Name: 正向遗传途径沙眼衣原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解沙眼衣原体的正向遗传学方法，通过化学诱变和全基因组测序建立基因型与表型关联。该技术为缺乏传统遗传工具的微生物研究提供了新途径。

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1. 化学诱变
注意：我们发现，与EB形态相比，复制型RB形态更易于进行化学诱变。在中期（感染后18至20小时），RB的数量达到峰值，此时尚未进入RB向EB的转化阶段。由于Chlamydia trachomatis是一种专性胞内病原体，诱变剂对宿主细胞健康的影响可能限制细菌的回收效率。实验发现，Vero细胞对高浓度EMS所产生的不良影响比其他测试的细胞系更具耐受性。
通过重组分离突变需要对抗生素抗性重组子代进行筛选。我们建议使用具有抗生素抗性的菌株（例如 利福平、壮观霉素或甲氧苄啶抗性菌株）来构建突变体，以便进行重组分析并分离同基因型菌株。抗生素抗性菌株是通过逐步筛选过程获得的（15, 16）。
注意：Chlamydia trachomatis&#160;（菌株 L2/434/Bu / ATCC VR902B）属于生物安全等级2级（BSL2）病原体。操作此类病原体时，请遵循机构的标准操作程序（SOP）。
<ol>
	<li>培养细胞的准备与感染：
	<ol>
		<li>接种约 1 x 106&#160;Vero 细胞（ATCC CCL-81），每 25 cm²2 (25 cm²) 培养瓶中加入 3 ml 添加 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2细胞应在24小时内形成融合的单层。</li>
		<li>吸弃培养基。用病毒悬液感染长满的Vero细胞T25培养瓶。 沙眼衣原体 感染复数（moi）为5（约14 × 106在总体积为 3 ml 的条件下&#160;的培养基（DMEM，200 ng/ml）&#160;环己酰亚胺，10% 胎牛血清（FBS）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在18小时开始诱变&#160;感染后小时（hpi）：
	<ol>
		<li>在化学安全通风橱中，将EMS（Ethyl methanesulfonate）配制成20 mg/ml的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，其中含0.9 mM氯化钙和0.49 mM氯化镁，因EMS为挥发性液体。 
		注意：EMS 是一种强效诱变剂和致癌物。使用 1 M 氢氧化钠中和 EMS 废物，并对溢出物以及塑料、纸张和玻璃器皿进行去污染处理。</li>
		<li>吸弃培养基，用 3 ml 洗涤细胞一次&#160;PBS/MgCl溶液2/CaCl2将细胞与3 ml含20 mg/ml EMS的PBS/MgCl溶液孵育2/CaCl2&#160;在室温下的通风橱中放置一小时。Vero细胞能够耐受此浓度的EMS以及在孵育箱外短时间的处理条件。请务必包含未进行诱变处理的对照样品。</li>
		<li>移除含有EMS的培养基，并将其置于盛有1 M NaOH的容器中以灭活诱变剂。用3 ml PBS + MgCl₂洗涤感染的细胞3次2/CaCl2&#160;以去除残留的诱变剂。加入6 ml含200 ng/ml环己酰亚胺和25 μg/ml庆大霉素的DMEM/10% FBS，于5% CO₂条件下孵育2，37 °C 培养 48–72 小时。约 36 小时后包涵体中可见无细菌&#160;诱变后72小时，约10%的包涵体充满细菌，其余仍为空。</li>
		<li>通过低渗裂解法提取EBs：完全吸除培养基，加入1.0 ml H2O 和岩石振荡 10 分钟以解离细胞。用移液器反复吹打至少 10 次以裂解细胞。将裂解液收集至微量离心管中，加入 0.250 ml 5x 蔗糖磷酸盐谷氨酸缓冲液（SPG），使其达到 1x 的终浓度。于 -80 °C 保存。 
