微藻中脂肪酸含量与组成的分析

本实验的总体目标是测定微藻中的总脂肪酸含量及其组成。首先制备含有已知量冻干微藻生物量的样品，以实现这一目标。第二步是破坏微藻生物量。

接下来，提取并分离脂溶性组分。最后一步是将 ACell 脂质转酯化为脂肪酸甲酯。最终通过气相色谱法对脂肪酸进行定量分析。

与现有的三酸甘油酯测定等方法相比，该技术的主要优势在于其具有很高的准确性，并且能够特异性地测定所有脂肪酸及其他所有亲脂性组分。本实验操作将由本实验室的技术员 NDI Afer 进行演示。在开始此操作之前，需按照所列参考文献中的方法，测定培养液中藻类干重浓度，单位为克每升。转移含有5至10毫克藻类干重的培养液体积至玻璃离心管中。

根据先前测定的生物量浓度，计算所转移生物量的精确数量，将样品在1200 ×g 条件下离心五分钟。弃去部分上清液，管中保留约0.25 毫升。接下来，通过轻轻吹打使藻类颗粒在残留的上清液中重新悬浮，然后将细胞混合物转移至珠磨管中。

使用200微升移液器，用大约±0.15毫升的Milli-Q水冲洗离心管和移液器吸头，并将液体转移至珠磨管中。以最大转速对珠磨管离心1分钟，确保管底无残留气泡。操作完成后，按以下步骤对管中的样品进行冻干处理。

将三磷酸五氨（trip Penta Deano）配制成50毫克每升的溶液，氯仿与甲醇的强化体积比为指定比例。使用正向置换移液器，向珠磨管中加入1毫升三脚架（tripod）溶液。检查珠磨管盖内是否有残留微珠，否则会导致珠磨管泄漏。

以2,500 RPM的转速在珠磨管中搅拌八次，每次60秒，每次搅拌之间间隔122秒。随后，将珠磨管中含珠的溶液转移至一支洁净、耐热的15毫升玻璃离心管中，该离心管配有聚四氟乙烯（Teflon）衬垫螺口盖。用1毫升三脚架溶液冲洗珠磨管，并将洗涤液转移至玻璃离心管中。

重复两次。将样品涡旋振荡五秒钟，然后超声处理十分钟。超声处理后，向离心管中加入2.5毫升含有50毫摩尔Tris、1摩尔氯化钠的pH为7的milli cube水溶液。

样品经涡旋并再次超声处理后，以1200 ×g离心5分钟。离心结束后，使用玻璃移液管小心地将下层氯仿相转移至一支洁净的玻璃试管中，再用1毫升氯仿重复提取一次。提取完成后，用玻璃移液管收集氯仿相，并与第一次的氯仿组分合并。

使用氮气流吹干氯仿，得到干燥的提取脂质。接着，向含有干燥提取脂质的试管中加入3 mL含5%硫酸的甲醇溶液，并 tightly 封闭试管。涡旋振荡样品5秒。

将样品在70摄氏度的金属浴中孵育三小时。孵育过程中定期检查样品是否沸腾，并在每次检查后对离心管进行涡旋振荡。待样品冷却至室温后，向离心管中加入3 mL超纯水和3 mL正己烷，随后进行涡旋混匀。

使用试管旋转仪将样品振荡15分钟。从试管旋转仪中取出样品后，在1200 G条件下离心5分钟。用玻璃移液管收集2毫升上层己烷相，并转移至一支新的玻璃试管中。为洗涤收集的己烷相，向玻璃试管中加入2毫升超纯水。

然后将样品涡旋振荡5秒，并以1200 ×g离心5分钟。使用玻璃巴斯德吸管，从玻璃管中转移己烷相至气相色谱小瓶。然后盖上瓶盖并拧紧，以防止溶剂挥发。

将样品瓶放入气相色谱仪的自动进样器中。最后，使用新的色谱柱，在总流速为 20 毫升/分钟、进样体积为 1 微升的条件下运行样品。有关色谱柱参数和色谱条件，请参见文本方案。

通过此过程获得的典型色谱图如图所示。脂肪酸甲酯在气相色谱柱中根据其链长和饱和度进行分离，本方案中较短链长及更高饱和度的脂肪酸具有更短的保留时间。所使用的气相色谱柱及实验方案不旨在分离脂肪酸异构体，但通过采用不同的气相色谱柱和实验方案可实现该目的。

此处展示了在氮充足和氮缺乏条件下 C Desus UEX 3 93 的脂肪酸含量和组成。在氮充足和氮缺乏的培养条件下，总脂肪酸含量分别为 8.6 ± 0.5% 和 44.7 ± 1.7%。这些结果表明，脂肪酸的组成和含量受氮饥饿的影响显著。

在ESBL中，棕榈酸和油酸是两种最丰富的脂肪酸。有关计算脂肪酸含量和组成的详细信息，请参见文本方案。此处展示了Odum Trico UEX 6 4 0在氮充足和氮缺乏条件下的脂肪酸含量和组成。

与斜生栅藻类似，P. tricornutum 的脂肪酸含量和组成受氮饥饿影响显著。在氮充足和氮缺乏条件下，总脂肪酸含量分别为 11.7 ± 0.9% 和 30.5 ± 1.1%。P. tricornutum 还能产生大量高度不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、戊烯酸。

此外，该方法还可检测超长链脂肪酸，如木质酸。通过在脂质提取和转酯化步骤之间增加脂质凝块分离步骤，可进一步了解微小低密度脂蛋白（micro LG）的脂质类别组成，具体操作详见方案文本中的参考文献。