Name: 成比例的生物传感器测量活酵母细胞中的线粒体氧化还原状态和ATP (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学习使用比例型基因编码生物传感器在活酵母细胞中测量线粒体氧化还原状态和ATP水平。该方法利用GFP变体实现亚细胞分辨率，为研究线粒体功能与细胞代谢提供可靠工具。

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本工作获得了以下资助：HHMI（56006760）授予JDV的奖项，美国国家卫生研究院（NIH）（2 TL1 RR 24158-6）授予DMAW的奖项，以及艾利森医学基金会（AG-SS-2465）和美国国家卫生研究院（NIH）（GM45735、GM45735S1 和 GM096445）授予LP的资助。GM45735S1 是根据《2009年美国复苏与再投资法案》由美国国家卫生研究院（NIH）颁发的。本研究使用的显微镜部分由美国国家卫生研究院／国家癌症研究所（NIH ⁄ NCI）资助（5 P30 CA13696）。

1. 用生物传感器转化酵母细胞
<ol>
 <li>使用醋酸锂法将含有 mito-roGFP 或 mitGo-ATeam2 的质粒转化至目标酵母菌株中27。</li>
 <li>为确认质粒携带的生物传感器成功转化并防止质粒丢失，将转化子筛选并培养在相应的选择性完全合成培养基上（mito-roGFP 使用 SC-Ura 培养基，mitGo-ATeam2 使用 SC-Leu 培养基）。若荧光探针被亚克隆至本文所述以外的其他质粒中，则应使用相应选择性培养基。通过荧光显微镜观察转化子，以确认其表达荧光生物传感器且线粒体形态正常。</li>
</ol>
2. 细胞培养与成像前准备
细胞功能及其对药物处理的反应在很大程度上依赖于细胞密度和代谢活性。当细胞处于活跃分裂期（对数中期，约 0.5 - 1 × 107 个细胞/毫升）时，可获得最佳实验结果。获得密度一致的对数中期培养物最可靠的方法是从处于静止期的预培养物中接种。
<ol>
 <li>准备静止期预培养物：从平板上挑取一个转化细胞的单菌落，接种于选择性液体培养基中（5 ml，置于50 ml锥底试管中）。在30 °C、225 rpm振荡条件下培养，直至培养物在600 nm处的光密度（OD600）达到平台期（24–48小时）。</li>
 <li>准备对数中期培养物用于观察：取适量预培养物接种于5 ml选择性培养基中（置于50 ml锥底试管中）。YPD培养基具有自发荧光，不应用于本研究。应使用基于葡萄糖的合成完全缺失尿嘧啶（SC-Ura）培养基。在30 °C、225 rpm振荡条件下培养4–16小时，直至细胞进入对数中期（约0.5–1 × 107 个细胞/ml）。可通过测定OD600确定细胞密度；需校准分光光度计以获得准确的OD600读数。在我们的Beckman DU530（Beckman Coulter, Indianapolis, IN）仪器上，对数中期对应的OD600为0.1–0.3。</li>
</ol>
Mito-roGFP1 可感知细胞器内因代谢变化引起的波动。例如，在本实验中，当酵母在可发酵碳源上生长时，线粒体的氧化还原状态会发生改变（例如 葡萄糖（如SC培养基中的成分）与非发酵性碳源例如 甘油（如 SGlyc 培养基中的成分）以及同一种培养基的不同批次之间均可能存在差异。因此，所有实验应使用同一批次的培养基。
<ol start="3">
 <li>若无需进行处理，细胞可直接用于浓度测定（参见步骤2.4）和成像。若需对细胞进行处理，则先加入相应处理试剂孵育，随后进入下一步。</li>
 <li>取1 ml培养液，在6,000 × g离心15秒，将细胞沉淀重悬于20 μl培养基中。此条件可使视野中可分辨的细胞数量最大化。</li>
 <li>取2 μl重悬的细胞悬液滴加至载玻片上，盖上盖玻片（No. 1.5，优选高性能、厚度为170±5 μm的盖玻片），并用透明指甲油或valap密封盖玻片边缘（参见试剂部分）。若使用valap密封，可将少量valap置于金属刮刀上，通过本生灯火焰加热熔化，然后沿盖玻片边缘均匀涂抹少量即可。</li>
