革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

以下实验的总体目标是从革兰氏阴性菌的外表面分离脂多糖，并利用串联质谱技术对脂质A部分进行结构表征。该目标通过化学方法从细菌细胞表面提取脂多糖，随后采用温和酸水解法将脂质A从脂多糖的多糖部分释放出来而实现。第二步，采用电喷雾电离串联质谱法（ESI-MS/MS）分析脂质A溶液。

在本实验中，脂质A通过基于碰撞诱导解离或紫外光解离的串联质谱技术进行结构表征分析。结果显示，采用碰撞诱导解离或紫外光解离串联质谱方法所产生的质谱图中，碎片化模式存在差异，其中紫外光解离（UVPD）产生的碎片化图谱信息更为丰富。该技术相较于现有方法的主要优势在于，串联质谱能够通过解析特征性碎片离子图谱，实现对目标分析物的结构鉴定。

紫外线光解，特别是作为一种高能串联质谱方法，相较于碰撞诱导解离等现有技术，能够产生更多样化的碎片离子。由于所采用的紫外线光解质谱方法尚未实现商业化，因此对该方法的可视化演示尤为关键。此外，在开始本实验流程之前，该方法所使用的激光器已通过定制化改造与质谱仪集成。

从250 mL细菌培养物中收获细胞，在4°C条件下以10,000 × g离心10分钟。然后弃去上清液，用50 mL 1× PBS洗涤细胞沉淀。再次离心以重新沉淀细胞后，弃去上清液。

接下来，将细胞重悬于40 mL的1×PBS中，并分装至2个250 mL的聚四氟乙烯离心管中。向每根管中加入25 mL氯仿和50 mL甲醇，形成单相混合液。通过倒置混匀，并在室温下孵育至少20分钟。

为确保细胞完全裂解，将混合物在室温下以2000 × g离心20分钟，弃去上清液。用约100 mL单相Bly直接混合液洗涤LPS沉淀。再次以2000 × g离心20分钟，并弃去上清液。

向LPS沉淀物中加入27毫升温和酸水解缓冲液，通过上下吹打混匀，直至仅剩微小颗粒，使用探头超声仪进行超声处理，以50%输出功率和恒定占空比超声20秒，使LPS沉淀物在溶液中均匀重悬。重复超声处理样品两次，每次超声20秒，两次超声之间间隔约5秒。

然后将样品在水浴中煮沸30分钟。从水浴中取出试管，使样品冷却至室温。在进行酸水解后的脂质A提取之前，通过加入30 mil氯仿和30 mil甲醇，将SDS溶液转化为氯仿-甲醇-水两相BLY混合液，再通过倒置混匀并离心。

在2000 × g 条件下离心10分钟。使用玻璃移液管将下相转移至洁净的聚四氟乙烯离心管中。随后，进行第二次萃取：向样品管中的上相加入30 mL预先平衡的两相双液混合物的下相，倒置混匀后，在2000 × g 条件下离心10分钟。用玻璃移液管收集下相，并与先前提取的下相合并。

向合并的下相中加入114 mL预平衡的双水相上相，通过倒置混合形成双水相体系，然后离心。以2000 × g离心10分钟，使用玻璃移液管转移。将下相转移至洁净的玻璃旋转蒸发瓶中，通过旋转蒸发干燥样品。

接下来，向旋转烧瓶中加入 5 mL 氯仿-甲醇混合液，超声处理至少 30 秒，以帮助将脂质 A 从烧瓶壁上充分悬浮。使用玻璃移液管将脂质转移至一个洁净的玻璃管中，该管配有聚四氟乙烯（A-P-T-F-E）衬里的酚醛螺帽盖。

使用氮气干燥器在氮气流下将样品干燥。将干燥后的脂质重新悬浮于1 mL氯仿-甲醇混合液中。加入溶剂后涡旋混合，以确保完全重悬。

转移至小型玻璃样品瓶中，使用氮气吹干。将干燥后的样品在-20 °C下保存，直至后续进行薄层色谱（TLC）或质谱（MS）分析。样品可在-20 °C下保存，直至后续分析。

