溶液中，涡旋混匀，并在点样至 MALDI 板前进行离心。</li>
	<li>在 MALDI 板上靠近样品点样位置处，加入 0.5 μl 校准混合物，以校准 MALDI 板，从而获得最准确的质荷比测定结果。</li>
	<li>在 MALDI 板上每个将要点样脂质 A 样品的位置，分别点加 0.5 μl ATT 基质。</li>
	<li>将 0.5 μl 样品（占总样品的 2.5%）点加至 ATT 基质所在位置，使其在板上混合，并通过扫描样品获取最佳离子信号的质谱图（图 3）。注意：获得最佳质谱信号所需的样品量可能因生物体而异，需通过实验经验确定。如需增加样品量，可多次点加 0.5 μl 样品，每次点加后待混合物干燥后再进行下一次点样。样品也可根据需要进行浓缩（干燥后重悬于较小体积）或稀释。也可使用更多的起始材料（起始培养细胞体积）（见讨论部分）。</li>
</ol>
4. 脂质A的电喷雾电离质谱及碰撞诱导解离
<ol>
	<li>通过混合200 mL氯仿和甲醇，制备氯仿:甲醇溶剂混合液（1:1，v/v） &mu;将 HPLC 级甲醇储备液与 200 ml HPLC 级氯仿在玻璃溶剂瓶中混合。</li>
	<li>转移 200 &mu;将氯仿:甲醇溶剂混合物加入含有脂质A的小瓶中例如 从步骤1.20、2.7或经过方案3干燥后的样品中，超声处理脂质A溶液5分钟，或直至所有物质完全溶解。</li>
	<li>设置质谱仪以进行负模式电喷雾电离。</li>
	<li>使用250 &mu;使用注射器和注射泵，以2.0–3.5的流速直接注入稀释后的脂质A样品 &mu;升/分钟</li>
	<li>通过调节离子光学参数来优化并增强脂质A的离子信号。现在可以采集脂质A组分的完整质谱图。图 4).</li>
	<li>通过选择CID作为二级质谱方法，分离并激活目标脂质A。</li>
	<li>逐步提高碰撞诱导解离电压（或归一化碰撞能量，NCE），直至前体脂质A离子的相对丰度约为最高丰度产物离子的10%。</li>
	<li>获取并累加谱图，直至产物离子的信噪比达到理想水平。所需扫描次数取决于原始前体离子的信号强度，通常为3至300次扫描。图 5A).</li>
</ol>
5. 通过紫外光解离进行脂质A的串联质谱分析
<ol>
	<li>按照步骤 4.1–4.5 准备样品和质谱仪。</li>
	<li>启动与质谱仪连接的激光器。质谱仪配备了一个 193 nm 的准分子激光器，并经过改装以允许在仪器的 HCD 池中进行紫外活化。光解离的实施方式与先前报道的方法类似35。我们使用改装的真空歧管，其中包含 CaF2 光学窗口，将光子导入高能 C 捕集池（HCD 池）。激光通过质谱仪发出的晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号触发，该信号传至脉冲/延迟发生器，从而控制激光脉冲。</li>
	<li>设置仪器软件，使激光在离子进入 HCD 池时触发准分子激光器。这需要对软件进行适度修改。</li>
	<li>开启脉冲发生器，使激光每 2 毫秒发射一次（500 Hz）。</li>
	<li>通过选择 HCD 作为 MS/MS 方法来隔离脂质 A 前体离子，并将碰撞能量调整为 1% NCE。这可在 HCD 池内实现前体离子的隔离，以便进行紫外解离。尽管使用了 HCD 池，但软件经过修改，在此期间执行 UVPD。</li>
	<li>通过增加激光能量并调节激光脉冲次数来激活已隔离的脂质 A 离子。典型的 UVPD 实验使用十个 6 mJ 脉冲。</li>
	<li>与步骤 4.8 相同，采集并平均谱图，直至 UVPD 产物离子达到足够的信噪比。所需扫描次数取决于原始前体离子的信号强度，通常在 3 至 300 次扫描之间（图 5B）。</li>
</ol>
6. 脂质A的32P标记及后续分离
<ol>
	<li>从单个菌落接种5 ml培养基（LB培养基或其他培养基），在37 °C或所需温度下过夜培养。</li>
	<li>次日，测定OD600 ，并用过夜培养物接种7 ml新鲜培养基，起始OD600约为0.05，培养于标准的20 × 150 mm一次性玻璃培养管中。加入2.5 μCi/ml的无机32P。继续培养细胞至OD600达到0.8–1.0。请遵循联邦、州和/或机构关于放射性物质安全操作的指导方针。</li>
