Name: 一个协议，用于基因诱导和良性和浸润性肿瘤可视化的头侧配合果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习在果蝇中诱导良性和浸润性肿瘤的方法，通过解剖幼虫头侧复合体进行可视化观察。该方案利用激活的癌基因与细胞极性基因突变的协同作用，为肿瘤动力学和癌症生物学研究提供可靠的实验手段。

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本实验室的研究工作得到了西肯塔基大学生物学系启动资金、西肯塔基大学研究基金会RCAP-I项目资助（项目编号：11-8032）以及KBRIN-AREA项目的资助；KBRIN-AREA项目由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所通过资助号5P20GM103436-13的母项目提供支持。我还要感谢田旭博士，在其实验室中我首次接触到该技术；同时感谢雷蒙德·帕利亚里尼博士，他在田旭实验室中首次建立了该技术。

1. 良性非侵入性肿瘤的诱导
<ol>
	<li>使用 表2 中列出的品系诱导良性肿瘤。</li>
	<li>为以下基因型的“测试者”品系制备起始培养物：y,w, ey-FLP1; Tub-Gal80,FRT40A; Act5C&gt;y+&gt;Gal4, UAS-GFP</li>
	<li>为以下基因型的“被测试”品系制备起始培养物：w; FRT40A, UAS-RasV12/CyO</li>
	<li>从“测试者”品系中收集十只雌性处女蝇，从“被测试”品系中收集十只雄性果蝇。</li>
	<li>将“测试者”品系的雌蝇与“被测试”品系的雄蝇共同放入一个含有果蝇食物的试管中进行杂交。</li>
	<li>将杂交试管置于25 °C培养箱中，使雌雄果蝇交配并产卵24–48小时。</li>
	<li>检查试管中是否有足够的卵沉积，并观察是否存在一龄幼虫，同时确保培养物未干涸。
	<ol>
		<li>若培养物出现干燥，可加入数滴经高压灭菌的蒸馏水以保持湿润。</li>
		<li>持续监测培养物，并根据需要重复步骤1.7.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第3节所述方法，在荧光体视显微镜下观察游走期三龄幼虫。</li>
</ol>
2. 侵袭性肿瘤的诱导
<ol>
	<li>使用表2中列出的品系诱导侵袭性肿瘤。</li>
	<li>使用上述步骤1.2中的起始培养物，其基因型为：y,w, ey-FLP1; Tub-Gal80,FRT40A; Act5C&gt;y+&gt;Gal4, UAS-GFP</li>
	<li>为“待测”品系准备起始培养物，其基因型为：w; lgl4, FRT40A, UAS-RasV12/CyO</li>
	<li>从“测试”品系中收集10只雌性处女蝇，从“待测”品系中收集10只雄性果蝇。</li>
	<li>将“测试”品系的雌蝇与“待测”品系的雄蝇共同放入一个含有果蝇食物的培养瓶中进行杂交。</li>
	<li>将杂交组合置于25 °C培养箱中，让果蝇交配并产卵24–48小时。</li>
	<li>检查培养瓶中是否有足够的卵沉积，并观察是否存在一龄幼虫，同时确保培养基不会干燥。
	<ol>
		<li>若培养基出现干燥，可加入几滴灭菌蒸馏水以保持湿润。</li>
		<li>持续监测培养基湿度，并根据需要重复步骤2.7.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第3节所述方法，在荧光体视显微镜下观察三龄幼虫。</li>
</ol>
3. 良性与侵袭性肿瘤的观察
<ol>
	<li>使用三龄幼虫进行良性肿瘤的分离与观察。
	<ol>
		<li>将画笔浸入蒸馏水中润湿，用该画笔从培养瓶壁上刮取数只三龄幼虫。</li>