		注意：可通过利福平抗性的诱导来评估诱变水平。为测定利福平抗性的频率，取1 x 10进行噬菌斑实验8&#160;以及在200 ng/ml利福平存在下对细菌进行7次10倍系列稀释。利福平耐药频率定义为利福平耐药菌落数除以铺板的总细菌数。有关菌落操作说明，请参见下文。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过噬斑纯化法对Chlamydia trachomatis&#160;突变株进行克隆分离
<ol>
	<li>在6孔板中接种Vero细胞，使其形成融合单层：每孔加入约0.4 × 106个细胞，溶于3 ml&#160;DMEM/10% FBS中。在接下来的24小时内，让细胞形成均匀的单层。</li>
	<li>将诱变后的Chlamydia储备液置于冰上解冻。在DMEM/10% FBS中进行6次10倍系列稀释，每次稀释总体积为200 μl，并置于冰上。 
	注意：包涵体形成单位（IFU）可较好地估算噬斑形成单位（pfu）。建议分别接种10、100和1000 pfu。</li>
	<li>用3 ml&#160;PBS每孔洗涤Vero细胞两次。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入3 ml&#160;DMEM，并加入100 μl细菌稀释液，每个稀释度设两个重复。轻轻摇动培养板以确保混合均匀。</li>
	<li>将感染后的培养板在15 °C下以2,700 × g离心30分钟，随后在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育1–2小时。</li>
	<li>制备0.54%琼脂糖DMEM溶液（用于6孔）：
	<ol>
		<li>加入以下成分：18.9 ml&#160;冷的2× DMEM、4.2 ml&#160;FBS、0.42 ml 100× NEAA、0.042 ml 200 μg/ml环己酰亚胺、0.021 ml 50 mg/ml庆大霉素。充分混匀。</li>
		<li>加入18.9 ml预热的无菌1.2%琼脂糖/H2O溶液，边加边搅拌以防止结块。混合液应手感温热。在接种至感染细胞前，将其置于55 °C水浴中保温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除培养皿中的细菌悬液，每孔加入6 ml&#160;0.54%琼脂糖/DMEM。在生物安全柜外室温下静置15分钟，使琼脂糖完全凝固。随后在生物安全柜中打开盖子干燥培养板15分钟。 
	注意：生物安全柜的振动可能影响琼脂糖的凝固过程。</li>
	<li>在37 °C、CO2培养箱中孵育7–10天。使用解剖显微镜可观察到噬斑。（参见图3以查看典型的噬斑图像。）</li>
	<li>在分离突变株前一天，于96孔板中每孔加入100 μl含1 × 104&#160;个Vero细胞的悬液。细胞将在24小时内达到融合状态。</li>
	<li>在解剖显微镜下标记待挑选的噬斑，使用无菌的1.0 ml带滤芯枪头采集噬斑组织块。</li>
	<li>将噬斑重悬于100 μl DMEM中，该培养基补充有10% FBS、400 ng/ml环己酰亚胺和50 μg/ml庆大霉素。</li>
	<li>为扩增突变株，将上述悬液覆盖于融合的Vero细胞单层上。在15 °C下以2,700 × g离心30分钟。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。当&#62;50%的细胞被感染时收获原体（EBs），最早可在感染后48小时，最晚可达14天。此感染比例可确保获得足够数量的可存活细菌用于保存。不同突变株的生长速率和感染能力存在差异。对于生长缓慢的菌株，应允许其自然再感染邻近细胞，直至足够数量的细胞被感染。</li>
	<li>通过低渗裂解法提取原体（EBs）：