	<li>将细胞转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬里盖的16 × 125 mm玻璃离心管中，使用固定角度临床离心机在1,500 × g条件下离心10分钟收集细胞。将上清液移至适当的放射性废物容器中。后续步骤中产生的所有放射性废物（例如液体、玻璃器皿、生物危害物）均应按照联邦、州和/或机构规定进行处置。</li>
	<li>用5 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀。在1,500 × g条件下离心10分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于5 ml单相Bligh-Dyer混合液（图2）中，该混合液由氯仿:甲醇:水（1:2:0.8, v/v）组成。涡旋混匀，并在室温下孵育&gt;20分钟，以确保细胞完全裂解。</li>
	<li>在临床离心机中以1,500 × g离心20分钟。小心倾倒出上清液，其中含有磷脂和异戊二烯脂质。</li>
	<li>将LPS沉淀用5 ml含1% SDS的50 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）重悬，通过涡旋混匀。使用水浴超声仪超声处理样品，直至沉淀均匀分散（约30秒）。</li>
	<li>将样品置于沸水浴中孵育30分钟。确保管盖拧紧但未完全密封。</li>
	<li>从水浴中取出，让样品在室温下冷却5–10分钟。</li>
	<li>通过加入2 ml氯仿和2 ml甲醇，将溶液转化为两相Bligh-Dyer混合液，最终形成氯仿:甲醇:水相（2:2:1.8, v/v）的混合体系。涡旋混匀后，在临床离心机中以1,500 × g离心10分钟，以分离两相。</li>
	<li>使用玻璃移液管将下相转移至洁净的玻璃离心管中（第一次提取）。</li>
	<li>向第11步剩余的上相中加入2 ml预平衡的两相Bligh-Dyer下相（按步骤1.2方法制备），进行第二次提取。涡旋混匀后在临床离心机中以1,500 × g离心10分钟。收集下相，并与第一次提取的下相合并。</li>
	<li>向合并后的下相（总体积约4 ml）中加入7.6 ml预平衡的上相（步骤1.2制备），形成两相Bligh-Dyer溶液（氯仿:甲醇:水；2:2:1.8, v/v）。涡旋混匀后离心10分钟。</li>
	<li>将下相转移至洁净玻璃管中，使用氮气吹干。干燥后的样品可于-20 °C保存，直至后续使用。</li>
</ol>
7. 通过薄层色谱法可视化32P标记的脂质A物种
<ol>
	<li>按照步骤 2.1-2.8 所述，准备 32P 标记的脂质 A 样品、薄层色谱（TLC）槽和 TLC 板。</li>
	<li>将 32P 标记的样品溶解于 500 μl 的 4:1 氯仿-甲醇（v/v）中。涡旋振荡并水浴超声，使脂质材料完全溶解。取 5 μl 样品加入含有 5 ml 闪烁液的闪烁瓶中。在闪烁计数器中计数，并计算样品的总计数/分钟（counts/min）。</li>
	<li>在检测放射性标记的脂质组分时，可使用 10 × 20 cm 或 20 × 20 cm 的 TLC 板。对于 10×20 cm 的 TLC 板，应将样品点样于步骤 2.5 中标记的起始线上，使板的最长边垂直放置（即 样品点在距 10 cm 边缘上方 2 cm 处标记的起始线位置）。</li>
	<li>使用微量毛细移液管，每样品点加 10,000–20,000 cpm，并让斑点自然干燥（&gt;15 分钟）。为达到每点 10,000–20,000 计数/分钟（2 μl 或每次 2 μl，总体积 &lt;10 μl）的要求，可能需要通过氮气吹干浓缩样品，再重悬于适当体积的溶剂中。</li>
	<li>将含有放射性标记样品的 TLC 板放入预先平衡的色谱槽中。当溶剂前沿迁移至 TLC 板顶部时（约 3 小时），取出板并空气干燥（&gt;60 分钟）。注意：含有吡啶的 TLC 板必须在化学通风橱中彻底干燥，因为痕量吡啶可能损坏磷屏成像仪的成像屏。可使用冷风枪确保完全干燥。</li>
	<li>用塑料膜包裹 TLC 板，并在放射自显影盒中过夜（O/N）暴露于磷屏成像仪（phosphorImager）屏幕上。次日早晨扫描成像屏以获得图像（图 6）。利用图像密度分析软件，该方法可实现对脂质 A 组分的准确相对定量。</li>
</ol>