		<li>将幼虫置于凹玻片中，加入1×PBS，再用湿润的画笔轻轻刮除幼虫表皮上的食物残留物。</li>
		<li>将幼虫放入培养皿中，置于-20 °C冰箱中冷冻30分钟，以固定幼虫。
		<ol>
			<li>使用FLYNAP固定幼虫的替代方法。</li>
			<li>将蘸有FLYNAP的棉棒放入步骤3.1.3.2中的培养瓶内，塞紧瓶口后静置30至40分钟，使幼虫在瓶内充分麻醉。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将固定好的幼虫置于载玻片上，滴加一滴轻质卤代烃油，盖上盖玻片，在具备绿色荧光蛋白（GFP）观察功能的荧光体视显微镜下进行观察。</li>
		<li>携带良性肿瘤的幼虫在头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从上述第2步设置的培养体系中选取诱导后第10天的幼虫用于侵袭性肿瘤的观察。选择第10天幼虫的原因是，携带侵袭性肿瘤的幼虫幼虫期延长，通常无法正常化蛹。</li>
	<li>重复步骤3.1.1至3.1.4，但使用第10天的幼虫代替三龄幼虫。
	<ol>
		<li>第10天携带侵袭性肿瘤的幼虫在头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若荧光显微镜配备数码相机，可对发出荧光的良性肿瘤和侵袭性肿瘤携带幼虫进行拍照记录。</li>
</ol>
4. 头部复合体的解剖及良性与侵袭性肿瘤的进一步观察
幼虫半透明的表皮使得观察肿瘤侵袭范围变得困难。因此，通过将头部复合体从幼虫体内解剖出来，可以更清晰地观察肿瘤的侵袭程度。以下步骤应用于解剖头部复合体。
<ol>
	<li>使用湿润的画笔从相应的培养管中选取三龄幼虫（用于良性肿瘤）和第10天的幼虫（用于侵袭性肿瘤）。</li>
	<li>将幼虫放入含有冷的1×PBS的解剖培养皿孔中。用画笔轻轻刮去幼虫表皮上的食物颗粒。
	<ol>
		<li>将清洁后的幼虫转移至解剖培养皿中另一个含有冷的1×PBS的新孔中。</li>
		<li>使用能够检测荧光的体视显微镜检查GFP荧光的存在情况，弃去无GFP荧光的幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖培养皿的新孔中加入1.0 ml冷的1×PBS，并用一对镊子将携带良性或侵袭性肿瘤的幼虫转移至其中（这两种肿瘤类型的解剖流程相同）。</li>
	<li>用一对镊子夹住幼虫，位置大约在前端的2/3处。
	<ol>
		<li>使用另一对镊子迅速分离并弃去幼虫后1/3部分。</li>
		<li>松开幼虫前2/3部分。随着幼虫体内压力释放，其内容物将从体腔中渗出。</li>
		<li>使用一对镊子移除已从体腔中渗出的肠道、脂肪体及其他内部组织。</li>
		<li>用一对镊子夹住幼虫的口钩，并将其推入幼虫表皮，再用另一对镊子将幼虫完全翻转。</li>
		<li>用镊子轻柔而仔细地去除脂肪体、唾液腺、肠道、翅盘复合体以及任何气管组织。此时，头部复合体应已清晰可见，并附着于翻转后幼虫的口钩上。脑半球和腹神经索（VNC）仍通过从VNC发出的神经与幼虫表皮相连。</li>
		<li>用一对镊子轻轻破坏头部神经与幼虫表皮之间的连接。</li>
		<li>当VNC与幼虫表皮之间的神经连接被破坏，且多余脂肪体和其他组织被清除后，头部复合体将变得清晰可见，仅通过口钩与幼虫表皮相连。</li>
		<li>若后续需进行固定处理（如抗体染色或进一步观察），可将头部复合体保留在幼虫表皮上。</li>
		<li>若不再进行后续实验操作，可将头部复合体从幼虫表皮上分离，并置于一滴基于甘油的封片剂中用于进一步观察与分析。使用VECTASHIELD作为封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我无任何利益冲突需要披露。