	<ol>
		<li>彻底吸除培养基。</li>
		<li>加入160 μl无菌水，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>通过反复吹打使细胞充分裂解，使用带滤芯枪头以避免交叉污染。</li>
		<li>将160 μl裂解液转移至微量离心管中。</li>
		<li>加入40 μl 5× SPG溶液，混匀后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对突变株进行表型检测与筛选。</li>
</ol>
3. 选定Chlamydia&#160;突变体的全基因组测序
<ol>
	<li>从经梯度纯化的、基本不含宿主DNA污染的EBs中提取基因组DNA。Chlamydia的大规模培养及EBs纯化方案可参见参考文献(17)。使用商用基因组DNA纯化试剂盒（例如 Qiagen 货号 69504），按照制造商说明从2 × 109个细菌中提取DNA。</li>
	<li>使用荧光计（Qubit，Invitrogen 货号 Q32866）准确测定DNA含量。Illumina测序平台需要1–5 μg纯化后的DNA。 
	注意：可采用多种平台进行细菌基因组测序，包括基于Illumina/Solexa和SoliD的系统。我们选择使用HiSeq（Illumina），因其可产生高密度、短片段但高质量的测序读长。小型测序仪如IonTorrent（Life Technologies）和MySeq（Illumina）也同样适用，且足以同时对多达4个Chlamydia&#160;基因组进行多重测序，测序深度超过基因组组装所需的最低25X覆盖度。Illumina平台的测序文库制备方法如下所述。</li>
	<li>使用自适应聚焦声学S220仪器（Covaris），按照制造商推荐设置将DNA片段化至合适大小（Illumina测序适用300–400碱基对）。注意：采用喷雾法进行DNA片段化会导致样品因气溶胶化而损失更多。</li>
	<li>使用商用建库试剂盒（Illumina FC-102-1001）按照制造商说明制备基因组测序文库。可使用带条形码的引物（Illumina FC-121-1003）对文库进行加标，以便将多个样品混合后同时测序。</li>
	<li>运行测序样品。此步骤通常由商业服务公司或由专职技术人员运营的核心设施完成。请遵循其操作流程和建议。</li>
	<li>可使用用户友好的图形界面软件（如Geneious，Biomatters）将Illumina测序读长（FASTQ格式）比对至参考基因组，该软件也可用于SNP/突变鉴定。为定位突变，应将最小变异频率参数设为90%，最小覆盖深度设为50X。也可使用开源基因组组装工具，如MAQ（18）和BWA（19）。</li>
	<li>通过Sanger测序验证突变：以基因组DNA为模板，对已鉴定突变两侧300–500 bp区域进行PCR扩增，并对纯化后或稀释（1:20）的PCR产物进行Sanger测序。</li>
</ol>
4. 生成 沙眼衣原体 重组体
注意： 沙眼衣原体 可在感染过程中交换DNA，从而产生重组菌株（12, 13, 20）。在用两种具有不同抗生素抗性的独特菌株共感染细胞后，可获得重组体 &#34;子代&#34; 可被选为具有双重抗生素抗性（12, 13）。我们利用这一现象分离突变并构建同基因型菌株。因此，突变菌株在抗生素抗性背景下构建（例如 利福平耐药性（rifRH471Y 突变位于 CTL0567（rpoB）中，可使其与携带不同抗生素抗性等位基因的野生型菌株进行杂交（例如 壮观霉素抗性（spcR），r01/r02 中的 G1197A（16S RNA 拷贝 1 和 2）。有关 DNA 交换与重组的详细信息，请参见 沙眼衣原体，参见参考文献（12, 13）。
<ol>
	<li>共感染野生型和克隆突变株，通过离心6 x 105 将各菌株的细菌接种到生长于24孔板上的汇合Vero细胞单层中。同时，分别用每种菌株单独感染细胞单层。</li>