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<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本方案中，我们详细描述了从细菌全细胞中分离脂质A组分的方法，并介绍了基于薄层色谱（TLC）或质谱（MS）的分析方法，用于对该分离产物进行化学表征。串联质谱是一种强大的从头（de novo）解析生物化合物结构的策略，在对自然界中广泛存在的各类脂质A分子进行化学表征时具有不可替代的价值。碰撞诱导解离（CID）和紫外光解离（UVPD）是两种互补的激活方法，可产生不同类型的碎片离子，为脂质A分子提供关键的指纹图谱。结合使用CID和UVPD进行二级质谱（MS/MS）碎裂分析，能够揭示脂质A结构之间的细微差异，从而更精确地完成化学结构的指认。此类数据对于建立脂质A分子种类在生物学中结构与功能之间的精确关联至关重要。此外，我们还描述了在小规模细菌培养物中利用32P对脂质A组分进行放射性标记的操作流程，通过薄层色谱结合放射自显影技术，可直观显示32P标记脂质A的化学分布模式。
本实验方案具有若干特点，任何使用者均应予以注意。对于大规模脂质A制备（方案1），起始溶剂与细菌沉淀物用量之间的比例可进行优化，以提高总体产率。然而，该比例只能通...

脂多糖（LPS）是几乎所有革兰氏阴性生物的主要外表面分子，由三个分子结构域组成：远端O-抗原多糖、核心寡糖以及锚定在外膜双分子层外小叶上的膜结合型脂质A结构域1,2。脂质A结构域包含3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸（Kdo）残基和一种脂质A分子，其中脂质A可定义为LPS在温和酸性水解后溶于氯仿的部分1,2。标准的脂质A分子在化学结构上可描述为一个双葡糖胺骨架，具有六条酰基链和两个磷酸基团（即六酰基化、双磷酸化），这与模式生物大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中观察到的主要脂质A结构一致1,2。共有九个在革兰氏阴性菌中保守存在的组成型表达基因负责脂质A结构域的合成（图1）1,2。大多数细菌还具有一组额外的基因，这些基因在系统发育保守性上存在差异，参与脂质A的进一步化学修饰3。去磷酸化、酰基链的去除，以及添加氨基糖（例如氨基阿拉伯糖）和/或磷酸乙醇胺等化学基团是最常见的修饰方式（图1）。许多负责脂质A修饰的酶可直接被环境信号（如二价阳离子）激活，或其表达受双组分信号响应调节系统调控3。
宿主固有免疫系统对脂质A（lipid A）的识别由Toll样受体4/髓样分化因子2（TLR4/MD2）共受体介导4。MD2与脂质A的脂肪酰链之间，以及TLR4与脂质A的1位和4'位磷酸基团之间的疏水作用力，促进了脂质A与TLR4/MD2的紧密结合4,5。脂质A酰化状态或其负电荷的改变会影响基于TLR4/MD2的脂质A识别，并进而影响固有免疫应答激活因子NF-κB以及炎症介质（如TNFα和IL1-β）的下游激活6,7。能够屏蔽脂质A负电荷的修饰还可阻止杀菌性阳离子抗菌肽与革兰氏阴性菌细胞表面结合3,8。许多脂质A修饰被认为可在特定环境条件下（如在人体宿主体内或特定生态位中）提高细菌的适应性。因此，许多参与修饰的酶成为理性设计抗菌化合物的潜在靶点。由于脂质A结构在不同生物体和/或环境条件下具有丰富的化学多样性，且这些不同的结构具有重要的生物学意义，因此对脂质A的结构表征是研究革兰氏阴性菌的重要课题。
从完整细菌中分离脂质A分子包括从细菌细胞表面提取脂多糖（LPS），通过水解步骤释放脂质A，最后进行纯化步骤9-11。最常被引用的LPS提取方法是热酚-水提取法，最初由Westphal和Jann提出10。提取得到的完整LPS随后进行温和酸水解，该过程在化学上将Kdo从脂质A远端葡萄糖胺糖的6'-羟基上分离（图1）。热酚-水法存在多种缺陷，包括使用高危害性试剂、需要降解共提取的核酸和蛋白质，以及完成整个方案需要数天时间10。
本实验室在Caroff和Raetz首次建立的脂质A提取与分离方法12,13基础上进行了进一步优化。与热酚-水法相比，本文所述方法更加快速高效，且适用于从5 ml到数升范围广泛的培养体积。此外，与热酚-水提取法不同，本方法不特异性选择粗糙型或光滑型脂多糖（LPS），因而可实现脂质A各类组分的最佳回收。在本实验方案中，采用氯仿、甲醇和水的混合液对完整细菌细胞进行化学裂解，随后通过离心沉淀LPS。结合温和酸水解与溶剂萃取（Bligh-Dyer法）以释放与多糖共价连接的脂质A。Bligh和Dyer最初将该方法应用于多种动植物组织中脂类物质的提取14，本文对其进行了改良，用于分离水解后的多糖与脂质A。在最终分离步骤中，氯仿可溶性脂质选择性地分配至下层有机相。为进一步纯化脂质A，可采用反相或阴离子交换柱层析方法12。
从完整细胞中分离出脂质A组分后，可采用多种分析方法来表征其化学结构，例如核磁共振（NMR）、薄层色谱（TLC）以及基于质谱（MS）的分析方法。NMR具有非破坏性结构解析的优势，能够提供有关糖苷键连接方式、酰基链位置的明确归属，以及脂质A修饰基团（如氨基阿拉伯糖或磷酸乙醇胺）连接位点的详细结构信息15-17。本实验方案未涉及脂质A的NMR分析，相关内容已在其他文献中充分描述15,16。TLC方法常用于快速分析，但无法直接提供精细化学结构信息。目前最常用的脂质A结构表征方法是基于质谱的分析技术18,19。基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）常用于初步筛查完整的脂质A组分。根据本提取流程制备的样品可生成单电荷离子。当需要更精细的结构分析时，串联质谱（MS/MS）方法比MALDI-MS提供更丰富的结构信息。通过电喷雾电离（ESI）产生的单电荷或多电荷脂质A前体离子，可进一步利用碰撞诱导解离（CID）或紫外光解离（UVPD）进行碎裂，从而生成具有结构指示意义的产物离子18,20,21。在ESI-MS过程中，脂质A前体离子还常发生中性丢失，产生额外的结构信息层。
串联质谱法（MS/MS）已被证明是解析脂质A结构不可或缺且用途广泛的方法。在MS/MS过程中，离子被活化后产生具有诊断意义的碎片图谱，可用于推断前体离子的结构。目前最广泛应用的MS/MS方法是碰撞诱导解离（CID）。该方法通过选定的前体离子与惰性靶气体碰撞，使能量沉积并导致离子解离，从而产生碎片离子。CID已被证实是解析多种细菌物种脂质A结构的关键工具22-33。
尽管CID是最广泛使用的串联质谱（MS/MS）方法，但其产生的碎片离子种类有限。193 nm紫外光解离（UVPD）是一种替代且互补的MS/MS方法。该方法利用激光照射离子，离子吸收光子后被激发并发生后续解离。这种高能量的MS/MS技术比CID产生更多样化的碎片离子，因而提供更具信息量的裂解图谱。特别是，UVPD可通过糖苷键、胺键、酰基以及碳-碳键的断裂，提供有关脂质A物种细微变化的信息18,21,34。

