Name: 建立一个在体外系统来研究细胞内的行为光滑念珠菌在人THP-1巨噬细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 了解如何使用THP-1细胞建立体外模型来研究光滑念珠菌在人巨噬细胞内的行为。该方法可用于评估真菌毒力机制及宿主免疫反应，为真菌致病机理研究提供可靠工具。

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本工作得到了印度政府生物技术部创新青年生物技术奖 BT/BI/12/040/2005 和 BT/PR13289/BRB/10/745/2009 拨款以及海得拉巴DNA指纹与诊断中心核心资金的支持。MNR 和 GB 获得了科学与工业研究委员会提供的初级和高级研究奖学金，用于攻读马尼帕尔大学的博士学位。SB 获得了生物技术部提供的初级和高级研究奖学金，用于攻读马尼帕尔大学的博士学位。

建议在生物安全二级（BSL-2）防护级别的实验室中进行C. glabrata感染实验。
<ol>
	<li>THP-1 巨噬细胞单层的制备。</li>
	<li>C. glabrata 细胞悬液的制备。</li>
	<li>用 C. glabrata 细胞感染 THP-1 巨噬细胞。</li>
	<li>通过菌落形成单位实验测定吞噬率和细胞内复制情况。</li>
	<li>利用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞内复制过程。</li>
</ol>
1. THP-1 巨噬细胞单层的制备
<ol>
	<li>THP-1 是一种人单核细胞系，源自一名患有急性单核细胞白血病的1岁男童的外周血14. THP-1 是一种悬浮细胞系，通常在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养2 在添加了10% FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中。使用佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA，一种佛波酯）处理可诱导THP-1单核细胞终末分化为巨噬细胞。重要的是，PMA处理不影响细胞活力，且分化后的细胞不再分裂。</li>
	<li>种子大约 1.5 x&#160;106 RPMI-1640 完全培养基中 100 mm 培养皿内的 THP-1 单核细胞（RPMI-1640 培养基添加 10% 血清、2 mM 谷氨酰胺和 1x）&#160;抗生素；10 ml/皿），于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 2天。</li>
	<li>当 THP-1 细胞密度达到 8 x 105 细胞/ml，将培养皿转移至细胞培养超净台中，轻轻摇晃以重悬已沉降的细胞。</li>
	<li>用移液器将细胞悬液移出，放入15 ml离心管中&#160;无菌管中以1,000 rpm（130 × g）离心4分钟。弃去上清液，将THP-1细胞沉淀重悬于5 ml&#160;新鲜的、预温的 RPMI-1640 完全培养基。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞悬液稀释至终密度为106 细胞/毫升&#160;用预热的 RPMI-1640 完全培养基</li>
	<li>加入 1 µl 160 mM PMA 储存液（用二甲基亚砜配制的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯溶液）至 10 ml&#160;THP-1 细胞悬液（终浓度 16 nM），充分混匀，分装 1 ml&#160;将细胞悬液加入24孔组织培养板的每孔中，并将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。2 12 小时。</li>
	<li>移除旧培养基，加入 1 ml&#160;预热的 RPMI-1640 完全培养基，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养 12 小时以恢复细胞2.</li>
	<li>在倒置显微镜下观察细胞，以确认悬浮状态的卵圆形THP-1单核细胞已分化为扁平、梭形并贴壁生长的细胞 &#160;巨噬细胞。这些已分化的细胞现已可用于实验 C. glabrata 感染研究。</li>
</ol>
2. C. glabrata&#160;细胞悬液的制备
C. glabrata 野生型菌株Bg2将用于感染THP-1巨噬细胞。C. glabrata 细胞常规在液体YPD（酵母提取物（1%）-蛋白胨（2%）-葡萄糖（2%））培养基中培养。固体YPD培养基则通过在培养基高压灭菌前加入2%琼脂制备而成。
<ol>
	<li>准备C. glabrata培养物时，用无菌一次性接种环从琼脂平板上挑取单个菌落，接种于10 ml&#160;YPD&#160;液体培养基中，在30 °C条件下振荡培养14–16小时（200 rpm）。</li>
	<li>取1 ml上述培养物，在台式微量离心机中以4,000 rpm（1,800 ×g）离心5分钟，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）洗涤细胞三次，并将细胞沉淀重悬于1 ml&#160;PBS中。</li>
	<li>测定C. glabrata细胞悬液的OD600，并用适量无菌PBS稀释，使细胞浓度达到2 × 106个细胞/ml&#160;（OD600 = 0.1）。或者，也可使用血细胞计数板计数酵母细胞，以获得所需细胞密度。</li>
</ol>
3. 用C. glabrata&#160;细胞感染THP-1巨噬细胞
<ol>
	<li>取 50 µl C. glabrata 细胞悬液加入 THP-1 巨噬细胞（每孔接种 106 个细胞于 24 孔培养板中），使感染复数（MOI）为 0.1，并将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。</li>
	<li>为测定活酵母数量，将 50 μl C. glabrata 细胞悬液用无菌 PBS 稀释 100 倍，取 100 μl 涂布于 YPD 固体培养基上。将平板在 30 °C 下孵育 1–2 天，人工计数出现的酵母菌落数量。此后，这些数值将被称为 0 小时&#160;C. glabrata 菌落形成单位（CFUs）。</li>
	<li>THP-1 细胞与 C. glabrata 细胞共培养 2 小时后，将 24 孔组织培养板倒置于储液槽中弃去培养基，并用预热的无菌 PBS 轻柔洗涤三次，以去除未被吞噬的胞外 C. glabrata 细胞。用 PBS 进行轻柔洗涤至关重要，必须彻底清除所有胞外酵母，同时不损伤 THP-1 巨噬细胞单层。</li>
</ol>
通过菌落形成单位实验测定吞噬速率和细胞内复制