 <li>成像过程中保持细胞温度为30 °C。使用100倍油镜进行成像时，配备物镜加热器可有效维持此温度条件。在此条件下，线粒体形态、氧化还原状态及ATP水平在成像持续10–15分钟期间保持稳定。</li>
</ol>
3. 成像设置
<ol>
 <li>在宽场荧光显微镜上对 mito-roGFP1 进行成像的设置 
 以下步骤针对配备 Colibri LED 激发光源、宽场 Orca ER 相机和 Axiovision 采集软件的 AxioObserver.Z1 显微镜进行优化。与汞弧灯照明相比，使用 LED 照明可显著减少两个通道的光漂白以及氧化型 mito-roGFP1 的光转化（见下文）。 
 为最大化信号强度和分辨率，应使用数值孔径尽可能高的物镜，并选择能提供足够空间分辨率的最低放大倍数。此外，对于 mito-roGFP 成像，需确认所用物镜在 365 nm 处具有良好的透射性能。100x/1.3NA EC PlanNeofluar 物镜（Zeiss）适用于此应用。 
 配置采集软件以分别捕获氧化态和还原态的 mito-roGFP1。我们采用以下条件：
 <ol>
 <li>将氧化态 mito-roGFP 的通道配置为在 365 nm（100% LED 功率）激发，并使用适合 GFP 的发射滤光片，例如 38 HE 滤光片组（Zeiss），但需从滤光片盒中移除其中的激发滤光片。移除激发滤光片后，可在不更换滤光片的情况下实现 365 nm 和 470 nm 的交替激发，从而提高可达到的时间分辨率。</li>
 <li>将还原态 mito-roGFP 的通道配置为在 470 nm（100% LED 功率）激发，并如上所述，使用与氧化态 mito-roGFP 相同的发射滤光片盒。将相机设置为 1×1 binning 模式，以优化空间分辨率。</li>
 <li>设置软件以采集包含 11 层、层间间距为 0.5 μm 的 z 轴堆栈图像，并在每个 z 位置同时采集两个通道。这种采集模式比依次采集每个 z 堆栈更慢，但可避免因在采集氧化态和还原态通道之间线粒体运动而产生的伪影。</li>
 <li>对多个细胞进行成像以确定合适的曝光时间，获得强而未饱和的信号。在所有实验中必须保持氧化态与还原态 mito-roGFP1 的曝光时间比例恒定。例如，若氧化态与还原态 mito-roGFP1 的曝光时间分别为 300 毫秒和 100 毫秒，则在所有实验中，氧化态 mito-roGFP1 的曝光时间应始终为还原态的 3 倍。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在光谱共聚焦显微镜上对 mitGO-ATeam2 进行成像的设置 
 为利用 mitGO-ATeam2 定量 ATP 水平，必须区分来自 GFP（发射峰 510 nm）和 OFP（发射峰 560 nm）的荧光。存在可分辨这两种荧光团发射光的荧光滤光片组。然而，我们发现许多激光扫描共聚焦显微镜配备的光谱探测器在本应用中效果更佳。光谱探测器可根据波长将荧光发射分为多个组分（通常为 32 个或更多）。若干相邻波长段可合并为一个图像通道。波长段的选择需通过经验确定，以最大化 GFP 和 OFP 的信号，同时避免信号串扰影响 FRET 测量结果。使用可用的最高数值孔径物镜。我们使用 100x/1.49 或 60x/1.49 Apo-TIRF 物镜。我们采用运行 NIS Elements 软件的 Nikon A1R 共聚焦显微镜。配置采集软件以分别捕获结合 ATP 与未结合 ATP 的 mitGO-ATeam2。我们采用以下条件：
 <ol>
 <li>将针孔设为 1.0 艾里单位（AU），在我们的系统中这对应约 0.42 μm 的 z 轴分辨率。</li>
 <li>设置扫描缩放以接近奈奎斯特采样极限，从而最大化图像中的空间信息。在我们的系统中，像素大小为 0.12 μm。</li>
 <li>由于线粒体在成像过程中可能发生移动，可通过将视场裁剪至 512 × 256 像素来提高成像速度。在我们的系统中，采集一帧图像的总时间为 1.0 秒，包含 2 次扫描平均。根据所需的空间分辨率，可进一步裁剪视场以提高时间分辨率。</li>
