建立一个 体外 用于研究细胞内行为的系统 白色念珠菌 在人THP-1巨噬细胞中

本实验的总体目标是建立一种体外培养模型系统，用于研究人类机会性致病真菌白色念珠菌在源自人单核细胞系TP1的巨噬细胞内的胞内行为。为实现这一目标，首先用佛波酯处理TP1单核细胞，使其分化为巨噬细胞。

随后，将THP-1巨噬细胞与白色念珠菌GTA细胞共孵育，感染后2小时，通过PBS洗涤去除未被吞噬的白色念珠菌GTA细胞，并通过裂解感染的巨噬细胞回收细胞内真菌，用于后续研究。该方案可用于评估巨噬细胞对白色念珠菌GTA细胞的吞噬情况，以及白色念珠菌GTA感染后THP-1巨噬细胞的吞噬体成熟过程和细胞因子反应。

此外，该方案可扩展用于以半高通量方式筛选白色念珠菌协作突变体文库，以分析其在TSP1巨噬细胞中生存特性的改变。本方案的主要优势在于成本相对较低、高度可重复，并且易于适用于不同的免疫细胞以及真菌病原体。在开始实验前两天，于第一天将THP-1单核细胞置于80% CO₂环境中，取出培养皿，缓慢轻柔地将所有贴壁细胞悬浮起来。

将DHP单核细胞悬液转移至15 ml离心管中。室温下以1000 RPM离心4分钟。将上清液弃至废液容器中，向管内加入5 ml预热的API培养基，重悬细胞。通过轻柔吹打培养基3至4次，重新悬浮THV单核细胞沉淀。

取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞密度，并将细胞密度调整至每毫升100万个细胞。向细胞悬液中加入1 µL浓度为60 µM的PMA储备液，使终浓度为16 nM，并充分混匀。将含有100万个细胞的1 mL细胞悬液分装至24孔组织培养板的每个孔中，然后置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育。

孵育12小时后，弃去旧培养基。每孔加入1 ml预热的RPI培养基，再将培养板孵育12小时。这些细胞将用于后续展示的加拿大感染实验。

采用规范的微生物操作技术，将单个EA菌落接种至含有ML YPD培养基的烧瓶中。将烧瓶置于30 °C培养箱中培养14至16小时，培养结束后取1 mL培养物于4,000 ×g离心5分钟。

弃去上清液，用无菌 PBS 洗涤贝壳三次。弃去洗涤缓冲液后，通过轻柔吹打，将细胞沉淀重悬于 1 ml 无菌 PBS 中。接着，在分光光度计中于 600 纳米处测定细胞悬液的吸光度，并用 PBS 将细胞密度调整至每毫升 200 万个细胞。

取50 µL细胞悬液，用PBS稀释100倍，取100 µL稀释后的菌液涂布于YPD AGA培养基平板上。将平板置于30 °C培养，1至2天后计数YPD平板上出现的菌落数，再乘以相应的稀释倍数，计算0小时的菌落形成单位（CFU）。以此数量的加拿大利什曼原虫（Leishmania donovani）菌落形成单位用于感染巨噬细胞。

在下一步中，向24孔培养板中的巨噬细胞单层加入50 µL加拿大克拉特细胞悬液。轻轻晃动培养板以使细胞均匀分布，并在37°C孵育2小时。孵育结束后，将培养板倒置于容器中弃去培养基，然后沿孔壁小心加入1 mL PBS缓冲液，彻底洗涤各孔，随后弃去缓冲液。

重复此步骤两次。接下来，除第一孔外，向所有其他孔中加入 1 mL RPMI 培养基，可用于在感染后 4、6、12 和 24 小时监测念珠菌在细胞内的复制情况。为在巨噬细胞感染两小时后回收胞内菌，向磷酸盐缓冲液孔中加入 1 mL 无菌水。两分钟后，用 1 mL 移液枪头轻轻刮擦孔内表面，以去除孔中的巨噬细胞碎片。

用宏离心管冲洗孔并收集裂解液。用PBS将microFIT细胞裂解液稀释100倍，并取100微升涂布于YPD AGA培养基上。在30摄氏度下培养平板1至2天，计数菌落形成单位的数量。

将此数值乘以相应的稀释倍数，以计算在感染两小时后被T细胞和巨噬细胞吞噬的白色念珠菌细胞数量。类似地，可在不同时间点测定细胞内白色念珠菌细胞的数量。感染后及细胞内复制情况可通过24小时时的菌落形成单位（CFU）较此处所示两小时时内化CFU的增加来表示。

