脂肪酸组分和含量微藻分析
October 1st, 2013
一种用于脂肪酸含量和组成在微藻基于机械破碎细胞，溶剂为基础的脂质提取，酯交换，以及量化和鉴定用气相色谱法的脂肪酸的测定方法进行说明。一个tripentadecanoin内标是用来弥补提取和不完整的酯交换过程中可能发生的损失。
该程序的总体目标是测量微藻中的总脂肪酸含量和组成。这是通过首先制备含有已知量冻干藻类生物量的样品来完成的。第二步是破坏微藻生物量。
接下来，提取和分离亲脂性成分。最后一步是将 ACell 脂质酯交换为脂肪酸甲酯。最终，气相色谱法用于量化脂肪酸。
与现有方法（如 tric 测定）相比，该技术的主要优点是该方法非常准确，并且专门测量所有脂肪酸和所有其他亲脂性成分。演示该程序的将是 NDI Afer，我们实验室的一名技术人员在开始此程序之前，按照列出的参考资料中详细说明，确定培养液中的藻类干重浓度（以克/升为单位）。转移一体积的培养液，其中含有 5 至 10 毫克藻类干重树枝玻璃离心管。
使用先前测定的生物质浓度计算转移的生物质的确切量，将样品以 1200 Gs 离心 5 分钟，丢弃部分上清液，在管中留下约 0.25 mL。下一次复苏。通过轻轻上下吹打沉淀，将藻类悬浮在剩余的上清液中，然后将细胞混合物转移到微珠打浆管中。
使用 200 μL 移液器，用正负 0.15 mL毫立方水冲洗离心管和移液器吸头，然后将液体转移到微珠打浆管中。以最大转速离心打珠管 1 分钟，以确保管底部没有气泡残留。完成后，将管中的材料冻干。
制备每升 50 毫克的 Penta Deano 脱程溶液，以强化氯仿与甲醇的体积比例。使用外置活塞式移液器，向串珠管中加入 1 毫升三脚架，无溶液。检查打珠管的盖子内是否没有残留的珠子，因为这会导致管珠泄漏。
以 2， 500 RPM 的速度将搅拌管打浆 8 次，每次 60 秒，每次串珠之间有第 122 次间隔。接下来，将珠子中的溶液从珠子打浆管转移到带有 Teflon 插入螺帽的干净耐热 15 毫升玻璃离心管中。用 1 毫升三脚架清洗珠子打浆管，无溶液，然后将洗涤液转移到玻璃离心管中。
再重复两次。涡旋样品 5 秒钟，然后超声处理 10 分钟。在 2.5 mL 含有 50 毫摩尔 triss 和 1 摩尔氯化钠的 pH 7 立方水溶液中超声处理后，进入离心管。
样品涡旋混合并再次超声处理后，将其在 1200 下离心 5 分钟。完成后，使用玻璃糊状移液管小心地将底部氯仿相转移到干净的玻璃管中，用 1 毫升氯仿重复提取。完成后，使用玻璃后移液管收集氯仿相，并与第一个氯仿馏分混合。
使用氮气流蒸发氯仿，以获得干燥的提取脂质。接下来，将 3 毫升含有 5% 硫酸的甲醇加入装有干燥提取脂质的试管中，并拧紧。涡旋样品 5 秒钟。
将样品在 70 摄氏度下在加热块中孵育 3 小时。定期确保样品没有沸腾，并在每次检查样品后涡旋试管。将样品冷却至室温后，在 3 毫升毫立方水和 3 毫升 n heane 中冷却至管中，然后涡旋混合。
用试管旋转器搅拌样品 15 分钟。从试管旋转器中取出样品后，以 1200 Gs 离心 5 分钟，使用玻璃移液管收集 2 毫升顶部己烷相并将其转移到新的玻璃管中。要清洗收集的己烷相，请在玻璃管中加入 2 毫升 milli Q 水。
然后涡旋样品 5 秒钟，并离心 5 分钟。在 1200 Gs 时，使用玻璃糊状移液器将己烷相从玻璃管转移到 GC 样品瓶中。然后在 GC 样品瓶上盖上盖子并拧紧，以防止溶剂蒸发。
将样品瓶放入 GC 拟合仪器的自动进样器中。最后，使用新的调用柱在仪器上运行样品，总流速为 20 mL/min，进样体积为 1 μL。请参阅文本实验方案，了解色谱柱规格和色谱条件？
通过此过程获得的典型色谱图如下所示。脂肪酸甲酯由 GC 色谱柱按大小和饱和度进行分离，方案使用链长较短的脂肪酸，而饱和脂肪酸含量越高，保留时间越短。所使用的 GC 色谱柱和方案并不打算分离脂肪酸异构体，但这可以通过使用不同的 GC 色谱柱和方案来实现。
此处显示了在氮充足和无氮条件下 C Desus UEX 3 93 的脂肪酸含量和组成。在充氮和缺氮栽培条件下，总脂肪酸含量分别为 8.6 正负 0.5% 和 44.7 正负 1.7%。这些值表明脂肪酸组成和含量受氮饥饿的高度影响。
在 ESBL 中，棕榈酸和油酸是两种含量最丰富的脂肪酸。有关计算脂肪酸含量和组成的详细信息，请参阅文本协议？Odum Trico UEX 6 4 0 在氮充足和无氮条件下的脂肪酸含量和组成如下所示。
与斜 UU 类似，脂肪酸含量和组成受氮饥饿的高度影响。在氮素充足和缺氮条件下，总脂肪酸含量分别为 11.7 正负 0.9% 和 30.5 正负 1.1%。P trium 还产生大量的高度不饱和脂肪酸，例如 I csap、Penta IC 酸。
此外，这种方法还可以检测非常长链的脂肪酸，例如木质素酸。该程序可以通过在脂质提取和酯交换步骤之间包括脂质凝块分离步骤来扩展，以获得对微量 LG 脂质类别组成的更多见解，如方案文本中的参考文献中所述。
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概述
本文介绍了一种确定微藻中脂肪酸含量和组成的方法。该过程包括机械细胞破碎、基于溶剂的脂质提取、酯交换反应以及使用气相色谱法对脂肪酸进行定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 微生物学
- 分析化学
背景
- 脂肪酸是微藻脂质的重要组成部分。
- 了解脂肪酸组成对于各种应用非常重要，包括生物燃料生产。
- 气相色谱法是脂肪酸分析的标准技术。
- 样品制备和提取方法对于准确测量至关重要。
研究目的
- 测量微藻中总脂肪酸含量。
- 分析藻类生物质中存在的脂肪酸组成。
- 建立一种可靠的脂肪酸定量方法。
使用的方法
- 制备已知量的冻干藻类生物质样品。
- 微藻生物质的机械破碎。
- 提取亲脂成分。
- 将脂质转化为脂肪酸甲酯。
- 使用气相色谱法对脂肪酸进行定量分析。
主要结果
- 成功从微藻中提取和定量脂肪酸。
- 使用气相色谱法鉴定脂肪酸组成。
- 使用十五烷酸三酯作为内标提高了准确性。
结论
- 该方法为分析微藻中的脂肪酸提供了一种可靠的方法。
- 结果可以帮助理解藻类物种的脂质谱。
- 这种技术可应用于各种研究领域，包括生物燃料开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of fatty acid content and composition in microalgae supports target validation for biofuel and nutraceutical development. This method enables mechanistic de-risking by providing reproducible lipid profiling data essential for strain selection and process optimization. Reliable fatty acid analysis informs predictive confidence in downstream applications such as transportation fuel and omega-3 production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid biosynthesis pathways under varying culture conditions.
