Name: 基质辅助飞行的完整蛋白质（MALDI-TOF）质谱分析激光解吸/电离飞行时间大于100 kDa的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习使用MALDI-TOF质谱技术分析大于100 kDa的完整蛋白质。本方法展示基质溶液制备与薄层沉积技术，可获得高质量质谱图并提高检测灵敏度。

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我们感谢克里斯托夫·马塞隆博士（iRTV，法国原子能委员会，格勒诺布尔）以及结构生物学研究所（IBS）病毒与癌症研究组成员对本文手稿的审阅和有益的讨论。我们感谢西里尔·迪安慷慨提供蛋白Crm1。本项科研工作在格勒诺布尔结构生物学研究平台（ISBG；法国国家科学研究中心-原子能委员会-格勒诺布尔-阿尔卑斯大学-欧洲分子生物学实验室联合技术平台UMS 3518）的质谱设施中完成。本研究得到了法国整合结构生物学基础设施计划（FRISBI，ANR-10-INSB-05-02）、GRAL（ANR-10-LABX-49-01）[格勒诺布尔结构生物学合作伙伴关系项目]以及法国国家科学研究中心（CNRS）的经费支持。

1. 蛋白质样品制备：缓冲液置换（可选）
需要5-25 μl的微摩尔浓度蛋白质（1至20 μM）。缓冲液置换可使用离心超滤装置进行例如 Vivaspin，Sartorius）或微量离心凝胶过滤柱（例如，Micro Bio-Spin 6 层析柱，Bio-Rad） 29,30缓冲液置换步骤可重复2-3次。缓冲液置换的详细描述此前已有报道。 29,30例如，我们使用 20 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（即 Tris，pH 8，作为终末缓冲液。
注意： 此步骤在许多情况下可以省略。当蛋白质样品中含有可能强烈干扰质谱检测的分子或缓冲液时，应执行此步骤。例如 甘油；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。它也有助于提高谱图质量。
2. 基质重结晶以提高其纯度（可选）
<ol>
	<li>将 10 ml 的 40% 乙醇（EtOH）倒入 Pyrex 烧瓶中。</li>
	<li>加入 600 mg 基质。</li>
	<li>使用水浴和电阻加热器加热基质溶液，并用玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，直至基质完全溶解。</li>
	<li>重复步骤 2，直至获得饱和溶液。</li>
</ol>
注意：使用过大的溶剂体积或将基质溶解在远低于溶液沸点的温度下，会导致晶体产率低下或完全无法形成晶体。
<ol start="5">
	<li>让溶液缓慢冷却。可先在室温下静置数小时，然后于 4 °C 过夜。注意：若未形成晶体，可用玻璃玻棒刮擦烧杯内壁（液面下方附近）以诱导结晶。</li>
	<li>通过过滤收集基质晶体。</li>
	<li>用少量冰冻溶剂冲洗晶体，并进行过滤。</li>
	<li>让晶体自然干燥。此步骤可使用真空干燥。</li>
</ol>
3. 清洁 MALDI 不锈钢靶板
<ol>
	<li>用甲醇（MeOH）冲洗MALDI板，并用专用于实验室应用的清洁纸巾（例如 Kimwipe）轻轻擦拭。</li>
	<li>用水（H2O）冲洗靶板，并用清洁纸巾擦拭。</li>
	<li>将MALDI板放入600 ml烧杯中，并用50%乙醇（EtOH）覆盖。</li>
	<li>在超声波清洗仪中，将靶板于乙醇溶液中超声处理10分钟。</li>
	<li>若板上仍有残留物，请重复步骤1–4一次。</li>
	<li>最后，用甲醇（MeOH）或水冲洗靶板（见下文注释），倾斜靶板使所有液体被清洁纸巾吸走。让靶板在室温下自然干燥，或使用氮气气流吹干。</li>
</ol>
注意： 类似的操作步骤此前已有描述15。
注意：最后一次冲洗靶材所用的溶剂（甲醇或水）会影响靶材的某些特性。如果使用甲醇冲洗靶材，样品在靶材上的扩散程度会明显大于使用水时的情况。
4. α-CHCA 薄层溶液：在 MALDI 靶板上的制备与点样