癌症是一种复杂的疾病，如今人们对它的理解已远胜于过去。然而，在全面揭示其潜在机制之前，仍有许多问题有待学习和阐明。本文介绍的简单实验方案能够在完整生物体中通过遗传手段诱导良性和侵袭性肿瘤，并进而研究该模型中肿瘤进展相关的生物学特性。目前在果蝇（Drosophila）及其他生物中已有的大多数技术，要么依赖细胞培养系统来研究肿瘤发生与转移，要么采用将原发肿瘤组织移植到成年宿主体内的方法23-27。这两种基于细胞和移植的技术均存在局限性。例如，移植技术操作繁琐、耗时较长，且可能导致非肿瘤组织被误植到宿主体内，从而产生实验假象。此外，基于细胞培养的系统仅能近似模拟整个生物体内真实存在的环境，这一局限性使得难以重现肿瘤与其微环境之间至关重要的相互作用，而这种相互作用在肿瘤进展和转移过程中发挥着关键作用34。本文所述技术已被多个研究团队成功用于探究果蝇（Drosophila）中肿瘤进展的遗传与分子基础。例如，利用该技术已证明，JNK信号通路在侵袭性肿瘤中表达上调，并且对肿瘤的进展具有必要性35,36。在另一项研究中，该遗传模型也揭示了基质金属蛋白酶...

肿瘤从良性发展为转移性状态是一个逐步的过程，其特征是逃避机体存在的保护机制8。例如，体内的肿瘤细胞必须能够逃避凋亡和免疫系统的清除，突破称为基底膜的特化细胞外基质（ECM），并克服周围细胞施加的任何社会性调控8。正是通过这一逐步进展，癌细胞获得了迁移并定植于远端部位的能力，这一过程称为转移。目前，我们对肿瘤细胞如何克服机体屏障的认识仍处于初级阶段，然而迄今为止的研究结果表明，癌细胞反复利用了正常的发育过程和信号通路11-13。
果蝇 黑腹果蝇 通过过去几十年来发展起来的复杂遗传学技术，极大地促进了我们对正常发育和疾病的理解 14-17利用诱变和过表达工具，我们对多种癌基因和肿瘤抑制基因有了更深入的理解 18-22然而，肿瘤转移是多种基因突变协同作用的结果，这一过程主要在细胞培养模型中进行研究 23,24 以及各种异种移植模型 25-27这些模型尽管功能强大，但仍存在局限性，因为它们无法完全模拟活体生物体内的条件。此外，现有的小鼠转基因模型操作繁琐，不利于对侵袭性行为进行遗传学分析。 28,29. 多项研究试图阐明肿瘤细胞的侵袭过程 黑腹果蝇 30,31这些技术主要利用将原发肿瘤移植到宿主，随后通过追踪移植肿瘤对邻近组织的侵袭来进行研究。 32,33一种名为MARCM的强大技术 10 由 Pagliarini 和 Xu 改进而用于模拟肿瘤侵袭的模型 果蝇 9。这种优雅的肿瘤侵袭遗传模型利用了活化型癌基因与细胞极性丧失之间的协同作用。该模型的优势在于，侵袭性肿瘤是在完整的生物体内形成的，从而避免了组织移植的需要。为了实现这种癌基因的协同作用，可使用一种活化型癌基因（如Ras）V12 在幼虫眼-触角成虫盘的细胞克隆中表达。由于使用了MARCM技术，这些克隆同时标记有绿色荧光蛋白（GFP），便于观察，并且可使细胞极性突变体（如）成为纯合状态 致命性巨大幼虫, 涂鸦，以及 discs large 结果是在头部复合体中出现GFP标记的侵袭性肿瘤。本报告中，我展示了如何在完整幼虫以及分离的头部复合体中诱导并观察这些侵袭性肿瘤。此处所采用的肿瘤诱导方法利用了第二染色体上的试剂。 果蝇 在 表 2，我在X和3上提供股票清单rd 可用于相同目的的染色体。我认为，这一简化的实验方案将使该技术更易于被致力于研究肿瘤进展分子机制的研究人员所采用。

<table><tbody><tr><td>10X PBS（磷酸盐缓冲液）pH 7.2 储存液</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>预冷的 1X PBS pH 7.2 工作液</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td>现配现用，冷藏保存，可使用长达一周</td></tr><tr><td>Flynap</td><td>Carolina Biologicals</td><td></td><td>用于麻醉幼虫的果蝇麻醉剂</td></tr><tr><td>固定液</td><td>0.1M PIPES, pH 7.2, 4% 多聚甲醛</td><td></td><td>用于固定解剖得到的头端复合体</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>若干</td><td></td><td>用于保持溶液低温；解剖头端复合体时需在预冷的 1X PBS 中进行，随后置于冰上的 Eppendorf 管中</td></tr><tr><td>1.7 ml Eppendorf 管</td><td>各种品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片、盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂或其他任何封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 200 或 700 油</td><td>Polysciences Inc. 或 Halocarbon.com</td><td></td><td>Halocarbon 200 用于在荧光体视显微镜下观察时封载幼虫样本</td></tr><tr><td>Sally Hansen &quot;Hard as Nails&quot; 指甲油</td><td>可在任何普通商品零售店购买</td><td></td><td>用于密封盖玻片边缘</td></tr><tr><td>Leica MZ16.5 荧光体视显微镜或任何其他荧光体视显微镜</td><td>Leica 及其他厂商</td><td></td><td>用于观察幼虫中的 GFP 荧光</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9 孔斑点板或任何其他解剖皿</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>可在任何普通商品零售店购买</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 本实验方案所需材料。</td></tr></tbody></table>

