一种用于头部分节复合体中良性和侵袭性肿瘤遗传诱导与可视化的方法 黑腹果蝇

本实验的总体目标是在果蝇中诱导良性及侵袭性肿瘤，随后通过解剖幼虫头部复合体来观察这些肿瘤。首先需设置所需品系之间的杂交，分离出携带侵袭性或良性肿瘤的幼虫后代。下一步是对选定的幼虫进行解剖。

首先将头部复合体切至其三分之二深度，固定后将其翻转外翻以暴露头部复合体。接着清除脂肪体和肠道组织，随后剪断仍连接于腹神经索和幼虫表皮的神经。最后一步是对头部复合体进行成像，或将其固定以用于后续实验应用。

最终，通过荧光显微镜观察，结果可以显示表达GFP标记的侵袭性或良性肿瘤。该方法有助于解答癌症生物学中的一些关键问题。例如，您可能希望了解在完整生物体中哪些基因能够抑制肿瘤的进展。

在获得所需的遗传品系后，准备测试品系的起始培养物，同时为待测品系准备起始培养物。将测试品系的10只雌性处女蝇与待测品系的10只雄性个体进行杂交。

将果蝇在25摄氏度条件下培养24至48小时，使其交配并产卵，然后将其转移至新的培养瓶中以产生更多子代。观察杂交培养瓶中的卵和一龄幼虫。建立新的杂交组合。

如果收集的试管中卵沉积情况不佳，或收集的试管开始变干，可加入三到四滴经高压灭菌的蒸馏水以保持培养物湿润。持续观察试管直至幼虫开始游走。

三龄幼虫已出现。随后在荧光体视显微镜下继续对其进行观察。采用相同方法，通过所列品系在培养第五或第六天收集携带侵袭性肿瘤的果蝇，良性肿瘤培养物中将获得游走期三龄幼虫。

然而，从侵袭性肿瘤培养物中获取这些材料要到第10天才能实现。收集三龄幼虫时，用蒸馏水润湿一支细毛刷，轻轻刮取小瓶壁上的幼虫。将幼虫放入含有冷的1×PBS的凹玻片中，然后使用湿润的毛刷进行操作。

刮除其表皮上的任何食物残留物。如需短暂固定，将幼虫置于 -20 摄氏度的培养皿中 30 分钟。如需更长时间的固定，将幼虫放入含有麻醉棉的培养管中。

将培养管塞好，静置40分钟。随后，将固定的幼虫转移至载玻片上，滴加一滴轻度卤代碳油，盖上盖玻片。

现在，在荧光体视显微镜下观察幼虫。对于 GFP 表达，选择发出绿色荧光的幼虫并进行解剖。携带良性肿瘤的幼虫在其头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。

侵袭性肿瘤还会在幼虫头部复合体的前部区域发出绿色荧光。如果可能，务必对发荧光的肿瘤进行拍照记录。由于幼虫半透明的表皮使得观察肿瘤迁移范围变得困难，因此我们必须通过解剖来观察肿瘤。

首先使用镊子将带有肿瘤的新生幼虫转移至含有1毫升冷的1×PBS的解剖皿孔中。用一对镊子夹住幼虫，位置大约在距前端三分之二处，以固定幼虫。

用另一对镊子巧妙地分离幼虫的后三分之一部分并弃去。然后松开前三分之二部分。随着幼虫体内的压力释放，其内容物将从体腔中渗出。

用镊子去除从体腔中渗出的组织。接着，夹住幼虫的口钩并将其推入幼虫表皮内。用另一把镊子将幼虫彻底翻转内向外。

现在用镊子轻柔而仔细地移除脂肪体、唾液腺、肠道、翅盘复合体以及任何气管组织。此时，头部复合体可能已显露，其与口钩相连。脑半球和腹神经索（VNC）仍通过从腹神经索发出的神经与幼虫表皮相连。

用镊子轻轻打断这些连接，然后去除多余的脂肪体或其他组织，使头部复合体清晰可见。该复合体通过口钩附着于幼虫表皮上。

将头部复合体保持原样，以便在可视化之前进行进一步处理。否则，若需直接观察头部复合体，可将其从表皮上分离，并置于一滴基于甘油的封片剂（如Vector Shield）中。采用所述方案，可在眼部诱导产生肿瘤。

在眼原基处，良性肿瘤仍局限于其诱导产生的部位。请注意，GFP标记的组织未迁移至邻近器官，例如在第10天幼虫中，头部复合体内的腹神经索未见侵袭性肿瘤组织的过度生长。此外，如红色箭头所示，肿瘤已侵入腹神经索和口钩等邻近器官。

观看本视频后，您应能充分了解如何通过遗传学方法诱导良性和侵袭性肿瘤，并通过解剖头胸部复合体（cephalic complex）内肛胃结构来观察这些肿瘤。