 <li>在 488 nm 激发，收集 500–520 nm 范围内的 GFP 发射光和 550–580 nm 范围内的 OFP 发射光。实际最佳值可能因成像系统的特性而异。</li>
 <li>在我们的系统中，最佳激光功率介于 6.0% 至 6.4% 之间。不同显微镜系统的最佳激光功率各不相同，但理想情况下应在仍能产生可解析图像的前提下尽可能降低功率。使用内置或外置功率计监测激光功率随时间发生的正常波动。</li>
 <li>调整探测器增益和照明光强，以在尽可能多的细胞中最大化检测到的像素值范围，同时避免信号饱和。任何含有超过 1% 饱和像素的细胞均不得用于分析。所有样品均应使用相同的物镜、激光功率、扫描缩放、像素大小、增益和偏移进行成像。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
 <li>使用透射光找到目标细胞的焦平面，以尽量减少荧光探针的漂白。</li>
 <li>定位一个或多个目标细胞后，以 0.5 μm 的步长采集典型细胞整个深度（约 7 μm）的 z 系列图像。</li>
 <li>对载玻片上的其他目标细胞进行成像，但单次成像同一张载玻片的时间不得超过 15 分钟。细胞在载玻片上超过 15 分钟后会失去活性。</li>
</ol>
5. 分析
通过测量mitGO-ATeam2在560 nm和510 nm处发射光的比值来确定线粒体ATP水平。27 细胞器的氧化还原状态通过 mito-roGFP 的还原态与氧化态（R/O）比值来测定； 即 在470 nm激发下于510 nm处的发射强度除以在365 nm激发下于510 nm处的发射强度。在计算比值之前，需扣除背景信号，并确定属于荧光标记线粒体的像素的阈值。
可使用公共领域（例如 ImageJ30）或商业软件（例如 Volocity、Perkin-Elmer）对 mito-roGFP1 或 mitGO-ATeam2 数据进行分析。根据所使用的图像采集和分析软件，可能需要先将图像转换为其他格式（如 TIFF），然后才能在分析软件中打开。如果进行了图像格式转换，则必须验证转换过程中像素值未发生改变。下文将分别描述使用这两种程序分析 mito-roGFP1 数据的方法。各程序中的菜单及菜单内选项以粗斜体标出。
5.1 ImageJ 分析
<ol>
 <li>打开图像并将类型更改为32位：图像→ 类型 → 32位。</li>
 <li>在无细胞区域绘制一个感兴趣区域（ROI）。计算该ROI内的平均强度：分析 → 测量。</li>
 <li>从图像栈中减去计算得到的平均背景值：处理 → 数学 → 减去。</li>
 <li>使用减去背景后的z栈，找到中间切片并对线粒体进行阈值设定：图像 → 调整 → 阈值，在“阈值”窗口中点击应用，并将该阈值应用于栈中的所有切片。勾选将背景像素设置为NaN。</li>
 <li>创建比值z栈：处理 → 图像计算器，将还原态图像栈除以氧化态z栈用于mito-roGFP1分析；将560 nm（ATP结合态）图像除以510 nm（ATP非结合态）图像用于mitGO-ATeam2分析。</li>
 <li>在目标区域周围绘制ROI。选择分析 → 工具 → ROI管理器，点击添加以记录该ROI。多个区域可保存在管理器中。在ROI管理器中选中所有ROI，然后选择更多 → 多重测量以测量所有栈切片。将数据导出至电子表格进行分析。</li>
</ol>
5.2 速度分析
<ol>
 <li>将图像导入 Volocity 图像库，并创建包含两个通道的图像序列。</li>
 <li>在无细胞区域绘制感兴趣区域（ROI）。选择：工具 → 比值。</li>
 <li>使用 Volocity 计算背景：从 ROI 获取。</li>
 <li>调整阈值以包含线粒体结构。</li>
 <li>勾选对比值通道应用彩虹色阶（rainbow LUT）的选项。强度调制通道可能生成噪声较少的图像用于展示，但不应将其用于平均比值的定量分析。</li>
 <li>选择 测量 选项卡，选中比值通道，并在感兴趣区域周围绘制 ROI。测量比值通道时排除零值。可同时选择并测量多个区域。将数据导出至电子表格进行分析。</li>
</ol>