	<li>在感染后44小时，通过低渗裂解感染细胞收获EBs：
	<ol>
		<li>完全吸除培养基。</li>
		<li>加入 0.4 ml 无菌水，静置 10 分钟。</li>
		<li>通过剧烈吹打使细胞裂解 &amp;#38; 下吹打至少10次。将裂解液转移至微量离心管中。</li>
		<li>加入0.1 ml的5x SPG，使终浓度为1x SPG。</li>
		<li>粗裂解液可立即使用或于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将50 μl粗制EB制备物及其5倍1:10系列稀释液接种于添加适当抗生素以筛选重组子的琼脂糖/DMEM中。（有关筛选重组子常用的抗生素浓度，请见表格。）</li>
	<li>如上所述，通过噬菌斑纯化并富集重组菌株。根据所需表型的有无对重组子进行筛选评分。采用DNAzol处理法（见下节）提取重组菌株的DNA，用于基因分型以确认突变的有无。</li>
	<li>可使用携带其他抗生素抗性标记的菌株重复杂交，以进一步分离突变并产生同基因型菌株。将筛选出的重组子与携带不同抗生素标记的另一野生型菌株进行共感染。</li>
</ol>
表1：用于重组子筛选的抗生素浓度：
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>终浓度</th>
			<th>配制说明</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ng/ml 利福平</td>
			<td>用二甲基亚砜（DMSO）配制成 25 mg/ml 的储存液。将储存液用 H2O 稀释，配制成 200 μg/ml 的工作液。于 -20 °C 避光保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 μg/ml 甲氧苄啶</td>
			<td>用 DMSO 配制成 100 mg/ml 的储存液。于 -20 °C 保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 μg/ml 壮观霉素</td>
			<td>用水配制成 100 mg/ml 的储存液，分装为 100 μl 每份。于 -20 °C 保存。避免反复冻融。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
5. 重组菌株基因组DNA的提取用于基因分型
注意：也可使用基于柱的纯化试剂盒。采用DNAzol处理法提取DNA的优势在于成本较低。
<ol>
	<li>感染 1.2 x 105&#160;将衣原体接种至生长于12孔板中的Vero细胞单层。</li>
	<li>在感染后36-48小时，吸除培养基，加入0.375 ml DNAzol（Invitrogen 10503-027）。轻轻振荡细胞，用移液器将裂解液转移至1.5 ml离心管中&#160;微量离心管</li>
	<li>加入0.188 ml无水乙醇沉淀DNA，倒置混匀。</li>
	<li>用移液枪头缠绕法提取DNA，并将其放入干净的离心管中。或者，在最大转速下离心2分钟，使DNA沉淀成团&#160;在室温或4 °C下静置，倾去上清液。</li>
	<li>用1.0 ml洗涤DNA沉淀物两次&#160;75% 乙醇</li>
	<li>去除乙醇后，将DNA室温晾干15秒。</li>
	<li>用0.2 ml溶解DNA&#160;8 mM NaOH，然后用20.2 μl调至pH 8.0&#160;0.1 M HEPES。用水或TE缓冲液定容至终体积0.5 ml。或者，将DNA重悬于TE缓冲液中（DNA沉淀不会完全溶解）。</li>
	<li>使用DNAzol提取的DNA作为模板，通过PCR扩增已鉴定突变两侧的300-500 bp区域。对纯化或稀释（1:20）的PCR产物进行Sanger测序。</li>
</ol>