<ol>
	<li>将α-CHCA溶于丙酮中，制备成饱和溶液。</li>
	<li>徒手（不使用任何移液器）将10 μl吸头浸入例如 GELoader 尖端（Eppendorf），置于 α-CHCA 饱和溶液中：少量溶液会因毛细作用流入尖端。</li>
	<li>轻触，动作要非常迅速（即 用移液枪头轻触MALDI靶板，将α-CHCA丙酮溶液点样于MALDI靶板上。此步骤将形成用于后续蛋白样品点样的基质薄层。尽量生成尽可能小的薄层斑点。</li>
</ol>
注意： 使用芥子酸（SA）作为基质时，我们采用芥子酸在丙酮中的饱和溶液制备一层薄膜。
5. 基质溶液的制备：SA、α-CHCA、DHB 和 CHCA_DHB 混合物25
<ol>
	<li>在乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（TFA）（70:30，体积比）中配制20 mg/ml的SA溶液。</li>
	<li>在乙腈（ACN）和5%甲酸（70:30，体积比）中配制20 mg/ml的α-CHCA溶液[命名为“α-CHCA溶液&#34;]。</li>
	<li>在乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（TFA）（70:30，体积比）中配制20 mg/ml的DHB溶液[命名为&#34;DHB溶液&#34;]。</li>
	<li>将“α-CHCA溶液&#34;与&#34;DHB溶液&#34;按1:1体积比混合，得到&#34;CHCA_DHB溶液&#34;。</li>
</ol>
注意：在分析分子量小于 100 kDa 的蛋白质时，可将“α-CHCA 溶液&#34;与&#34;DHB 溶液&#34;以不同比例混合。例如，α-CHCA 与 DHB 的体积比为 40:60 时可获得更高的分辨率，但灵敏度较低（见讨论部分）。
6. 样品在MALDI靶板上的点样
<ol>
	<li>将0.5 μl蛋白样品点加至先前制备的α-CHCA薄层上，随后立即加入0.5 μl基质溶液（即 SA溶液或α-CHCA溶液或 &#34;CHCA_DHB 混合物&#34;这意味着在靶板上混合样品与基质。</li>
</ol>
注意：通常将蛋白质样品与基质以1:1的比例混合。该比例对于获得高质量的MALDI质谱图至关重要。如果需要测试不同的样品浓度，可以使用乙腈-甲酸溶液（如上所述）稀释样品。
注意：如果需要，可先在离心管中混合样品与基质，然后将混合后的&#34;样品-基质溶液&#34;滴加到薄层上。
注意：我们建议您测试不同的样品浓度，因为稀释样品可以减少杂质的干扰。如需稀释样品，可使用乙腈-甲酸溶液（如上所述）进行稀释。
7. 校准物沉积
<ol>
	<li>加入0.5 μl校准品标准液（例如 &#34;蛋白标准品 II&#34;，布鲁克道尔顿公司，德国不来梅）然后加入0.5 μl基质溶液。</li>
</ol>
注意：将校准物加样到与蛋白质样品点相邻的 MALDI 板上（参见讨论部分）。
8. 校准品和蛋白质样品的MALDI质谱采集
样品和校准物干燥后，即可观察到 &#34;斑点&#34; 在显微镜下观察。此步骤为可选操作，可能主要对初学者具有参考意义。为获取样品质谱，将待测样本插入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）中，并根据每种设备类型的不同选择合适的仪器参数。为获得最适宜的设置，应遵循仪器制造商的推荐方案。在分析完整蛋白质时，通常需将仪器设置为线性模式（而非适用于肽段分析的反射模式）。一般情况下，我们采用正离子模式进行检测。此外，一个关键参数是 &#34;脉冲离子萃取&#34; 从而提高了仪器的分辨率 31简而言之， &#34;脉冲离子萃取&#34; 可以定义为样品离子生成与离子被加速飞向检测器之间的时间间隔。在分析完整蛋白质时，应采用&#160;a &#34;脉冲离子萃取&#34; (例如 500 纳秒）长于观测肽段时的情况（例如 80 纳秒。
选择合适的 m/z 范围，采集校准物的谱图，并对仪器进行校准。采集样品谱图时，使用适当的激光强度（参见讨论部分）。