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<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍了利用 mito-roGFP1 和 mitGO-ATeam2 作为生物传感器，在活体酵母细胞中评估线粒体氧化还原状态和 ATP 水平的方法。我们发现，由质粒表达的 mito-roGFP1 或 mitGO-ATeam 能够定量地靶向定位至线粒体，且对线粒体的形态、分布以及细胞生长速率均无明显影响3。mito-roGFP1 能够检测线粒体氧化还原状态从高度氧化到高度还原的变化。同样，mitGO-ATeam 可以测量酵母在呼吸驱动生长过程中以及经呼吸抑制剂处理后线粒体 ATP 水平的变化。此外，由于这两种生物传感器均具有亚细胞分辨率，因此能够检测单个细胞内线粒体之间在氧化还原状态或 ATP 水平上的异质性。最后，由于这两种生物传感器均为比率型探针，其信号不受探针浓度变化、样品厚度差异或照明不均的影响。这些探针为在活细胞中以亚细胞分辨率研究线粒体功能提供了一种微创且可靠的方法。
要成功应用此方法，应以尽可能高的信噪比采集图像。重要的第一步是在显微镜下观察10至20个转化子菌落的细胞，并选择那些具有强荧光、正常线粒体形态和正常生长速率的细胞。接下来，应优化成像条...