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</ol>

无任何披露内容。

该方法满足遗传分析的基本要求，因为它建立了基因型与表型之间的关联。重要的是，这一目标的实现无需依赖传统的分子工具进行重组DNA转化以及细菌基因的插入失活，而后者常常是分析非模式微生物基因功能时的限速步骤。
一个关键步骤是确保噬斑纯化突变体的单克隆性。若与野生型或“更具适应性”的突变体发生交叉污染，可能导致突变菌株迅速被竞争淘汰。同样，若对非单克隆样品进行全基因组测序以定位突变，可能得到模糊的结果。应避免从噬斑密集的孔中分离突变体，或挑取彼此过于接近的噬斑。此外，对于生长缓慢的突变体，回复突变体可能以相对较高的频率出现。我们建议保存原始或低代次的菌种。若怀疑存在交叉污染或回复突变体，应重新进行噬斑纯化。
可通过降低EMS的浓度来减少突变频率。据我们实验结果，EMS浓度为20 mg/ml时，突变率（通过利福平抗性变异株的产生来评估，该变异由编码RNA聚合酶的基因rpoB发生点突变所致）达到最佳。利福平抗性的诱导可通过在含利福平培养基中形成的噬斑频率进行评估，该频率应与化学诱导突变的频率相对应。
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专性胞内细菌Chlamydia trachomatis每年在美国造成约280万例生殖道感染（美国疾病控制中心），并可引发盆腔炎、异位妊娠和不孕等后遗症（1）。&#160;Chlamydia&#160;属细菌具有独特的生理特性，其发育周期为双相型，包含两种形态：具有感染性但不复制的原体（elementary body, EB）和无感染性但可复制的网状体（reticulate body, RB）。感染始于EB附着于上皮细胞，随后通过内吞作用进入细胞（2）。在由膜包被的空泡（称为包涵体）内，EB转化为RB形态，并通过二分裂方式进行复制。在周期中期，RB重新转化为EB，当宿主细胞裂解时，EB被释放到细胞外空间，以启动新一轮感染（3）。
C. trachomatis 对常规分子遗传学工具（如靶向基因替换、转座子和转导噬菌体）具有抗性，而这些工具在大多数细菌遗传学研究中至关重要。目前尚不清楚单个Chlamydia基因在多大程度上参与了逃避免疫识别、营养获取、发育转换或其他对病原体在真核宿主细胞内存活至关重要的过程（4）。因此，尽管该病原体具有重要的临床意义，其特性仍远未被充分阐明。
衣原体属（Chlamydia）的基因组相对较小（约1 Mb）(5)，目前已利用下一代测序技术对多个物种和生物变种进行了测序。通过全基因组测序（WGS）进行的比较基因组分析，为衣原体物种的进化及其对人类的适应性提供了独特见解(6-8)，并在一定程度上揭示了毒力因子潜在功能的相关信息(9, 10)。临床分离株所表现出的遗传多样性无法提供系统解析大多数毒力因子功能所需的分辨率，这可能是因为此类基因的突变容易受到自然选择的淘汰。在排除自然选择干扰的情况下，通过诱变诱导的基因变异，结合可明确检测毒力缺陷的实验体系，能够拓展可被检测的突变谱。尤其是化学诱变剂，因其可产生无效等位基因、条件型等位基因、功能减弱型（功能降低）以及功能增强型（功能获得）等位基因，因而具有重要应用价值。随着高效下一代基因组测序技术的发展，此类突变可被快速识别与定位。通过这一方式，可在特定基因或遗传通路的突变与共同表型之间建立强关联，从而实现正向遗传学方法的应用。
临床菌株的基因组序列揭示了血清型之间以及频繁发生重组的位点之间存在嵌合现象（11）。通过共感染两种不同抗生素抗性菌株并筛选出具有双重抗性的重组子代，实验证实了重组的存在，这些重组子代被证实含有来自两个亲本菌株的遗传成分（12, 13）。因此，在共感染条件下，野生型与突变型菌株之间的遗传交换可使化学诱导的突变发生分离，从而精确定位导致观察表型的相应基因。
本文介绍一种基于化学诱变、全基因组测序（WGS）以及在感染细胞内进行DNA交换系统的方法，用于对Chlamydia&#160;进行遗传学分析（14）（图1）。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>甲基磺酸乙酯（EMS） </td><td>Sigma</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Sigma</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 </td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>含 0.493 mM MgCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 0.901 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (PBS+MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x SPG缓冲液（1.25 M蔗糖，50 mM磷酸钠，25 mM谷氨酸）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG缓冲液（0.25 M蔗糖，10 mM磷酸钠，5 mM谷氨酸）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水（无菌，组织培养级）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x DMEM（由粉末配制，用7.4 g/L碳酸氢钠缓冲）</td><td>Sigma</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA） </td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1.2% GTG 琼脂糖，已高压灭菌</td><td>Lonzo</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>基因组DNA纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Life Technologies</td><td>10503-027</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（分子生物学级）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mM NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm² 组织培养瓶（T25 培养瓶）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔组织培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12孔组织培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学安全通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;用于旋转组织培养板的离心机及适配器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光计（Qubit）</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptive Focused Acoustics S220 仪器</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

沙眼衣原体中的正向遗传学方法

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis 是性传播疾病和眼部感染的病原体，由于难以通过重组DNA进行实验性转化，其遗传特性至今仍不甚清楚。尽管缺乏分子遗传学工具，我们仍建立了一种在 C. trachomatis&#160;中进行遗传分析的方法。该方法包括：i.) 化学诱变，以快速构建具有不同表型的、遗传背景明确的突变体文库；ii.) 全基因组测序（WGS），用于定位潜在的遗传缺陷，并找出突变基因与共同表型之间的关联；iii.) 通过将突变株与野生型细菌共同感染哺乳动物细胞，获得重组菌株。由此，我们得以确立基因型与表型之间的因果关系。将化学诱导的基因变异与全基因组测序相结合以建立基因型–表型相关性的策略，可广泛应用于目前难以进行遗传分析的众多医学和环境重要微生物。