<table><tbody><tr><td>氯仿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C607</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>特氟龙 FEP 离心瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>硅胶 60 薄层层析板</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>3MM 型号色谱纸</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExciStar XS 准分子激光器</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoTip 纳喷电喷雾电离发射器</td><td>New Objectives</td><td></td><td>&amp;#8805; 30 &amp;mu;m 以减少堵塞</td></tr><tr><td>Model 505 脉冲/延迟发生器</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热板 Thermolyne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 螺口一次性硼硅酸盐培养管</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用 GPI 45-415 螺口聚四氟乙烯（PTFE）盖</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>个人分子成像系统（磷屏成像仪）</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>自动放射自显影暗盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>磷屏 SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肽质量标准品试剂盒</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier S250-A 超声破碎仪</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 12x32 mm 锥底螺口小瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

革兰氏阴性菌脂质a的分离与化学表征

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌主要的细胞表面分子，位于外膜双层结构的外层小叶上。LPS 可分为三个区域：远端的 O-多糖、核心寡糖以及脂质 A 区域，后者由一种脂质 A 分子种类和 3-脱氧-D-甘油-D-甘露-辛-2-酮糖酸残基（Kdo）组成。脂质 A 区域是细菌细胞存活所必需的唯一组分。在合成之后，脂质 A 会根据环境压力（如 pH 或温度）发生化学修饰，以增强对抗生素类化合物的抗性，并逃避宿主固有免疫应答介质的识别。本实验方案详细描述了从革兰氏阴性菌中进行小规模和大规模脂质 A 分离的方法。分离得到的物质随后通过薄层色谱法（TLC）或质谱法（MS）进行化学表征。除了基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱外，我们还描述了串联质谱分析脂质 A 分子种类的方案，包括采用电喷雾电离（ESI）结合碰撞诱导解离（CID）以及新近应用的紫外光解离（UVPD）方法。我们的质谱方案能够明确确定其化学结构，这对于表征含有独特或新型化学修饰的脂质 A 分子至关重要。我们还描述了利用放射性同位素标记细菌细胞中的脂质 A 并随后进行分离，以用于薄层色谱分析。与基于质谱的方案相比，薄层色谱法成本更低且速度更快，但在缺乏已知化学结构标准品的情况下，无法明确指认脂质 A 的化学结构。在过去的二十年中，脂质 A 的分离与表征已带来许多令人振奋的发现，加深了我们对革兰氏阴性菌生理学、抗生素耐药机制以及人类固有免疫应答的理解，并为抗菌化合物的研发提供了大量新靶点。

典型脂质A E. coli 和 沙门氏菌肠亚种 血清型鼠伤寒沙门菌是一种在1-和4'-位带有磷酸基团的葡萄糖胺双糖六酰化结构。在营养丰富的培养基中生长时（例如 Luria肉汤）中，部分脂质A在1位含有焦磷酸基团，产生一个 tris-磷酸化物种36 (图1). Kdo（3-脱氧-D-甘露糖-octulosonic acid）连接在6'-羟基上，作为连接脂质A与其余碳水化合物结构域的桥梁（即 核心寡糖和O-抗原区域）的LPS。尽管革兰氏阴性菌在脂质A生物合成途径上具有与之相似的保守通路，类似于 E. coli K-12中，脂质A的结构具有高度多样性。这种多样性源于一系列潜伏酶的作用，这些酶可修饰脂质A结构，并在环境刺激下被激活。例如，在 S. enterica 脂质A的磷酸基团可被阳离子糖L-4-氨基阿拉伯糖修饰（图1；蓝色）或含磷酸乙醇胺残基（图1；品红）。在 沙门氏...

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌主要的细胞表面分子，位于外膜双层结构的外层小叶上。LPS……