样品制备完成后，取200 µL HPLC级甲醇与200 µL HPLC级氯仿加入一个空的小玻璃样品瓶中，混匀；然后将200 µL氯仿-甲醇溶剂混合液转移至含有脂质A的样品瓶中，超声处理5分钟，或直至所有物质完全溶解。随后，将质谱仪设置为负离子模式电喷雾电离，用250 µL注射器吸取脂质A溶液。

将注射器插入注射泵，并直接注入稀释后的脂质。样品流速为每分钟 2.0 至 3.5 微升。通过调节离子光学参数，优化并增强脂质离子信号。

采集脂质的质谱。通过选择CID作为MSM方法，分离并激活目标脂质A。随后，逐步提高CID电压或归一化碰撞能量，直至前体脂质。

某一物种的相对丰度约为最高产物离子的10%，需对谱图进行平均，直至达到足够的信噪比。对于产物离子，按照前一节所述方法制备样品和质谱仪。启动与质谱仪连接的激光器。

参见文本方案中关于质谱细节的设置：配置仪器软件，使离子进入HCD池后触发准分子激光器，随后打开脉冲发生器，使激光每2毫秒脉冲一次。通过选择HCD作为二级质谱（MS/MS）方法来隔离脂质前体离子，并将碰撞能量调整为1%的归一化碰撞能量。通过增加激光能量并调节激光脉冲次数（通常为10次，每次6毫焦）来激活已分离的脂质离子。最后，采集并平均谱图，直至获得足够的信噪比。

对于UVPD产生的碎片离子。大肠杆菌K-12菌株W3110来源的脂质A在负离子模式下的MALDI-TOF质谱显示，质荷比为1796.2处出现单一的去质子化产物离子，为主要观测到的离子峰。MALDI-TOF分析的详细信息在文本方案中有讨论。

或者，相同的脂质样品在负离子模式电喷雾电离（ESI）下主要产生双去质子化的脂质离子，其母离子质荷比为898.1；质荷比为1796.20的单去质子化脂质离子也可观测到，但其相对丰度低于双去质子化物种。可通过碰撞诱导解离（CID）或193纳米紫外光解离（UVPD）对单去质子化的脂质离子进行碎裂分析。这些技术可用于更准确地确定脂质的化学结构。

一种包含复杂修饰组合或先前未表征化学修饰的物种。碎片谱图中以虚线表示断裂位点，并与每种给定结构下方的母电荷比值相对应。以红色字体标出的母电荷比值和断裂位点代表与UVPD 32 P标记脂质相关的特异性产物离子。

从两种不同的大肠杆菌K-12菌株中分离的A通过薄层色谱法（TLC）进行分析。该实验步骤的详细方案在文内方案部分有详细描述。K-12菌株W3110主要含有双磷酸化和三磷酸化脂质A，而在32P标记的脂质A中则观察到更为复杂的TLC图谱。

一种从大肠杆菌菌株WD 1 0 1中分离得到的物质A。WD 1 0 1可产生脂质，且物质A被核糖和磷酸乙醇胺高度修饰。

由于1位和4′位磷酸基团均可发生修饰，因此WD 1 0 1来源的脂质A可被描述为单修饰型，即仅在其中一个磷酸基团上修饰有L-氨基阿拉伯糖或磷酸乙醇胺；也可为双修饰型，即两个磷酸基团以组合方式同时发生修饰。除1位和4′位磷酸基团的修饰外，还观察到棕榈酸的加成修饰，该修饰可提高脂质A在此溶剂体系中的比移值（RF值）。本实验方案为微生物学领域的研究人员深入探索脂质A修饰如何影响革兰氏阴性菌生物学功能的结构-功能关系提供了独特途径。

我们也非常关注并已展示了基于紫外光解离（UVPD）的质谱技术在解析生物重要分子结构方面的强大能力，例如糖类、蛋白质、核酸以及其他复杂脂质。切勿忽视，使用有机溶剂、生物危害性材料和激光可能具有极高的危险性。必须强调，溶剂应在通风良好的化学通风橱中进行操作。

应始终穿戴适当的防护设备，例如手套和护目镜，并对用于紫外光解离（UVPD）的激光器进行适当的屏蔽。