<ol>
	<li>裂解 C. glabrata 1 ml 感染的 THP-1 巨噬细胞&#160;无菌 H2O 孵育 2 分钟，轻轻刮擦以去除孔中的巨噬细胞碎片，并将细胞裂解液收集至微量离心管中。显微镜下验证巨噬细胞完全裂解对于回收所有内化酵母至关重要。</li>
	<li>将裂解液用无菌PBS稀释100倍，取100 μl涂布于YPD固体培养基上，30 °C培养平板。</li>
	<li>1-2天后，人工计数数量 C. glabrata 在YPD培养基上出现的菌落，乘以稀释倍数（2小时CFU），并计算吞噬率，即指百分比的吞噬作用 C. glabrata THP-1 巨噬细胞在共孵育 2 小时后吞噬的细胞 &#160;使用以下公式。 
	                       % 吞噬作用 = [（2 h 时的菌落形成单位）/（0 h 时的菌落形成单位）] × 100</li>
	<li>测量细胞内复制速率 C. glabrata 在THP-1巨噬细胞中，于感染后不同时间点收集细胞内酵母 即.&#160;4、6、8、10、12 和 24 小时，通过重复步骤 3.3–4.3。</li>
	<li>计算存活/复制倍数 C. glabrata 通过将任意时间点的总菌落形成单位（CFUs）除以2小时时间点的菌落形成单位（即被吞噬的酵母）来计算THP-1巨噬细胞内的菌落形成单位。</li>
</ol>
5. 使用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞内复制
<ol>
	<li>按照第1节所述步骤，接种经PMA处理的5 x 105 将THP-1细胞接种至两片四孔细胞培养板的每孔中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 12 小时。</li>
	<li>更换为预热的RPMI-1640完全培养基，使细胞从PMA处理中恢复12小时。</li>
	<li>制备GFP（绿色荧光蛋白）标记的 C. glabrata 细胞悬液，如第2节所述，并以感染复数（MOI）为1的条件感染THP-1巨噬细胞 C. glabrata 表达GFP的菌株不可用时，可用FITC（异硫氰酸荧光素）标记酵母细胞&#160; 可用于监测感染后的早期事件 即.&#160;吞噬率及2小时时相的吞噬溶酶体成熟情况</li>
	<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育载玻片 2 小时2，小心倒置以弃去培养基，并用无菌预热的PBS洗涤3次。</li>
	<li>向一张载玻片的每个腔室中加入 500 µl 预热的 RPMI-1640 完全培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 22 小时。</li>
	<li>固定2小时 C. glabrata-感染的 THP-1 巨噬细胞中，向另一张载玻片的每个孔中加入 500 µl 用 PBS 配制的 3.7% 多聚甲醛，在室温避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗载玻片三次，加入 500 µl Triton-X（0.7%），室温避光孵育 5 分钟.</li>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片 3 次，从培养载玻片上取下腔室，并在避光条件下静置干燥 3–5 分钟。</li>
	<li>使用含DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield封片剂，小心地将盖玻片封于载玻片上，避免产生气泡。用擦镜纸轻轻吸去多余液体，并用指甲油密封盖玻片边缘。将载玻片置于4°C避光保存，直至使用。</li>
	<li>重复步骤 5.4 和 5.6–5.9，处理感染后 24 小时的 THP-1 细胞。</li>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像（60倍油镜，DAPI 和 GFP 染色的激发波长分别为 405 nm 和 488 nm）。</li>
</ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
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<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