以下实验的总体目标是从革兰氏阴性菌的外表面分离脂多糖，并利用串联质谱技术对脂质A部分进行结构表征。该目标通过化学方法从细菌细胞表面提取脂多糖，随后采用温和酸水解法将脂质A从脂多糖的多糖部分释放出来而实现。第二步，采用电喷雾电离串联质谱法（ESI-MS/MS）分析脂质A溶液。在本实验中，脂质A通过基于碰撞诱导解离或紫外光解离的串联质谱技术进行结构表征分析。结果显示，采用碰撞诱导解离或紫外光解离串联质谱方法所产生的质谱图中，碎片化模式存在差异，其中紫外光解离（UVPD）产生的碎片化图谱信息更为丰富。该技术相较于现有方法的主要优势在于，串联质谱能够通过解析特征性碎片离子图谱，实现对目标分析物的结构鉴定。紫外线光解，特别是作为一种高能串联质谱方法，相较于碰撞诱导解离等现有技术，能够产生更多样化的碎片离子。由于所采用的紫外线光解质谱方法尚未实现商业化，因此对该方法的可视化演示尤为关键。此外，在开始本实验流程之前，该方法所使用的激光器已通过定制化改造与质谱仪集成。从250 mL细菌培养物中收获细胞，在4°C条件下以10,000 × g离心10分钟。然后弃去上清液，用50 mL 1× PBS洗涤细胞沉淀。再次离心以重新沉淀细胞后，弃去上清液。接下来，将细胞重悬于40 mL的1×PBS中，并分装至2个250 mL的聚四氟乙烯离心管中。向每根管中加入25 mL氯仿和50 mL甲醇，形成单相混合液。通过倒置混匀，并在室温下孵育至少20分钟。为确保细胞完全裂解，将混合物在室温下以2000 × g离心20分钟，弃去上清液。用约100 mL单相Bly直接混合液洗涤LPS沉淀。再次以2000 × g离心20分钟，并弃去上清液。向LPS沉淀物中加入27毫升温和酸水解缓冲液，通过上下吹打混匀，直至仅剩微小颗粒，使用探头超声仪进行超声处理，以50%输出功率和恒定占空比超声20秒，使LPS沉淀物在溶液中均匀重悬。重复超声处理样品两次，每次超声20秒，两次超声之间间隔约5秒。然后将样品在水浴中煮沸30分钟。从水浴中取出试管，使样品冷却至室温。在进行酸水解后的脂质A提取之前，通过加入30 mil氯仿和30 mil甲醇，将SDS溶液转化为氯仿-甲醇-水两相BLY混合液，再通过倒置混匀并离心。在2000 × g 条件下离心10分钟。使用玻璃移液管将下相转移至洁净的聚四氟乙烯离心管中。随后，进行第二次萃取：向样品管中的上相加入30 mL预先平衡的两相双液混合物的下相，倒置混匀后，在2000 × g 条件下离心10分钟。用玻璃移液管收集下相，并与先前提取的下相合并。向合并的下相中加入114 mL预平衡的双水相上相，通过倒置混合形成双水相体系，然后离心。以2000 × g离心10分钟，使用玻璃移液管转移。将下相转移至洁净的玻璃旋转蒸发瓶中，通过旋转蒸发干燥样品。接下来，向旋转烧瓶中加入 5 mL 氯仿-甲醇混合液，超声处理至少 30 秒，以帮助将脂质 A 从烧瓶壁上充分悬浮。使用玻璃移液管将脂质转移至一个洁净的玻璃管中，该管配有聚四氟乙烯（A-P-T-F-E）衬里的酚醛螺帽盖。使用氮气干燥器在氮气流下将样品干燥。将干燥后的脂质重新悬浮于1 mL氯仿-甲醇混合液中。加入溶剂后涡旋混合，以确保完全重悬。转移至小型玻璃样品瓶中，使用氮气吹干。将干燥后的样品在-20 °C下保存，直至后续进行薄层色谱（TLC）或质谱（MS）分析。样品可在-20 °C下保存，直至后续分析。