线粒体是产生ATP、合成氨基酸、脂肪酸、血红素、铁硫簇和嘧啶所必需的细胞器。线粒体还在钙稳态以及细胞凋亡调控中发挥关键作用1。越来越多的证据表明，线粒体与衰老及年龄相关性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病）密切相关2。尽管个体一生中均携带与神经退行性疾病相关的线粒体蛋白突变，但疾病症状仅在生命后期才出现。这表明，随着年龄增长，线粒体发生了某些变化，从而导致疾病病理的显现。事实上，线粒体功能状态与酵母和哺乳动物细胞的整体细胞健康及寿命密切相关3,4。本文中，我们介绍如何利用基因编码的比率型荧光生物传感器，在活体酵母细胞中评估线粒体的两个关键特征：氧化还原状态和ATP水平。
线粒体在有氧能量动员中的功能已得到充分证实。线粒体的氧化还原状态是细胞器内还原性和氧化性物质共同作用的结果，包括NAD+/NADH、FAD/FADH2、NADP+/NADPH、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）以及活性氧（ROS）。线粒体解偶联或缺氧会影响线粒体的呼吸活性，并改变细胞器内NAD+与NADH的比例。活性氧（ROS）主要来源于线粒体内膜上电子传递链各复合物之间电子传递效率低下，以及外膜上单胺氧化酶催化胺类脱氨反应5，ROS可损伤脂质、蛋白质和核酸，并与衰老及衰老相关的神经退行性疾病密切相关6,7,8。此外，ROS还通过氧化GSH参与线粒体内的信号转导过程。例如，NADH脱氢酶不仅参与ROS的生成，其活性还受到谷胱甘肽池的调控9,10。α-酮戊二酸脱氢酶和顺乌头酸酶是三羧酸（TCA）循环的组成部分，在氧化性环境中其活性会降低11,12。
事实上，依赖氧化还原的乌头酸酶活性调控从细菌到哺乳动物都具有保守性13,14。因此，监测线粒体的氧化还原状态和ATP水平对于理解其功能及其在疾病病理中的作用至关重要。
已采用生化方法来评估完整细胞或分离线粒体的氧化还原状态或ATP水平。广泛用于评估完整细胞或分离线粒体氧化还原状态的方法基于测定还原型与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的水平15。荧光素-荧光素酶系统常用于测定通透化完整细胞或分离线粒体中的线粒体ATP水平16,17,18,19,20。在此检测中，荧光素酶与ATP结合，并催化荧光素的氧化反应并产生化学发光21。所发射光的强度与反应体系中ATP的含量成正比22。
这些方法揭示了有关线粒体功能的基本信息，包括发现阿尔茨海默病等神经退行性疾病患者的ATP水平异常偏低。23 然而，这些方法无法用于成像活体、完整的细胞。此外，基于全细胞分析的方法仅能提供细胞所有区室中氧化还原状态或ATP水平的平均值。对分离细胞器进行测量可能存在潜在问题，因为在线粒体亚细胞分级分离过程中，其氧化还原状态或ATP水平可能发生改变。最后，我们实验室及其它研究团队的最新研究表明，单个细胞内的线粒体在功能上具有异质性，这种异质性进而影响母细胞和子细胞的寿命。3 因此，亟需一种能够在活细胞中以亚细胞分辨率检测线粒体ATP水平和氧化还原状态的技术。
本文所述的线粒体功能生物传感器均基于绿色荧光蛋白（GFP）。氧化还原敏感型GFP（roGFP）24,25 是一种在分子表面引入了暴露性半胱氨酸残基的GFP变体。与野生型GFP类似，roGFP具有两个激发峰（分别位于约400 nm和480 nm）以及一个位于约510 nm的发射峰。当roGFP中的半胱氨酸残基被氧化时，其在约400 nm处的激发光吸收增强；而当这些半胱氨酸被还原时，则更有利于在约480 nm处的激发。因此，通过测定roGFP在480 nm和400 nm激发下于510 nm处发射光的强度比值，可反映roGFP氧化态与还原态的相对比例，从而指示荧光探针所处微环境的氧化还原状态。
广泛使用的roGFP有两种版本：roGFP1和roGFP2。两者均含有相同的半胱氨酸插入序列。roGFP1基于野生型GFP，而roGFP2基于S65T GFP，后者在480 nm处的激发效率更高，在400 nm处的激发效率则较野生型GFP更低。24roGFP1 的 pH 敏感性低于 roGFP2，其动态范围在还原端更广。因此，roGFP1 可能更适用于监测还原性较强的区室（如线粒体或细胞质），以及 pH 可变的区室（如内体）。roGFP2 具有更强的信号强度，在某些研究中其动态范围也大于 roGFP124,26. 研究进展在 拟南芥 表明两种传感器对氧化还原状态变化的响应时间相似（t&frac12; 用于氧化，65 和 95 秒，以及 t&frac12; 还原条件下，roGFP1 和 roGFP2 的时间分别为 272 秒和 206 秒。26
MitGO-ATeam2 是一种微创且可靠的传感器，可用于测量芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 中的线粒体 ATP。GO-ATeam 是一种基于荧光共振能量转移（FRET）的探针，由 FoF1-ATP 合酶的 ε 亚基构成，该亚基位于 FRET 供体与受体荧光蛋白（分别为绿色荧光蛋白 GFP 和橙色荧光蛋白 OFP）之间。27 ATP 与 ε 亚基结合后会引起蛋白质构象变化，使 FRET 供体与受体彼此靠近，从而实现能量从供体向受体的转移。GO-ATeam 有两种变体：GO-ATeam1 和 GO-ATeam2。GO-ATeam2 对 MgATP 的亲和力高于 GO-ATeam1，因此更适合用于测量线粒体中通常低于细胞质的 [ATP] 水平。27
为了检测线粒体的氧化还原状态，我们构建了一种融合蛋白（mito-roGFP1），该蛋白由roGFP1与ATP9引导序列融合而成，并通过基于着丝粒的（低拷贝数）酵母表达质粒在强效的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GPD）启动子（p416GPD，Addgene）控制下表达。我们利用roGFP1检测模式真菌Saccharomyces cerevisiae在衰老过程中线粒体的氧化还原状态。研究发现，roGFP1能够检测到衰老过程及营养可利用性变化期间线粒体氧化还原状态的改变，但对酵母细胞无明显不利影响。我们还观察到单个活酵母细胞内线粒体氧化还原状态存在差异，这一发现凸显了具有亚细胞空间分辨率的生物传感器的重要性。
MitGO-ATeam2 是 GO-ATeam2 的一种变体，其在 GO-ATeam2 的氨基末端插入了细胞色素 c 氧化酶亚基 VIIIA 的线粒体信号序列27。我们对 mitGO-ATeam2 探针（由日本大阪大学产业科学研究所 H. Noji 实验室惠赠）进行了改造，通过 Xba1 和 HindIII 位点将其亚克隆至酵母表达载体 pAG415GPD-ccdB（Addgene，美国马萨诸塞州剑桥市）中，该载体是一种含有强组成型 GPD 启动子的低拷贝质粒。我们在芽殖酵母中表达了 mitGO-ATeam2，并通过 DNA 结合染料 DAPI 复染发现，该探针特异性定位于线粒体，在其中可作为有效探针用于检测线粒体 ATP 水平的生理变化。