暴露于诱变剂后，包涵体中通常无细菌存在，推测是由于细菌细胞死亡所致。通常情况下，LGV-L2 血清型在感染后 48 小时内会完全裂解被感染的细胞，但经诱变剂处理后，该周期可延长至 &#62;90 小时。大约有 10% 的包涵体可恢复生长。在我们的实验中，用 20 mg/ml EMS 处理的感染 Vero 细胞，其感染性子代的回收率相比未处理对照组下降了 99%。诱变剂处理还导致出现形态改变的蚀斑，包括小蚀斑（SPQ）（图 3）。其他形态还包括呈颗粒状、团块状或蜂窝状的蚀斑（图 3）。这些表型可能反映了在宿主环境中感染和存活所必需的某些生物学过程存在缺陷。具有小蚀斑（SPQ）形态的突变体通常产生的感染性子代显著减少，并可能需要长达 2 至 3 周才能扩增。在传代这些菌株时应格外谨慎，因为回复突变和抑制突变可能以较高频率积累。
这些研究中使用的EMS剂量可导致每个Chlamydia&#160;基因组产生3到30个突变，该结果通过全基因组测序（WGS）实验评估得出（图4...

我们描述了一种基于化学诱变和全基因组测序的Chlamydia遗传分析方法。此外，还介绍了一种可在感染细胞内实现DNA交换的系统，可用于遗传定位。该方法可能广泛适用于缺乏转化系统和分子遗传工具的微生物体系。

