沙眼衣原体中的正向遗传学方法

本实验的总体目标是通过对沙眼衣原体进行化学诱变并确定基因型与表型之间的关联，从而开展遗传学分析。该目标首先通过化学诱变法获得沙眼衣原体突变株来实现；随后，利用全基因组测序鉴定所有化学诱变产生的突变，并进行参考基因组引导的基因组组装。

然后鉴定突变菌株中的表型与基因型关联。最后，通过构建重组菌株并对其进行分析，验证表型与基因型的关联。最终结果表明，通过经典化学诱变方法与新一代测序技术相结合，可揭示特定沙眼衣原体基因的突变导致了感兴趣的表型。

目前尚无可用于衣原体基因替换的方法，且用于其研究的分子遗传学工具仍处于初级阶段。该方法无需通过重组DNA进行转化，也无需开发分子遗传学工具，却能达到相同目的，即赋予单个基因产物以特定功能。

将大约1×10⁶个六孔板中的细胞以每25平方厘米3毫升的量接种于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C、5%二氧化碳条件下培养。约24小时后当细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并以感染复数（MOI）为5的沙眼衣原体感染细胞。在3毫升含200纳克/毫升环己酰亚胺的DMEM-FBS培养基中进行感染，以启动诱变。感染后18小时，在化学通风橱内，用含氯化钙和氯化镁的PBS配制20毫克/毫升的甲基磺酸乙酯（EMS）溶液。

EMS 是一种强效的诱变剂和致癌物。因此，请参照文字方案中的说明进行废弃处理。吸去 Vero 细胞的培养基，并用三毫升含氯化镁和氯化钙的 PBS 洗涤一次。

然后加入3毫升EMS溶液，在室温下的通风橱中孵育1小时。孵育结束后，移除EMS，并将其置于1摩尔氢氧化钠溶液中以灭活诱变剂，随后洗涤细胞三次以去除残留的EMS。接着加入6毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，其中添加200纳克/毫升环己酰亚胺和25微克/毫升庆大霉素，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。

在诱变后约36小时（即72小时时），包涵体中几乎无细菌。约10%的包涵体含有细菌，而其余包涵体则保持空置，以通过低渗裂解法提取原体（elementary bodies，EBs）。完全吸除培养基后，加入1毫升水，摇动10分钟以使细胞脱落，并通过上下吹打至少10次裂解细胞。

将裂解液收集至微量离心管后，加入0.25毫升5倍浓度的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液（SPG），使其终浓度为1倍，于-80摄氏度保存。在6孔板中接种约0.4 × 10⁶个细胞，每孔加入3毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，使Vero细胞形成汇合的单层，于37℃培养24小时使其形成均匀的单层细胞。随后将衣原体诱变剂储备液置于冰上。

然后在 DMEM 10%FBS 中进行六管十倍系列稀释，每管总体积为 200 微升，并将这些稀释液置于冰上。用每孔 3 毫升 PBS 对 Vero 细胞洗涤两次。然后在六孔板中每孔加入 3 毫升 DMEM，并以每孔 100 微升将细菌稀释液重复加样两次。

轻轻旋转培养板以确保混合均匀。将感染后的培养板在15°C条件下，以2,700 ×g离心30分钟。随后在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育1至2小时。

在此期间，通过先将以下成分混合，配制 DMEM 中 0.54% AROS 溶液。然后加入 18.9 毫升热的无菌水中的 1.2% AROS，边搅拌以防止结块。将混合液置于 55°C 水浴中保温。

吸去培养皿中的细菌悬液，加入6 mL温热的aro溶液。在超净台外的室温条件下使其完全凝固。然后在生物安全柜中移去皿盖，将平板再干燥15分钟。平板干燥后，置于37°C的二氧化碳培养箱中培养7至10天。

借助解剖显微镜，应在分离突变体前一天观察到菌斑。每孔100微升中含有1×10⁴⁰个细胞。在96孔板中，细胞将在24小时内达到汇合状态。

在解剖显微镜下标记待挑选的噬菌斑，然后使用无菌的1毫升带滤芯移液枪头吸取噬菌斑小块。将噬菌斑重悬于100微升DMEM培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）、400纳克/毫升环己酰亚胺和50微克/毫升庆大霉素，用于扩增突变株。将此悬液接种至汇合的Vero细胞单层上进行覆盖培养。

当感染细胞比例超过50%时，在培养收获干血斑前，以2,700 ×g、15摄氏度离心反应板30分钟；该感染比例最早可在感染后48小时出现，最晚可达14天。此比例的感染细胞可提供足量的活菌用于储存，并通过低渗裂解感染细胞提取囊泡。吸除培养基后，加入160 µL无菌水，在室温下孵育10分钟。

使用带滤芯的吸头通过反复吹打数次来裂解细胞，确保完全裂解。最后，将每份裂解液各160微升转移至微量离心管中，加入40微升5 XSPG溶液，混匀后于-80摄氏度保存，直至进行后续检测及突变体表型筛选。

接触诱变剂后，包涵体中几乎检测不到细菌，这可能是由于细菌细胞死亡所致。通常情况下，LGVL 2型血清型在感染后48小时内会完全裂解感染的细胞，但使用诱变剂处理可将这一周期延长至90小时以上，在我们的实验中约有10%的包涵体能够恢复。如本图所示，用20毫克/毫升EMS处理的感染Vero细胞，其感染性子代的回收率相比未处理对照组下降了99%。

诱变剂处理还导致出现形态改变的噬菌斑，包括小型噬菌斑。其他形态包括呈颗粒状、团块状或蜂窝状的噬菌斑，如此处所示。在这些研究中使用的EMS剂量可导致每KCL基因组产生3至30个突变，该结果通过NGS实验评估得出。

尽管经过梯度纯化的EBS基本不含宿主细胞物质，但在该操作流程后仍可检测到宿主DNA，约占基因组制备物的10%至15%。可开展表型筛选，例如在组织培养细胞中复制能力受损、生化活性丧失或细菌形态改变等，以回答其他问题，例如哪些细菌因子是形成和维持沙眼衣原体及致病因子所必需的。