roGFP 和 GO-ATeam 均为基因编码的探针。因此，它们可被导入完整细胞并在其中稳定表达，从而提供单个活细胞内氧化还原状态或 ATP 水平的信息。此外，这两种生物传感器均可监测在生理条件下发生的氧化还原状态或 ATP 水平的变化28。两种探针均为比率型传感器，因此使用这些探针进行的测量不受生物传感器浓度、样品照明强度或样品厚度变化的影响。最后，这两种生物传感器均具有亚细胞空间分辨率。事实上，roGFP 已被靶向定位至线粒体、内质网、内体和过氧化物酶体24，并能够检测这些细胞器各自氧化还原状态的变化，且在很大程度上不受 pH 值的影响。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>1397-94-0</td><td>溶于乙醇，配制成 2 mg/ml 的储存液。</td></tr><tr><td>SGlyc（合成甘油酵母培养基）*若使用SGlyc-Ura则省略&lt;br/&gt; **SGlyc-Leu省略**</td><td></td><td></td><td>溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 用 NaHCO₃ 调节 pH 至 5.5&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;高压灭菌。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;em&gt;成分：&lt;br/&gt; &lt;/em&gt;0.67% 无氨基酸酵母氮源基础培养基&lt;br/&gt; 3% 甘油&lt;br/&gt; 0.05% 葡萄糖&lt;br/&gt; 2 mg/ml 腺嘌呤&lt;br/&gt; 2 mg/ml 尿嘧啶*&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-精氨酸&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-组氨酸&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-亮氨酸**&lt;br/&gt; 3 mg/ml L-赖氨酸&lt;br/&gt; 2 mg/ml L-甲硫氨酸&lt;br/&gt; 4 mg/ml L-苯丙氨酸&lt;br/&gt; 2 mg/ml L-色氨酸&lt;br/&gt; 3 mg/ml L-酪氨酸</td></tr><tr><td>SC（合成完全，基于葡萄糖）酵母生长培养基 *在SGlyc-Ura中省略&lt;br/&gt; **SGlyc-Leu省略**</td><td></td><td></td><td>溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 用 NaHCO₃ 将 pH 调至 5.5&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;高压灭菌。 &lt;em&gt;成分：&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 0.67% 无氨基酸酵母氮源基础培养基&lt;br/&gt; 3% 葡萄糖&lt;br/&gt; 2 mg/ml 腺嘌呤&lt;br/&gt; 2 mg/ml 尿嘧啶*&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-精氨酸&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-组氨酸&lt;br/&gt; 1 mg/ml L-亮氨酸**&lt;br/&gt; 3 mg/ml L-赖氨酸&lt;br/&gt; 2 mg/ml L-甲硫氨酸&lt;br/&gt; 4 mg/ml L-苯丙氨酸&lt;br/&gt; 2 mg/ml L-色氨酸&lt;br/&gt; 3 mg/ml L-酪氨酸</td></tr><tr><td>瓦拉普</td><td></td><td></td><td>以1:1:1（w:w:w）的比例混合各成分，通过浸入70℃水浴中熔化。 &amp;deg;C H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O浴。分装至玻璃培养皿中。室温保存。 &lt;em&gt;成分：&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 凡士林石油脂、石蜡、羊毛脂</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;设备与软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>经预清洁的 Gold Seal Rite-on 显微载玻片</td><td>Thomas Scientific（美国新泽西州斯韦兹伯勒）</td><td>3050</td><td>尺寸：25 x 75 mm；厚度：0.93 至 1.05 mm</td></tr><tr><td>高性能盖玻片，No. 1.5，18×18 mm</td><td>蔡司（美国 Thornwood）</td><td>474030-9000-000</td><td>这些在厚度上变异较小（170&amp;plusmn;5 &amp;mu;m）比标准盖玻片更薄，可减少球面像差并提升三维成像性能</td></tr><tr><td>Fisherbrand 显微镜盖玻片，No. 1.5</td><td>Fisher Scientific（匹兹堡，宾夕法尼亚州）</td><td>12-545E</td><td>尺寸：22 × 22 mm，1.5号厚度（170 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>配备光谱检测器和100x/1.49 NA Apo-TIRF物镜的A1激光扫描共聚焦显微镜</td><td>尼康（Melville，NY）</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备100x/1.3NA EC Plan-Neofluar物镜（Zeiss）和Orca ER冷却CCD相机（Hamamatsu）的AxioObserver.Z1显微镜，由Axiovision软件控制</td><td>蔡司（美国滕伍德）；滨松（日本滨松市）</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity 3D 图像分析软件</td><td>Perkin Elmer（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td></td><td>去卷积恢复模块；用于比率计算与测量的定量模块</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院（贝塞斯达，马里兰州）</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