一种用于头部分节复合体中良性和侵袭性肿瘤遗传诱导与可视化的方法 黑腹果蝇

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

在过去几十年中，Drosophila 果蝇极大地推动了我们对正常发育和疾病遗传基础的理解，时至今日，它仍在复杂疾病研究中发挥着重要作用1-7。肿瘤从良性状态向转移性状态的进展是一个复杂的过程8，该过程已在Drosophila中建立模型，以帮助我们更深入地理解此类疾病的遗传机制9。本文介绍了一种简便的实验方案，用于在Drosophila幼虫中通过遗传手段诱导、观察并分析肿瘤的进展过程。该肿瘤诱导技术基于MARCM系统10，利用活化的癌基因RasV12与细胞极性基因（scribbled、discs large和lethal giant larvae）失活之间的协同作用，从而诱导产生侵袭性肿瘤9。我将展示如何在完整幼虫体内可视化这些肿瘤，以及如何将其解剖分离以进行后续分析。本文所呈现的简化实验流程，将有助于希望研究特定基因在肿瘤侵袭过程中作用的研究人员应用该技术。

通过本方案，实验者将能够通过在幼虫眼-触角成虫盘中过表达一种活化的癌基因来诱导良性肿瘤的形成。此外，实验者还可通过在具有细胞极性基因突变的细胞克隆中过表达活化癌基因，从而在眼-触角成虫盘中诱导产生侵袭性肿瘤。这些肿瘤可在荧光体视显微镜下借助荧光信号被清晰观察到，表现为整条幼虫或从幼虫体腔中解剖获得的头部复合体中的“绿色荧光”组织。图1）。良性肿瘤将定位于眼触角盘复合体，表现为GFP阳性细胞克隆，而侵袭性肿瘤则会导致肿瘤的大量过度生长，并继而迁移至腹神经索（VNC）及其他邻近器官，形成GFP阳性侵袭性肿瘤。 &gt;10日龄幼虫（来源于侵袭性肿瘤基因型）中，可观察到GFP阳性、从原发部位脱落并漂浮于幼虫体腔内的继发性肿瘤。此外，携带良性肿瘤的幼虫能够按时化蛹，而携带侵袭性肿瘤的幼虫则表现为幼虫期延长，无法正常化蛹。这些携带侵袭性肿瘤的幼虫可被明显识别为“巨型幼虫”，其体腔内充满液体。
<img alt="荧光显微镜；果蝇头部复合体解剖；脑与神经成像；示意图。" fo:cont...

激活的癌基因（如 RASV12）与细胞极性基因（如 scribbled）的突变之间的协同作用，可导致果蝇（Drosophila）体内肿瘤的生长，且肿瘤细胞还表现出侵袭性行为。本文介绍了一种诱导和观察良性及侵袭性肿瘤的简单实验方案。