先天免疫系统在控制机会性真菌感染中发挥重要作用。巨噬细胞通过吞噬和杀灭真菌病原体参与抗真菌防御。因此，阐明真菌存活所需或拮抗巨噬细胞抗菌功能的相关因子，将有助于深入理解真菌的毒力策略。在此背景下，我们建立了一种 体外 使用源自人单核细胞系 THP-1 的巨噬细胞构建的细胞培养模型系统，用于表征人机会性真菌病原体的相互作用 C. glabrata 与宿主吞噬细胞相互作用。尽管该THP-1巨噬细胞模型系统已成功用于鉴定 C. glabrata 存活率降低且在小鼠系统性念珠菌病模型中表现出毒力减弱的突变株8该系统的一个可能局限性在于其孤立的环境，因此所得结果可能并不总是适用于复杂的哺乳动物宿主免疫系统。此外，与活细胞成像方法不同，该系统无法计入那些未被THP1-巨噬细胞吞噬或在吞噬过程中被杀灭的酵母细胞。
本实验方案的重要性在于其操作简便、可重复性强且具有可扩展性。该方法可缩小至96孔板，也可放大至150 cm2的组织培养瓶。本方案中的关键步骤包括选择合适的感染复数（MOI）、进行充分的PB...

念珠菌属是免疫功能低下患者发生危及生命的侵袭性真菌感染的首要原因1。Candida glabrata是一种新出现的医院内病原体，根据地理区域的不同，它是重症监护病房患者中第二或第三常见分离的念珠菌种1-3。从系统发育关系来看，C. glabrata是一种单倍体出芽酵母，与非致病性的模式酵母Saccharomyces cerevisiae的亲缘关系比包括C. albicans在内的致病性念珠菌spp.更为接近4。与此一致的是，C. glabrata缺乏一些关键的真菌毒力特征，包括交配能力、分泌性蛋白水解活性以及形态可塑性4-5。
尽管C. glabrata不形成菌丝，但它能够在小鼠和人类巨噬细胞内存活并复制6-8，这表明其已进化出独特的致病机制。目前关于C. glabrata如何在营养匮乏的巨噬细胞内环境中存活，并抵抗宿主免疫细胞所启动的氧化性和非氧化性宿主反应的策略，相关信息仍然有限5。建立一个合适的巨噬细胞模型系统，是通过功能基因组学和蛋白质组学方法阐明C. glabrata与宿主吞噬细胞相互作用的前提。既往研究曾使用人源外周血单个核细胞（PBMCs）和小鼠源骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）来研究C. glabrata与宿主免疫细胞的相互作用7,9。然而，PBMCs和BMDMs的获取困难、寿命有限以及不同哺乳动物供体之间的内在差异，限制了这些细胞作为通用模型系统的应用。
在此，我们介绍一种建立 体外 研究细胞内行为的系统 C. glabrata 人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞中的细胞。本方案的总体目标是建立一种简单、经济、快速且可重复的细胞培养模型系统，可方便地进行操作，以研究宿主与真菌病原体相互作用的不同方面。
THP-1 细胞此前已被用于解析宿主免疫系统对多种病原体（包括细菌、病毒和真菌）的免疫应答10-12。单核细胞样 THP-1 细胞易于培养，经佛波酯处理后可分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞模拟人源单核细胞分化的巨噬细胞，并表达相应的巨噬细胞标志物13。THP-1 巨噬细胞模型系统的主要优势在于操作简便，且无需复杂的仪器设备。
本文所述方案易于调整，可用于研究其他人类真菌病原体与宿主免疫细胞之间的相互作用。当前流程还可结合高通量突变体筛选，用于鉴定目标病原体的毒力因子。该概念验证的实例是成功利用THP-1细胞培养模型系统，鉴定出一组56个在人类巨噬细胞中维持C. glabrata存活所必需的基因8。