测量活酵母细胞中线粒体氧化还原状态和atp的比率型生物传感器

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

线粒体参与多种细胞过程，从能量代谢和钙稳态到细胞寿命调控以及程序性细胞死亡。这些过程受到线粒体氧化还原状态和ATP生成的影响，同时也反过来影响这些指标。本文描述了两种基于比率检测的遗传编码生物传感器的使用方法，可在活酵母细胞中以亚细胞分辨率检测线粒体的氧化还原状态和ATP水平。线粒体氧化还原状态通过靶向定位于线粒体基质的氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP）进行测量。Mito-roGFP在GFP的第147和204位含有半胱氨酸，可发生可逆且依赖环境的氧化与还原反应，从而改变该蛋白的激发光谱。MitGO-ATeam是一种基于荧光共振能量转移（FRET）的探针，其结构将FoF1-ATP合酶的ε亚基夹在FRET供体与受体荧光蛋白之间。当ATP结合到ε亚基时，会引起蛋白构象变化，使FRET供体与受体彼此靠近，从而实现从供体到受体的荧光共振能量转移。

使用 mito-roGFP 测量线粒体氧化还原状态
本文结果显示，mito-roGFP1 具有足够的动态范围，可在活酵母细胞中检测线粒体氧化还原状态从完全氧化到完全还原的变化，且不会影响酵母细胞的生长或线粒体形态。首先，我们发现表达线粒体靶向 GFP 和 roGFP1 的细胞生长速率正常（图 1A）。通过指数生长期生长曲线的最大斜率以及达到最大生长速率所需时间测定，表达 mito-GFP 与 mito-roGFP1 的细胞其最大生长速率相似。此外，表达 mito-roGFP1 的酵母细胞中线粒体呈现野生型形态（图 1B）。具体而言，这些线粒体呈管状结构，沿母细胞-芽体轴排列，并在母细胞和子细胞的末端富集。由于线粒体功能障碍常导致其发生碎片化，而此处观察到的正常形态表明 mito-roGFP1 不会干扰线粒体的正常功能。
为了评估 mito-roGFP1 的动态范围，我们分别用过氧化氢（H2O2）和二硫苏糖醇（DTT）处理处...