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</ol>

无利益冲突声明。

我们介绍了一种使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）获取分子量大于100 kDa的大分子完整蛋白质高质量质谱图的详细方案。为了提高质谱图的质量，必须仔细考虑样品制备过程中的多个关键因素。高纯度的基质和溶剂至关重要，因为基质和溶剂中存在的所有污染物在溶剂蒸发后都会在MALDI靶板上富集。为了提高MALDI基质的纯度，可以采用经典的重结晶方法对其进行纯化（见上文）。我们还建议&#160;每周至少新鲜配制一次基质溶液，以改善基质结晶效果并避免基质降解。
基质沉积方法对质谱图的最终质量至关重要。如上所述，薄层法是我们的首选方法12。此外，我们优化了第一层沉积的操作步骤。当使用丙酮溶解基质以获得饱和溶液时，丙酮虽可实现溶剂的快速挥发，但也使得第一层的尺寸极难控制。我们建议使用GELoader枪头作为微型刷子，将其浸入基质-丙酮溶液中，蘸取极小体积后迅速点样至靶板上。第一层的尺寸在一定程度上决定了最终MALDI斑点的大小：较小的斑点（即 直径0.5–0.75 mm）更为理想，因为此时样品浓度高于大斑点的情况。获得小斑点的方法不同于此前JoVE视频中提出的超薄层法15。在Fenyo 等 的方法中，使用移液枪头侧面将薄层溶液涂布于整个MALDI靶板表面。该方法需要反复测试薄层效果，且必须满足特定标准（例如 溶剂挥发速度）。若未达到标准，则需清洗MALDI靶板并重新制备薄层，这对初学者而言较为繁琐。此外，将样品/基质混合物点样至靶板后，还需使用真空管线抽吸去除多余溶剂，并用三氟乙酸（TFA）进行清洗步骤15，这使得Fenyo 等 的制备方法比我们的方法更为复杂。
基质与样品之间的体积比对于通过MALDI-TOF成功分析完整蛋白质至关重要。经过对不同比例的测试，我们建议采用1:1的比例。不同的基质与样品比例可能会影响质谱图的质量，可能是由于结晶不均匀所致。基质和样品的点样顺序也十分关键。首先点样一层薄薄的基质，随后立即点加样品，并紧接着（在样品斑点干燥之前）加入CHCA_DHB混合液。该操作程序被称为&#34;三明治法&#34;27，即样品单独位于两层基质之间。作为替代方法，可将CHCA_DHB溶液与样品在0.5 ml离心管中混合，然后点加到CHCA薄层上12。这种方法可形成均匀的晶体层，从而获得高质量的质谱图。在分析分子量低于100 kDa的蛋白质时，可提高DHB的比例（例如 60:40 DHB:CHCA）；这可能会产生更尖锐的峰，但可能降低检测灵敏度（即 峰强度减弱）。
为了正确校准仪器，必须将校准物标准品点样在接近样品点的位置，以便获得更高的质谱质量准确性。此前已有研究提出一种&#34;伪内标校准法&#34;15：在获取样品谱图后，用激光照射校准物点位，将校准物信号添加至样品谱图中。该方法可利用校准物的特征峰对样品谱图进行内标校准。
激光能量在光谱采集过程中也应严格控制。大多数情况下，较高的能量可提高灵敏度，但会降低分辨率。建议在不牺牲采集灵敏度的前提下，使用尽可能低的激光能量。此外，为提高光谱质量，可对每个样品点采集更多次激光 shots。通常，采集的 shots 数越多（1,000–2,000 次），信号强度越高。在激光照射样品点时，需找到合适的位置（即 &#34;最佳点&#34;），因为样品分布不均匀。可在同一区域重复采集，直至信号增强，然后尝试寻找另一个含有样品的区域。
总之，在使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析完整蛋白质时，基质和溶剂的高纯度、样品与基质在靶板上的点样方法、用于校准的标准品位置、激光能量强度以及采集时间（每点激光 shots 数）是必须考虑的关键因素。
作者贡献
L.S. 和 E.B.E. 设计了实验，进行了质谱实验，分析了数据，并撰写了手稿。