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>人急性单核细胞白血病细胞系</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>用于维持 THP-1 细胞生长</td></tr><tr><td>佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>注意：具有危害性</td></tr><tr><td>YPD&amp;nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>用于培养&lt;em&gt;Candida glabrata&lt;/em&gt;细胞</td></tr><tr><td>甲醛（Formaldehyde）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>用于固定&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;感染的 THP-1 巨噬细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td>洗涤用缓冲液（137 mM NaCl，10 mM 磷酸盐，2.7 mM KCl，&amp;nbsp;pH 7.4）</td></tr><tr><td>氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>洗涤用缓冲液（3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，20×浓度）</td></tr><tr><td>预杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td>杂交用缓冲液（50% 甲酰胺，5× Denhardt&amp;rsquo;s 溶液，5× SSC，1% SDS）</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>用于共聚焦显微镜载片封片</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P 标记的 &amp;alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>用于特征标签的放射性标记</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>用于培养 THP-1 细胞</td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>用于在 THP-1 巨噬细胞中进行&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;感染实验</td></tr><tr><td>4 孔组织培养处理玻璃腔室载片</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>用于成像&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;感染的 THP-1 巨噬细胞</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Rohem India</td><td></td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>用于离心微管中的细胞</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>用于离心 15 ml 管中的细胞</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>用于监测酵母细胞的吸光度</td></tr><tr><td>平板培养箱</td><td>Labtech</td><td>Refrigerated</td><td>用于培养&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;细胞</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>用于培养&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;细胞</td></tr><tr><td>水套式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;培养箱</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma series 2</td><td>用于培养 THP-1 细胞</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>用于观察&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;感染的 THP-1 巨噬细胞</td></tr><tr><td>复式显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>用于观察&lt;em&gt;C. glabrata&lt;/em&gt;细胞和 THP-1 巨噬细胞</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>DNA Engine</td><td>用于从输入和输出基因组 DNA 中扩增独特标签</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>用于杂交&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷屏成像仪（PhosphorImager）</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>用于扫描杂交膜</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>用于放射性标记特征标签的变性</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>用于观察琼脂糖凝胶中溴化乙锭染色的 DNA</td></tr></tbody></table>

建立一个 体外 用于研究细胞内行为的系统 白色念珠菌 在人thp-1巨噬细胞中

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

一种细胞培养模型系统，若能高度模拟宿主的环境条件，则可作为研究微生物病原体感染特定步骤的廉价、可重复且易于操作的动物模型替代方案。人单核细胞系 THP-1 在佛波酯处理后可分化为巨噬细胞，此前已被广泛用于研究多种胞内病原体的致病机制，包括 结核分枝杆菌 在此，我们讨论一种实施的方案 体外 使用 THP-1 巨噬细胞建立细胞培养模型系统以阐明一种机会性人类酵母病原体的相互作用 白色念珠菌 与宿主吞噬细胞共培养。该模型系统操作简便、快速，适用于高通量突变体筛选，且无需复杂仪器设备。典型的THP-1巨噬细胞感染实验约需24小时，随后需额外24–48小时使回收的胞内酵母在富营养培养基上生长，以进行基于菌落形成单位的活力分析。与其他 体外 模型系统的一个可能局限性在于，难以将所获得的结果外推至人体宿主内高度复杂的免疫细胞调控网络。然而，尽管存在这一局限，本实验方案对于阐明真菌病原体可能采用的逃逸或对抗宿主抗菌反应并在免疫细胞内营养匮乏环境中存活、适应及增殖的策略仍具有重要价值。

对经PMA处理的THP-1巨噬细胞感染分析显示，与C. glabrata野生型（wt）细胞共孵育2小时后，巨噬细胞对wt细胞的吞噬率为55–65%。此外，C. glabrata细胞能够在THP-1巨噬细胞中抵抗杀伤作用，并在与THP-1巨噬细胞共培养24小时后，菌落形成单位（CFU）显著增加5至7倍8。通过共聚焦荧光显微镜也验证了携带GFP表达质粒的野生型细胞在THP-1巨噬细胞内的胞内复制：在24小时期间，每个THP-1巨噬细胞内的酵母细胞数量从一至两个增加至七至十二个（图1）。
<img alt="荧光显微镜，GFP-DAPI融合图像，2小时和24小时，细胞定位分析，示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50625/50625fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/5...