果蝇在过去的几十年中揭示了我们对正常发育和疾病遗传基础的理解，如今它仍在继续……

本实验的总体目标是在果蝇中诱导良性及侵袭性肿瘤，随后通过解剖幼虫头部复合体来观察这些肿瘤。首先，将所需品系进行杂交，分离出携带侵袭性或良性肿瘤的幼虫后代。下一步是解剖选定的幼虫。首先将头部复合体切至其三分之二深度，固定后将其翻转外翻以暴露头部复合体。接着清除脂肪体和肠道组织，随后剪断仍附着于腹神经索和幼虫表皮上的任何神经。最后一步是对头部复合体进行成像，或将其固定以用于后续实验应用。最终，通过荧光显微镜观察，结果可以显示表达GFP标记的侵袭性或良性肿瘤。该方法有助于解答癌症生物学中的一些关键问题。例如，您可能希望了解在完整生物体中哪些基因能够抑制肿瘤的进展。在获得所需的遗传品系后，准备测试品系的起始培养物，同时为待测品系准备起始培养物。将测试品系的10只雌性处女蝇与待测品系的10只雄性个体进行杂交。将果蝇在25摄氏度下培养24至48小时，使其交配并产卵，然后将其转移至新的培养管中以产生更多子代。观察杂交管中的卵和一龄幼虫，并建立新的杂交组合。如果收集的培养瓶中卵沉积不良。若收集的培养瓶开始变干，可加入三到四滴经高压灭菌的蒸馏水以保持培养物湿润。持续观察培养瓶直至幼虫开始游走。三龄幼虫已出现。随后在荧光体视显微镜下继续对其进行观察。采用相同方法，通过所列品系在培养第五或第六天收集携带侵袭性肿瘤的果蝇，良性肿瘤培养物中将可获得游走期三龄幼虫。然而，从侵袭性肿瘤培养物中获取它们之前，要等到第10天。收集三龄幼虫时，用蒸馏水润湿一支细毛刷，将幼虫从离心管壁上轻轻刮下。将幼虫放入含有冷的1×PBS的凹玻片中，然后使用湿润的毛刷进行操作。刮除其表皮上的任何食物残留物。如需短暂固定，将幼虫置于 -20 摄氏度的培养皿中 30 分钟。如需更长时间的固定，将幼虫放入含有仅带乙醚棉签的培养小瓶中。将培养小瓶塞住，静置 40 分钟。接着，将固定的幼虫转移至载玻片上。滴加一滴轻度卤代碳油，并用盖玻片覆盖幼虫。现在，在荧光体视显微镜下观察幼虫。对于GFP表达，选择发出绿色荧光的幼虫并进行解剖。携带良性肿瘤的幼虫在其头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。侵袭性肿瘤还会在幼虫头部复合体的前部区域发出绿色荧光。如果可能，务必对发荧光的肿瘤进行拍照记录。由于幼虫半透明的表皮使得观察肿瘤迁移范围变得困难，因此我们必须通过解剖来观察肿瘤。首先使用镊子将带有肿瘤的新生幼虫转移至含有1毫升冷的1×PBS的解剖皿孔中。用一对镊子夹住幼虫，位置大约在距其前端三分之二处，以固定幼虫。用另一对镊子巧妙地分离幼虫的后三分之一部分并弃去。然后松开前三分之二部分。随着幼虫体内的压力释放，其内容物将从体腔中渗出。用镊子去除从体腔中渗出的组织。接着，夹住幼虫的口钩并将其推入幼虫表皮内。用另一把镊子将幼虫彻底翻转内向外。现在用镊子轻柔而小心地移除脂肪体、唾液腺、肠道、翅盘复合体以及任何气管。此时，头部复合体可能已可见，其附着于口钩上。脑半球和腹神经索仍通过从腹神经索发出的神经与幼虫表皮相连。用镊子轻轻打断这些连接，然后去除多余的脂肪体或其他组织，使头部复合体清晰可见。该复合体通过口钩附着于幼虫表皮上。将头部复合体保持原样，以便在可视化之前进行进一步处理。否则，若要直接观察头部复合体，可将其从表皮上分离，并置于一滴基于甘油的封片剂（如Vector Shield）中。采用所述方案，可在眼部诱导产生肿瘤。在眼盘中，良性肿瘤仍局限于其诱导产生的眼盘部位。请注意，GFP标记的组织未迁移至邻近器官，例如在第10天幼虫中，头部复合体中的腹神经索未见侵袭性肿瘤组织的过度生长。此外，如红色箭头所示，肿瘤已侵入腹神经索和口钩等邻近器官。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过遗传学方法诱导良性及侵袭性肿瘤，并通过解剖头胸部复合体内部肛门胃组织来观察这些肿瘤。

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科研

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Medicine

医学

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一种用于头部分节复合体中良性和侵袭性肿瘤遗传诱导与可视化的方法黑腹果蝇

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