结构生物学依赖于高质量蛋白质的制备 1 因此需要与高效且可靠的蛋白质分析技术相结合 2,3在我们的结构生物学研究所的质谱（MS）实验室中，需要确认蛋白质的一级序列，评估突变和翻译后修饰的存在情况、蛋白质的降解程度、样品的均一性以及同位素标记的质量例如 用于核磁共振研究的氘代蛋白质4由于结构生物学家利用有限蛋白水解来区分结构刚性区域与柔性部分，因此我们需要通过质谱法（MS）可靠地表征这些截短蛋白。
当通过质谱法分析生物分子时，通常采用两种方法对这类重且不稳定的分子进行软电离。电喷雾电离（ESI）可直接从液相中使分子离子化 5；基质辅助激光解吸电离（MALDI）要求生物分子与吸收紫外光的有机分子共结晶即 基质分子 6.
液相色谱联用的电喷雾电离飞行时间质谱（ESI TOF MS）已成为完整蛋白质分析的常规技术，因其可实现高精度的质量测定（≤ 50 ppm）。然而，该技术对样品缓冲液的组成（特别是盐类和去污剂）以及污染物极为敏感即 聚合物）有时难以消除，会导致分析物信号的抑制。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是电喷雾电离质谱（ESI-MS）的一种有效替代方法，因为其性能受缓冲液组分、去垢剂和污染物的影响较小，能够以足够的准确度（≤ 500 ppm）测定完整蛋白质的分子量，用于序列验证。蛋白质经消化后，还可利用MALDI-TOF MS分析所得肽段，通过所谓的&#34;肽质量指纹图谱&#34;进一步确认其一级序列。
在我们看来，对于分子量大于100 kDa且具有异质性（由于修饰或截短所致）的完整蛋白质，使用MALDI-MS测定其分子量比使用ESI-MS更为简便。这主要是因为ESI谱图中存在重叠的电荷态分布，而MALDI-MS不存在这一问题。此外，由于MALDI过程不依赖于分析物的大小7，因此当生物大分子质量超过100 kDa时，该方法仍能保持高灵敏度。在20世纪80年代末至90年代初，已有研究利用自制仪器成功实现了对完整蛋白质的显著分析8-11。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）也可用作评估蛋白质样品质量的筛选工具，因其样品制备所需时间较短，且不易受到常见杂质（例如盐类）的干扰。通过MALDI-MS进行初步快速评估后，可进一步采用电喷雾电离飞行时间质谱（ESI-TOF）对样品进行分析，以获得更高准确度的分子量测定结果。此外，与ESI相比，MALDI产生的离子所带电荷较少，因此MALDI数据的采集与解析更为直接。这使得从事结构生物学研究的学生在经过短暂培训后，即可自行分析其重组蛋白质样品。
影响MALDI质谱图质量的两个关键因素是基质以及基质沉积所采用的技术。例如 干燥液滴 8 和薄层 12-16,17,18）。一种单一有机基质 [例如 芥子酸（SA） 19-21 或α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CHCA） 14,22,23] 常用于完整蛋白质及交联蛋白质复合物的质谱检测。Chait 团队先前使用 α-CHCA 报道了一种详细的超薄层制备方案，用于可溶性蛋白质和膜蛋白的 MALDI 分析14,15最近，Gorka 等 以石墨基靶材涂层改善使用α-CHCA为基质的肽和蛋白质的MALDI分析24.
本文介绍了一种利用两种基质混合物——2,5-二羟基苯甲酸（DHB）和α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CHCA）——通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析完整蛋白质的简单方案。 25我们系统评估了DHB-CHCA混合基质与SA及α-CHCA基质在完整蛋白质检测中的性能。该基质混合物可实现更高的分辨率（即 蛋白质峰更加尖锐）。此外，还存在强烈的多电荷离子即 M+2H2+，M+3H3+等）能够实现更精确的质量测定，因为轴向MALDI-TOF仪器在较低质荷比下的分辨率更高m/z) 26这对于分子量大于100 kDa的蛋白质测定尤为有用。
使用DHB-CHCA混合物时，灵敏度也更高（在MALDI靶上点样0.5 pmol蛋白质）。
如上所述，使用MALDI仪器时应考虑的一个重要因素是基质的沉积。Laugesen 等 首次提出使用DHB-CHCA混合物25，并采用干燥液滴沉积法。然而，我们发现当采用薄层法时结果更佳（例如，灵敏度显著更高），其中第一层由溶于丙酮的α-CHCA形成。薄层法12,27是指在MALDI靶板上形成一层均匀的基质晶体基底，该方法此前已在JoVE&#160;视频中有所描述15。随后将样品沉积于该基底之上，最后再沉积额外的基质（见下文）。本文还展示了如何将样品沉积到MALDI靶板上，以及如何清洗靶板15、重结晶并制备基质。
总之，我们的目标是为需要快速、简便地评估所制备蛋白质质量，但对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）尚不熟悉的科研人员（尤其是结构生物学家）提供分析完整蛋白质所需的全部必要信息。正如20世纪90年代中期所预测的那样28，随着质谱技术对生物学家的可及性不断提高，其对生物研究的影响也日益增强。我们希望所提供的信息有助于使生物学家以及希望开始使用质谱技术的科研人员更易于掌握和应用MALDI-TOF技术。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Trizma hydrochloride）</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Trizima）</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 6 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6221</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>Sartorius</td><td>VS0122</td><td>多种分子量截留规格</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fluka</td><td>14262</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fluka</td><td>02860</td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH SCIENCE 精密擦拭纸</td><td>Kimberly Clark</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#945;-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸</td><td>Fluka</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>GELoader 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>0030 001.222</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka</td><td>09676</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质标准品 II（Protein Standard II）</td><td>Bruker Daltonics</td><td>207234</td><td>包含胰蛋白酶原、蛋白A、牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>免疫球蛋白G</td><td>ABSciex</td><td>GEN602151</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>PURELAB Ultra Analytic 纯水仪</td><td>ELGA LabWater</td><td>89204-052</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex MALDI-TOF 仪器</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 靶板</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（maldi-tof）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kda）