样品制备完成后，取200 µL HPLC级甲醇与200 µL HPLC级氯仿加入一个空的小玻璃样品瓶中，混匀；然后将200 µL氯仿-甲醇溶剂混合液转移至含有脂质A的样品瓶中，超声处理5分钟，或直至所有物质完全溶解。随后，将质谱仪设置为负离子模式电喷雾电离，用250 µL注射器吸取脂质A溶液。将注射器插入注射泵，并直接注入稀释后的脂质。样品流速为每分钟 2.0 至 3.5 微升。通过调节离子光学参数，优化并增强脂质离子信号。采集脂质的质谱。通过选择CID作为MSM方法，分离并激活目标脂质A。随后，逐步提高CID电压或归一化碰撞能量，直至前体脂质。某一物种的相对丰度约为最高产物离子的10%，需对谱图进行平均，直至达到足够的信噪比。对于产物离子，按照前一节所述方法制备样品和质谱仪。启动与质谱仪连接的激光器。参见文本方案中关于质谱细节的设置：配置仪器软件，使离子进入HCD池后触发准分子激光器，随后打开脉冲发生器，使激光每2毫秒脉冲一次。通过选择HCD作为二级质谱（MS/MS）方法来隔离脂质前体离子，并将碰撞能量调整为1%的归一化碰撞能量。通过增加激光能量并调节激光脉冲次数（通常为10次，每次6毫焦）来激活已分离的脂质离子。最后，采集并平均谱图，直至获得足够的信噪比。对于UVPD产生的碎片离子。大肠杆菌K-12菌株W3110来源的脂质A在负离子模式下的MALDI-TOF质谱显示，质荷比为1796.2处出现单一的去质子化产物离子，为主要观测到的离子峰。MALDI-TOF分析的详细信息在文本方案中有讨论。或者，相同的脂质样品在负离子模式电喷雾电离（ESI）下主要产生双去质子化的脂质离子，其母离子质荷比为898.1；质荷比为1796.20的单去质子化脂质离子也可观测到，但其相对丰度低于双去质子化物种。可通过碰撞诱导解离（CID）或193纳米紫外光解离（UVPD）对单去质子化的脂质离子进行碎裂分析。这些技术可用于更准确地确定脂质的化学结构。一种包含复杂修饰组合或先前未表征化学修饰的物种。碎片谱图中以虚线表示断裂位点，并与每种给定结构下方的母电荷比值相对应。以红色字体标出的母电荷比值和断裂位点代表与UVPD 32 P标记脂质相关的特异性产物离子。从两种不同的大肠杆菌K-12菌株中分离的A通过薄层色谱法（TLC）进行分析。该实验步骤的详细方案在文内方案部分有详细描述。K-12菌株W3110主要含有双磷酸化和三磷酸化脂质A，而在32P标记的脂质A中则观察到更为复杂的TLC图谱。一种从大肠杆菌菌株WD 1 0 1中分离得到的物质A。WD 1 0 1可产生脂质，且物质A被核糖和磷酸乙醇胺高度修饰。由于1位和4′位磷酸基团均可发生修饰，因此WD 1 0 1来源的脂质A可被描述为单修饰型，即仅在其中一个磷酸基团上修饰有L-氨基阿拉伯糖或磷酸乙醇胺；也可为双修饰型，即两个磷酸基团以组合方式同时发生修饰。除1位和4′位磷酸基团的修饰外，还观察到棕榈酸的加成修饰，该修饰可提高脂质A在此溶剂体系中的比移值（RF值）。本实验方案为微生物学领域的研究人员深入探索脂质A修饰如何影响革兰氏阴性菌生物学功能的结构-功能关系提供了独特途径。我们也非常关注并已展示了基于紫外光解离（UVPD）的质谱技术在解析生物重要分子结构方面的强大能力，例如糖类、蛋白质、核酸以及其他复杂脂质。切勿忽视，使用有机溶剂、生物危害性材料和激光可能具有极高的危险性。必须强调，溶剂应在通风良好的化学通风橱中进行操作。应始终穿戴适当的防护设备，例如手套和护目镜，并对用于紫外光解离（UVPD）的激光器进行适当的屏蔽。