本文概述了一种建立 体外 用于研究兼性胞内人类真菌病原体相互作用的细胞培养模型系统 Candida glabrata 与人类巨噬细胞共同作用，这将成为推进我们对真菌毒力机制认知的有力工具。

建立一个 体外 用于研究细胞内行为的系统 白色念珠菌 在人THP-1巨噬细胞中

一种细胞培养模型系统，若能高度模拟宿主的环境条件，则可作为一种经济、可重复且易于操控的……

本实验的总体目标是建立一种体外培养模型系统，用于研究人类机会性致病真菌白色念珠菌在源自人单核细胞系TP1的巨噬细胞内的胞内行为。为实现这一目标，首先用佛波酯处理TP1单核细胞，使其分化为巨噬细胞。随后，将THP-1巨噬细胞与白色念珠菌GTA细胞共孵育，感染后2小时，通过PBS洗涤去除未被吞噬的白色念珠菌GTA细胞，并通过裂解感染的巨噬细胞回收细胞内真菌，用于后续研究。该方案可用于评估巨噬细胞对白色念珠菌GTA细胞的吞噬情况，以及白色念珠菌GTA感染后THP-1巨噬细胞的吞噬体成熟过程和细胞因子反应。此外，该方案可扩展用于以半高通量方式筛选白色念珠菌协作突变体文库，以分析其在TSP1巨噬细胞中生存特性的改变。本方案的主要优势在于成本相对较低、高度可重复，并且易于适用于不同的免疫细胞以及真菌病原体。在开始实验前两天，于第一天将THP-1单核细胞置于80% CO₂环境中，取出培养皿，缓慢轻柔地将所有贴壁细胞悬浮起来。将DHP单核细胞悬液转移至15 ml离心管中。室温下以1000 RPM离心4分钟。将上清液弃至废液容器中，向管内加入5 ml预热的API培养基，重悬细胞。通过轻柔吹打培养基3至4次，重新悬浮THV单核细胞沉淀。取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞密度，并将细胞密度调整至每毫升100万个细胞。向细胞悬液中加入1 µL浓度为60 µM的PMA储备液，使终浓度为16 nM，并充分混匀。将含有100万个细胞的1 mL细胞悬液分装至24孔组织培养板的每个孔中，然后置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育。孵育12小时后，弃去旧培养基。每孔加入1 ml预热的RPI培养基，再将培养板孵育12小时。这些细胞将用于后续展示的加拿大感染实验。采用规范的微生物操作技术，将单个EA菌落接种至含有ML YPD培养基的烧瓶中。将烧瓶置于30 °C培养箱中培养14至16小时，培养结束后取1 mL培养物于4,000 ×g离心5分钟。弃去上清液，用无菌 PBS 洗涤贝壳三次。弃去洗涤缓冲液后，通过轻柔吹打，将细胞沉淀重悬于 1 ml 无菌 PBS 中。接着，在分光光度计中于 600 纳米处测定细胞悬液的吸光度，并用 PBS 将细胞密度调整至每毫升 200 万个细胞。取50 µL细胞悬液，用PBS稀释100倍，取100 µL稀释后的菌液涂布于YPD AGA培养基平板上。将平板置于30 °C培养，1至2天后计数YPD平板上出现的菌落数，再乘以相应的稀释倍数，计算0小时的菌落形成单位（CFU）。以此数量的加拿大利什曼原虫（Leishmania donovani）菌落形成单位用于感染巨噬细胞。在下一步中，向24孔培养板中的巨噬细胞单层加入50 µL加拿大克拉特细胞悬液。轻轻晃动培养板以使细胞均匀分布，并在37°C孵育2小时。孵育结束后，将培养板倒置于容器中弃去培养基，然后沿孔壁小心加入1 mL PBS缓冲液，彻底洗涤各孔，随后弃去缓冲液。重复此步骤两次。接下来，除第一孔外，向所有其他孔中加入 1 mL RPMI 培养基，可用于在感染后 4、6、12 和 24 小时监测念珠菌在细胞内的复制情况。为在巨噬细胞感染两小时后回收胞内菌，向磷酸盐缓冲液孔中加入 1 mL 无菌水。两分钟后，用 1 mL 移液枪头轻轻刮擦孔内表面，以去除孔中的巨噬细胞碎片。用宏离心管冲洗孔并收集裂解液。用PBS将microFIT细胞裂解液稀释100倍，并取100微升涂布于YPD AGA培养基上。在30摄氏度下培养平板1至2天，计数菌落形成单位的数量。将此数值乘以相应的稀释倍数，以计算在感染两小时后被T细胞和巨噬细胞吞噬的白色念珠菌细胞数量。类似地，可在不同时间点测定细胞内白色念珠菌细胞的数量。感染后及细胞内复制情况可通过24小时时的菌落形成单位（CFU）较此处所示两小时时内化CFU的增加来表示。