我们描述了两种基于GFP的比率型遗传编码生物传感器的使用方法，用于在活酵母细胞中以亚细胞分辨率监测线粒体氧化还原状态和ATP水平。

测量活酵母细胞中线粒体氧化还原状态和ATP的比率型生物传感器

线粒体在多种细胞过程中发挥重要作用，从能量代谢和钙稳态到细胞寿命的调控以及程序性细胞死亡……

本实验的总体目标是利用两种绿色荧光蛋白（GFP）变体来测量活酵母细胞中的线粒体功能。氧化还原感应型GFP含有表面暴露的半胱氨酸，这些半胱氨酸可发生可逆的、依赖环境的氧化与还原反应，从而改变该蛋白还原态row的激发光谱。还原态row GFP在470纳米处具有激发最大值，而氧化态row GFP在365纳米处的激发效率显著增强。通过在365纳米激发下RO GFP的发射值归一化470纳米激发下RO GFP的发射值来测量氧化还原状态。A团队是一种FRET探针，其中F零F1 ATP合酶的ε亚基被夹在FRET供体GFP与FRET受体橙色荧光蛋白（OFP）之间。ATP与ε亚基结合后，引起蛋白构象变化，使FRET供体与受体相互靠近，从而实现能量从供体向受体的转移。ATP水平则通过488纳米激发下OFP发射值与488纳米激发下GFP发射值的比值进行测定。由此获得的结果可用于监测生理条件下氧化还原状态或ATP水平的变化。与现有方法相比，这些方法的主要优势在于road GFP和go. A团队是基因编码的，可被引入并在活细胞中稳定维持。因此，它们可用于测量活细胞中线粒体的氧化还原状态和a TP，而不会影响细胞或细胞器的正常功能。两种探针均可在生理条件下监测氧化还原状态或ATP水平的变化。由于具有比率测量特性，使用这些探针进行的测量结果不受生物传感器浓度、样品光照强度或样品厚度变化的影响。这两种生物传感器均可实现对单个细胞器水平的分辨。事实上，RO GFP变体已被靶向定位至线粒体、内质网、内体和过氧化物酶体，在这些细胞器中可检测氧化还原状态的变化，且基本不受pH影响。这些方法有助于回答有关线粒体质量控制以及线粒体如何随年龄变化等领域的关键科学问题。该方法的可视化演示非常有用，因为图像分析过程中的阈值设定和比值计算步骤较为复杂，需依据一致且明确的指导原则进行。开始此实验前，请按照文本方案所述，将携带生物传感器的酵母进行转化。在15毫升锥底试管中，将细胞于5毫升选择性完全缺陷培养基中培养至对数中期。所有实验均使用同一批次的培养基。将一毫升培养物浓缩至20微升后，取两微升重悬的细胞滴加到载玻片上，并用盖玻片覆盖细胞。然后将少量VAP在金属刮刀上熔化，并沿盖玻片边缘涂抹以密封。或者，可以使用透明指甲油在宽场荧光显微镜上进行 mito RO GFP 一的成像。应选用数值孔径尽可能高且能透射 365 纳米光的物镜，例如 100 x 1.3 NA EEC plan. Neo Fluor 物镜。将显微镜配置为在365纳米和470纳米处激发，分别用于检测氧化态和还原态的mitter row GFP。使用LED切换激发波长，并采用适用于GFP的发射滤光立方体。移除激发滤光片后，将相机设置为逐个像素优化，以获得最佳空间分辨率。接下来，将软件设置为获取由11个切片组成的Z轴图像序列，每个切片间隔0.5微米，在

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

成比例的生物传感器测量活酵母细胞中的线粒体氧化还原状态和ATP

可以使用定位于特定细胞区室的比率型荧光染料，在活体酵母（S.

液泡和细胞质 pH 值的测定 体内 在酵母细胞悬液中

过氧化氢（H2O2）既是氧化损伤的来源，也是一种信号分子。本实验方案介绍了如何在活酵母细胞中利用线粒体靶向的基因编码比率型生物传感器 HyPer7（mtHyPer7）来检测线粒体内的...

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测量活酵母细胞中线粒体氧化还原状态和ATP的比率型生物传感器

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