- Operational Value: Provides quantitative fatty acid metrics for functional target validation in microalgal strains.
- Predictive Value: Supports strain prioritization based on lipid yield and composition under nitrogen stress.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers reproducible identification and quantification of fatty acids across chain length and saturation levels.
- Operational Value: Uses small sample sizes (5 mg) with internal standardization for assay robustness.
- Scalability: Facilitates preparation of validated lipid extracts for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage lipid profiling to preclinical nutraceutical and biofuel development.
- Biomarker Alignment: Fatty acid composition serves as a phenotypic marker for metabolic state under nitrogen deprivation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions on strain progression based on lipid class enrichment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early strain screening to lead identification and preclinical validation by delivering quantitative lipid outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid accumulation mechanisms and pathway clarification under nutrient stress.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible extraction and FAME generation for compound-independent lipid profiling.
- Analytics: Generates quantitative GC-FID readouts that allow comparison of fatty acid profiles across conditions and strains.
- Translational Research: Connects lipid composition data to preclinical continuity for biofuel and nutraceutical applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for lipid characterization across microalgal strain libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in lipid yield, reduction of mechanistic ambiguity in lipid biosynthesis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of fatty acid quantification across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in strain development, capital efficiency in feedstock optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of microalgal strains based on lipid content and unsaturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, transesterification, and gas chromatography.
- Needs bead beater, centrifuge, GC-FID, and solvent handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample prep and internal standard use.
- Adaptation considerations include lipid class extension and alternative GC columns for isomer resolution.
- Practical limitation: does not inherently resolve lipid classes without additional separation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Sample Preparation
2:03
Cell Disruption and Lipid Extraction
3:44
Transesterification to fatty Acid Methyl Esters
4:51
Quantification of Fatty Acid Methyl Esters Using Gas Chromatography
5:25
Results: Fatty Acid Content and Composition of Microalgae as Determined by Gas Chromatography
7:19
Conclusion