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隔离和脂质A的化学表征革兰氏阴性菌

我们介绍一种改良的热酚水法，用于从革兰氏阴性菌中纯化脂多糖（LPS）。提取后的LPS可通过SDS-PAGE进行分析，并通过直接染色或Western免疫印迹进行检测。...

通过热酚-水法提取纯化和可视化革兰氏阴性菌脂多糖

本视频演示了基于薄层色谱法分离分枝菌酸的技术。该技术根据分枝菌酸——存在于分枝杆菌细胞壁中的长链脂质——的极性差异实现不同类型分枝菌酸的分离。...

基于薄层色谱法分离分枝杆菌酸变体：一种根据极性分离分枝杆菌细胞壁脂质的方法

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。...

通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。...

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该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus...

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

革兰氏阴性细菌具有两个空间上分离的膜结构。外膜与内膜之间由周质空间和肽聚糖层分隔。分离这些微生物双层膜的能力对于理解其生理学和致病机制至关重要。...

将革兰氏阴性菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分的技术方法及对Acinetobacter baumannii的优化调整

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核苷三磷酸——从合成到生化表征

学习从革兰氏阴性菌中分离脂多糖并进行脂质A的化学表征，采用串联质谱技术解析其结构特征。该方法有助于深入理解细菌抗生素耐药机制及宿主免疫反应。

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

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