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

准确测定蛋白质的分子量对于许多生物学研究至关重要例如 用于结构生物学研究）。精确的质谱测定可用于评估蛋白质一级序列的正确性、突变和/或翻译后修饰的存在情况、可能的蛋白质降解、样品的均一性，以及在标记情况下同位素掺入的程度。例如 13C 标记
电喷雾电离（ESI）质谱法（MS）广泛用于变性蛋白质的质量测定，但其效率受样品缓冲液组成的影响。特别是盐类、去污剂和污染物的存在会严重削弱ESI-MS对蛋白质分析的有效性。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱法是一种有吸引力的替代方法，因其具有耐盐性，且数据采集与解析更为简便。此外，由于MALDI-MS谱图中不存在ESI谱图中常见的高电荷态分布重叠现象，因此对大于100 kDa的大分子异质性蛋白质进行质量测定更为容易。
本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析分子量大于100 kDa蛋白质的简便方法。我们展示了使用两种基质混合物的优势，即 2,5-二羟基苯甲酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸）以及薄层法在样品点样中的应用。我们还讨论了基质和溶剂纯度、校准所用标准品、激光能量以及采集时间的关键作用。总体而言，我们提供了新手利用MALDI-MS分析分子量大于100 kDa完整蛋白质所需的必要信息。