在一项典型实验中，感染TV1巨噬细胞的犬科gator细胞总数为每4个6 × 10²个。在2小时回收的细胞数量为3.7 × 10⁴个。由此表明，在24小时共孵育期间，e细胞被吞噬的速率为62.66%。除a细胞外，其他细胞的复制倍数为5.2倍，当细胞内e细胞数量从3.76 × 10⁴增加至1.96 × 10⁵时。在本实验中，可通过表达GFP的E细胞结合共聚焦显微镜评估TER细胞的细胞内复制情况。请按照先前为24孔培养板所述的方案，制备并感染四孔载玻片上的THV和巨噬细胞。感染后2小时。将玻片倒置放入废液容器中，弃去培养基，然后向玻片的每个腔室加入500 µL PBS。充分冲洗后弃去PBS。再重复此步骤两次，每次加入 500 µL 3.7% 多聚甲醛以固定细胞。将玻片在室温下孵育 20 分钟后弃去多聚甲醛。每孔加入 500 µL PBS 洗涤一次，随后在 500 µL Triton X 中孵育 5 分钟以通透巨噬细胞，孵育后弃去 Triton X，并用 PBS 洗涤孔板。使用腔室移除工具和气垫载片小心拆卸腔室载片。在载片的每个区域滴加一滴含有DPI的Vector Shield封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘，然后在共聚焦显微镜下观察细胞。图中显示的是TP1巨噬细胞感染表达野生型canida实验室菌株后的代表性共聚焦图像。从2小时到24小时，细胞内e细胞数量约增加六倍，表明canida实验室菌株在TP1巨噬细胞中发生复制。标签标记突变技术（signature tag mutagenesis）是一种广泛用于鉴定微生物病原体毒力因子的方法，该方法通过独特的寡核苷酸序列标签，同时筛选大量突变株的生长缺陷。本文介绍了我们用于加拿大文库和突变文库的STM筛选实验方案，该方案包括以下三个步骤。第一步，将96种质粒固定在尼龙膜上，每种质粒均携带一段独特的寡核苷酸序列片段。第二步中，对包含96种CANIDA ator突变体的文库在THV一型巨噬细胞中进行筛选，以检测其存活特性的改变，随后回收YPD培养基中生长并被巨噬细胞内化的突变体细胞，分别称为输入样本和输出样本。最后，从输入和输出的基因组DNA样本中通过PCR扩增并放射性标记DNA特征标签。将PCR产物杂交至含有独特标签的膜上，对膜上的放射性信号进行定量和分析。组装96孔12点阵装置时，将一张湿润的尼龙膜置于湿润的吸水滤纸上，拧紧装置的螺丝。先用无菌水冲洗膜，随后用0.4 µmol/L氢氧化钠溶液洗涤。在0.4 mol/L氢氧化钠洗涤后，将PLA bDNA溶液从96孔12块板转移200纳克至点印迹装置相应的孔中。在紫外交联仪中将转移的血浆BDNA与膜上的两个XXSC交叉结合后，从点样血液装置上取下膜。将膜置于天线预杂交缓冲液中，并在42摄氏度下于UNE瓶中孵育两小时。使用从输入和输出细胞样本中提取的基因组DNA以及针对独特标签侧翼反转区域的引物，通过PCR制备放射性标记探针。将放射性标记探针在 99 摄氏度下变性 5 分钟，然后迅速置于冰上冷却。将变性后的探针转移至输入和输出瓶中，在 42 摄氏度下孵育 14 至 16 小时。杂交后处理。按照方案中所述清洗输入和输出膜。将膜从瓶中取出后，空气干燥，并暴露于磷屏成像仪中。两到三小时后，扫描磷屏并获取图像。在此示例中，展示了两张杂交的膜过滤器，代表对一组包含96个犬科加托里突变体的文库进行筛选，以检测其存活能力的改变。通过对巨噬细胞进行定量，并确定输出膜上每个点与输入膜相比的信号强度比值，结果发现编号为13、26、75和85的标签在输出膜中信号较弱。这些点以红色圈出，反映了四种不同突变体的生长缺陷。相比之下，输出样本中富集了序列11和81（以绿色突出显示）的突变体。换句话说，通过该筛选发现，在96种突变体组成的文库中，有两种突变体应能增强存活能力，而四种突变体在巨噬细胞中表现出生长缺陷。此类文库筛选所鉴定出的存活表型改变，需通过单个感染实验进行验证。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立体外口腔系统，以研究您感兴趣的真菌病原体的体内生长特征。此外，您还应能够利用该系统开展大规模突变体库筛选。

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