沙眼衣原体是性传播疾病和眼部感染的病原体，由于其……，目前仍缺乏充分表征

本实验的总体目标是通过对沙眼衣原体进行化学诱变并确定基因型与表型之间的关联，从而开展遗传学分析。该目标首先通过化学诱变法获得沙眼衣原体突变株来实现；随后，利用全基因组测序鉴定所有化学诱变产生的突变，并进行参考基因组引导的基因组组装。然后鉴定突变菌株中的表型与基因型关联。最后，通过构建重组菌株并对其进行分析，验证表型与基因型的关联。最终结果表明，通过经典化学诱变方法与新一代测序技术相结合，可揭示特定沙眼衣原体基因的突变导致了感兴趣的表型。目前尚无可用于衣原体基因替换的方法，且用于其研究的分子遗传学工具仍处于初级阶段。该方法无需通过重组DNA进行转化，也无需开发分子遗传学工具，却能达到相同目的，即赋予单个基因产物以特定功能。将大约1×10⁶个六孔板中的细胞以每25平方厘米3毫升的量接种于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C、5%二氧化碳条件下培养。约24小时后当细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并以感染复数（MOI）为5的沙眼衣原体感染细胞。在3毫升含200纳克/毫升环己酰亚胺的DMEM-FBS培养基中进行感染，以启动诱变。感染后18小时，在化学通风橱内，用含氯化钙和氯化镁的PBS配制20毫克/毫升的甲基磺酸乙酯（EMS）溶液。EMS 是一种强效的诱变剂和致癌物。因此，请参照文字方案中的说明进行废弃处理。吸去 Vero 细胞的培养基，并用三毫升含氯化镁和氯化钙的 PBS 洗涤一次。然后加入3毫升EMS溶液，在室温下的通风橱中孵育1小时。孵育结束后，移除EMS，并将其置于1摩尔氢氧化钠溶液中以灭活诱变剂，随后洗涤细胞三次以去除残留的EMS。接着加入6毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，其中添加200纳克/毫升环己酰亚胺和25微克/毫升庆大霉素，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。在诱变后约36小时（即72小时时），包涵体中几乎无细菌。约10%的包涵体含有细菌，而其余包涵体则保持空置，以通过低渗裂解法提取原体（elementary bodies，EBs）。完全吸除培养基后，加入1毫升水，摇动10分钟以使细胞脱落，并通过上下吹打至少10次裂解细胞。将裂解液收集至微量离心管后，加入0.25毫升5倍浓度的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液（SPG），使其终浓度为1倍，于-80摄氏度保存。在6孔板中接种约0.4 × 10⁶个细胞，每孔加入3毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，使Vero细胞形成汇合的单层，于37℃培养24小时使其形成均匀的单层细胞。随后将衣原体诱变剂储备液置于冰上。然后在 DMEM 10%FBS 中进行六管十倍系列稀释，每管总体积为 200 微升，并将这些稀释液置于冰上。用每孔 3 毫升 PBS 对 Vero 细胞洗涤两次。然后在六孔板中每孔加入 3 毫升 DMEM，并以每孔 100 微升将细菌稀释液重复加样两次。轻轻旋转培养板以确保混合均匀。将感染后的培养板在15°C条件下，以2,700 ×g离心30分钟。随后在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育1至2小时。在此期间，通过先将以下成分混合，配制 DMEM 中 0.54% AROS 溶液。然后加入 18.9 毫升热的无菌水中的 1.2% AROS，边搅拌以防止结块。将混合液置于 55°C 水浴中保温。吸去培养皿中的细菌悬液，加入6 mL温热的aro溶液。在超净台外的室温条件下使其完全凝固。然后在生物安全柜中移去皿盖，将平板再干燥15分钟。平板干燥后，置于37°C的二氧化碳培养箱中培养7至10天。借助解剖显微镜，应在分离突变体前一天观察到菌斑。每孔100微升中含有1×10⁴⁰个细胞。在96孔板中，细胞将在24小时内达到汇合状态。在解剖显微镜下标记待挑选的噬菌斑，然后使用无菌的1毫升带滤芯移液枪头吸取噬菌斑小块。将噬菌斑重悬于100微升DMEM培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）、400纳克/毫升环己酰亚胺和50微克/毫升庆大霉素，用于扩增突变株。将此悬液接种至汇合的Vero细胞单层上进行覆盖培养。当感染细胞比例超过50%时，在培养收获干血斑前，以2,700 ×g、15摄氏度离心反应板30分钟；该感染比例最早可在感染后48小时出现，最晚可达14天。此比例的感染细胞可提供足量的活菌用于储存，并通过低渗裂解感染细胞提取囊泡。吸除培养基后，加入160 µL无菌水，在室温下孵育10分钟。使用带滤芯的吸头通过反复吹打数次来裂解细胞，确保完全裂解。最后，将每份裂解液各160微升转移至微量离心管中，加入40微升5 XSPG溶液，混匀后于-80摄氏度保存，直至进行后续检测及突变体表型筛选。接触诱变剂后，包涵体中几乎检测不到细菌，这可能是由于细菌细胞死亡所致。通常情况下，LGVL 2型血清型在感染后48小时内会完全裂解感染的细胞，但使用诱变剂处理可将这一周期延长至90小时以上，在我们的实验中约有10%的包涵体能够恢复。如本图所示，用20毫克/毫升EMS处理的感染Vero细胞，其感染性子代的回收率相比未处理对照组下降了99%。诱变剂处理还导致出现形态改变的噬菌斑，包括小型噬菌斑。其他形态包括呈颗粒状、团块状或蜂窝状的噬菌斑，如此处所示。在这些研究中使用的EMS剂量可导致每KCL基因组产生3至30个突变，该结果通过NGS实验评估得出。尽管经过梯度纯化的EBS基本不含宿主细胞物质，但在该操作流程后仍可检测到宿主DNA，约占基因组制备物的10%至15%。可开展表型筛选，例如在组织培养细胞中复制能力受损、生化活性丧失或细菌形态改变等，以回答其他问题，例如哪些细菌因子是形成和维持沙眼衣原体及致病因子所必需的。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

正向遗传途径<em&gt;沙眼衣原体</em

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正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞，特别是巨噬细胞，来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma...

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沙眼衣原体中的正向遗传学方法

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