在一项典型实验中，感染TV1巨噬细胞的犬科gator细胞总数为每4个6 × 10²个。在2小时回收的细胞数量为3.7 × 10⁴个。由此表明，在24小时共孵育期间，e细胞被吞噬的速率为62.66%。

除a细胞外，其他细胞的复制倍数为5.2倍，当细胞内e细胞数量从3.76 × 10⁴增加至1.96 × 10⁵时。在本实验中，可通过表达GFP的E细胞结合共聚焦显微镜评估TER细胞的细胞内复制情况。请按照先前为24孔培养板所述的方案，制备并感染四孔载玻片上的THV和巨噬细胞。

感染后2小时。将玻片倒置放入废液容器中，弃去培养基，然后向玻片的每个腔室加入500 µL PBS。充分冲洗后弃去PBS。

再重复此步骤两次，每次加入 500 µL 3.7% 多聚甲醛以固定细胞。将玻片在室温下孵育 20 分钟后弃去多聚甲醛。每孔加入 500 µL PBS 洗涤一次，随后在 500 µL Triton X 中孵育 5 分钟以通透巨噬细胞，孵育后弃去 Triton X，并用 PBS 洗涤孔板。

使用腔室移除工具和气垫载片小心拆卸腔室载片。在载片的每个区域滴加一滴含有DPI的Vector Shield封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘，然后在共聚焦显微镜下观察细胞。图中显示的是TP1巨噬细胞感染表达野生型canida实验室菌株后的代表性共聚焦图像。从2小时到24小时，细胞内e细胞数量约增加六倍，表明canida实验室菌株在TP1巨噬细胞中发生复制。标签标记突变技术（signature tag mutagenesis）是一种广泛用于鉴定微生物病原体毒力因子的方法，该方法通过独特的寡核苷酸序列标签，同时筛选大量突变株的生长缺陷。

本文介绍了我们用于加拿大文库和突变文库的STM筛选实验方案，该方案包括以下三个步骤。第一步，将96种质粒固定在尼龙膜上，每种质粒均携带一段独特的寡核苷酸序列片段。

第二步中，对包含96种CANIDA ator突变体的文库在THV一型巨噬细胞中进行筛选，以检测其存活特性的改变，随后回收YPD培养基中生长并被巨噬细胞内化的突变体细胞，分别称为输入样本和输出样本。最后，从输入和输出的基因组DNA样本中通过PCR扩增并放射性标记DNA特征标签。将PCR产物杂交至含有独特标签的膜上，对膜上的放射性信号进行定量和分析。

组装96孔12点阵装置时，将一张湿润的尼龙膜置于湿润的吸水滤纸上，拧紧装置的螺丝。先用无菌水冲洗膜，随后用0.4 µmol/L氢氧化钠溶液洗涤。在0.4 mol/L氢氧化钠洗涤后，将PLA bDNA溶液从96孔12块板转移200纳克至点印迹装置相应的孔中。

在紫外交联仪中将转移的血浆BDNA与膜上的两个XXSC交叉结合后，从点样血液装置上取下膜。将膜置于天线预杂交缓冲液中，并在42摄氏度下于UNE瓶中孵育两小时。使用从输入和输出细胞样本中提取的基因组DNA以及针对独特标签侧翼反转区域的引物，通过PCR制备放射性标记探针。

将放射性标记探针在 99 摄氏度下变性 5 分钟，然后迅速置于冰上冷却。将变性后的探针转移至输入和输出瓶中，在 42 摄氏度下孵育 14 至 16 小时。杂交后处理。

按照方案中所述清洗输入和输出膜。将膜从瓶中取出后，空气干燥，并暴露于磷屏成像仪中。两到三小时后，扫描磷屏并获取图像。

在此示例中，展示了两张杂交的膜过滤器，代表对一组包含96个犬科加托里突变体的文库进行筛选，以检测其存活能力的改变。通过对巨噬细胞进行定量，并确定输出膜上每个点与输入膜相比的信号强度比值，结果发现编号为13、26、75和85的标签在输出膜中信号较弱。这些点以红色圈出，反映了四种不同突变体的生长缺陷。

相比之下，输出样本中富集了序列11和81（以绿色突出显示）的突变体。换句话说，通过该筛选发现，在96种突变体组成的文库中，有两种突变体应能增强存活能力，而四种突变体在巨噬细胞中表现出生长缺陷。此类文库筛选所鉴定出的存活表型改变，需通过单个感染实验进行验证。

观看本视频后，您应能够充分理解如何建立体外口腔系统，以研究您感兴趣的真菌病原体的体内生长特征。此外，您还应能够利用该系统开展大规模突变体库筛选。