我们采用两种不同的基质、两种点样方法以及相同的激光强度，对一种完整蛋白质（染色体区域维持1蛋白，Crm1；分子量：123,386 Da）进行了分析（图1）。所用基质为SA和CHCA_DHB混合基质。结果显示，混合基质在信噪比和灵敏度方面均获得了更高质量的质谱图（图1A和1B）。特别是，当蛋白上样量为0.5 pmol时，在MALDI靶板上仍可清晰检测到信号（图1C）；而使用SA基质时，相同量的蛋白几乎无法检测（图1D）。此外，在使用混合基质时，最佳的基质点样方法为“薄层法”（图1A）。若采用“干燥液滴法”，则无法检测到分子量高于100 kDa的任何蛋白信号（数据未显示）。使用CHCA_DHB混合基质（图1A和1C）时，观察到了该蛋白的多电荷离子，从而实现了更高精度的分子量测定，因为在轴向MALDI-TOF仪器中，峰分辨率与m/z26的平方成反比。
我们还分析了单体β-半乳糖苷酶（116,300 Da）（图2）。在灵敏度和分辨率方面，CHCA_DHB谱图优于SA谱图。此外，多电荷离子（M2+、M3+和M4+）的存在使我们能够更准确地确认蛋白质的分子量（图2A和2C）。采用薄层法，我们比较了CHCA_DHB混合物、SA以及单独使用α-CHCA在分析免疫球蛋白IgG（148,500 Da）时的性能（图3）。综合不同数据可见，CHCA_DHB谱图中的蛋白质信号更强且分辨率更高。综上所述，使用CHCA_DHB混合基质结合薄层沉积方法，在利用MALDI-TOF仪器获取大分子完整蛋白质质谱图的质量方面表现出显著提升。
<img alt="质谱图；m/z 谱图；蛋白质电离检测；峰强度分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 染色体区域维持蛋白 1（Crm1）完整分子的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析，分子量：123,386 Da。A) 使用 DHB_CHCA 混合物作为基质分析 1 pmole Crm1。 B) 样品量：1 pmole；基质：SA。 C) 样品量：0.5 pmole；基质：DHB_CHCA。 D) 样品量：0.5 pmole；基质：SA。 各谱图中峰信号以任意强度单位表示，并归一化至每条谱图中的最大值。
<img alt="质谱结果；m/z 谱图，蛋白质电离；图表显示多个电荷态。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 完整β-半乳糖苷酶（116,300 Da）的 MALDI-TOF 分析。A) 用量：20 pmol；基质：DHB_CHCA。B) 用量：20 pmol；基质：SA。C) 用量：5 pmol；基质：DHB_CHCA。D) 用量：5 pmol；基质：SA。
<img alt="质谱分析图；分子离子峰；蛋白质表征；CHCA基质。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 完整免疫球蛋白IgG（148,500 Da）的MALDI-TOF分析；上样量：1.7 pmol。 使用CHCA_DHB混合基质获得的谱图信号强度显著高于SA基质（最大值：1,200任意单位，au）和α-CHCA基质（最大值：4,500 au）的谱图（最大值：8,200任意单位，au）。

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100 kDa蛋白质的简便方法。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

准确测定蛋白质的质量对于许多生物学研究（例如结构生物学研究）至关重要。精确的质量……

本实验的总体目标是通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI质谱）对大于100千道尔顿的完整蛋白质进行高灵敏度分析。该目标的实现首先需要配制基质溶液，第二步是将薄层溶液点样至靶板上。接下来，将样品与基质混合液点样至靶板上。最后一步是在显微镜下观察样品点。最终，使用质谱仪分析完整蛋白质并记录质谱图。与电喷雾电离等其他分析方法相比，MALDI质谱的主要优势在于其对盐类、污染物和去污剂的耐受性更高。MALDI的另一个优势是其产生的离子所带电荷较少，相较于电喷雾电离。因此，MALDI数据的获取与解读相当直接简便。开始重结晶时，将10毫升40%乙醇倒入Pyrex烧杯中。然后在水浴和电阻加热器上加入600毫克基质。加热基质溶液并搅拌，直至基质完全溶解。重复上述步骤，直至溶液达到饱和。将溶液在室温下缓慢冷却数小时，然后在4°C下过夜保存。若未形成晶体，可用玻璃棒轻轻刮擦烧杯内壁液面以下区域，以诱导结晶。最后，通过过滤收集基质晶体。用少量冰冻溶剂冲洗烧瓶中残留的晶体，并进行过滤。过滤完成后，让晶体干燥，以清洁MALDI靶板。用甲醇冲洗，并用无尘纸轻轻擦拭。然后用水冲洗，并用无尘纸擦拭。将MALDI靶板插入600毫升烧杯中，并用50%乙醇覆盖。接着，将靶材置于乙醇溶液中，在超声波清洗机中处理10分钟。如果板上仍有残留物，则重复前述步骤。用甲醇或所使用的溶剂冲洗靶材，溶剂的选择决定了样品的扩散程度。然后倾斜靶板，使所有液体被吸水纸（Kim wipe）吸收。使用氮气气流干燥靶板。下一步，将α-CHCA溶解于丙酮中。为了制备饱和溶液，将10微升移液枪吸头浸入α-CHCA饱和溶液中，使少量溶液流入吸头内。用移液枪吸头迅速接触MALDI靶板，使用1.5毫升塑料管将α-CHCA溶液点样至MALDI靶板上。通过将α-CHCA溶解于体积比为7:3的乙腈与5%甲酸溶液中，配制成20毫克/毫升的α-CHCA溶液，并将该溶液标记为α-CHCA溶液。随后，通过将DHB溶于乙腈与0.1%三氟乙酸按7:3体积比配制的溶液中，制备20毫克每毫升的DHB溶液，并将该溶液标记为DHB溶液。将α-CHCA溶液与DHB溶液按1:1体积比混合，得到CHCA-DHB混合溶液。在开始本实验步骤前，可选步骤是参考所列文献中的缓冲液置换法对蛋白质样品进行纯化。否则，将未纯化的蛋白质样品点在MALDI靶板上。接着，取0.5 µL蛋白质样品点在已制备好的α-CHCA薄层上。随后立即加入0.5 µL的C-H-C-A-D-H-B溶液。在MALDI靶板上点样0.5微升的Cain标准品，然后加入0.5微升基质溶液。待样品和Cain干燥后，可在显微镜下观察结晶斑点，将靶板插入仪器中，并选择合适的仪器设置。随后选择合适的质荷比范围。获取钙的光谱，并使用适当的激光强度校准仪器。采集蛋白质样品的光谱。此处展示了完整染色体区域的MALDI飞行时间分析，以维持一种蛋白质。C-H-C-A-D-H-B 混合物在信噪比和灵敏度方面产生了更高质量的质谱图。特别是，当在 MALDI 靶板上点样 0.5 皮摩尔的蛋白质时，使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物可实现检测，而使用 SINO NIC 酸时，相同量的蛋白质几乎无法检测。此外，利用 C-H-C-A-D-H-B 混合物，观察到了蛋白质的多重电荷离子，从而实现了更高精度的质量测定，因为在轴向多反射飞行时间仪器中，峰分辨率与质荷比成反比。此外，使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物时，我们选择的基质沉积方法为薄层法。采用干燥液滴法时，质量高于100千道尔顿的蛋白质未被检测到。单体β-半乳糖苷酶蛋白也通过多级飞行时间质谱进行了分析。在灵敏度和分辨率方面，C-H-C-A-D-H-B谱图优于芥子酸谱图。此外，多电荷离子的存在使得能够以更高的准确性确认蛋白质的分子量。本文展示了采用 MALDI 分析完整免疫球蛋白的结果。使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物获得的质谱信号强度明显高于 SA 和 α-CHCA 的质谱。更具体而言，在 C-H-C-A-D-H-B 谱图中，蛋白质信号更强且分辨率更佳。使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物及薄层沉积方法，在完整大分子蛋白质的质量上表现出显著提升。质谱数据通过 MALDI 仪器获取。本方案介绍了如何使用多种仪器获取高质量的高分子量蛋白质质谱图。在进行此类分析时，有三点至关重要。首先，需使用 freshly prepared metrics solution。其次，正确地将样品沉积在Mali靶上。第三，使用适当的仪器设置，例如激光强度。

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