Name: 促进存活神经干细胞与纤维蛋白和生长因子鸡尾酒和分化的严重脊髓损伤后 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解利用纤维蛋白基质与生长因子促进神经干细胞存活和分化的方法，用于大鼠严重脊髓损伤修复。该技术有助于研究神经再生与功能恢复。

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感谢密苏里大学哥伦比亚分校的大鼠资源与研究中心提供GFP大鼠；感谢Neuralstem公司提供人神经干细胞。本研究得到了美国退伍军人事务部、美国国立卫生研究院（NS09881）、加拿大脊髓研究组织、Craig H. Neilsen基金会以及Bernard和Anne Spitzer慈善信托基金的资助。

所有动物实验方案均经美国退伍军人事务部圣地亚哥机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理与安全的指南。实验动物在整个研究期间可自由获取食物和饮水，并接受充分处理以最大程度减少疼痛与不适。
1. 含生长因子混合物的纤维蛋白组分的制备
<ol>
	<li>将25 mg大鼠纤维蛋白原溶解于0.5 ml PBS中，配制成50 mg/ml的2倍储存液（参见材料表）。纤维蛋白原较难溶解，需置于37 °C培养箱或水浴中，每隔5–10分钟摇动一次，持续1–2小时。</li>
	<li>将100 UN大鼠凝血酶溶解于2 ml 10 mM无菌CaCl2溶液中，配制成50 U/ml的2倍储存液。</li>
	<li>将生长因子溶解于PBS中，配制成以下浓度的100 μl储存液：1 mg/ml：BDNF；NT-3（高浓度储存液，用于体内鞘内输注in vivo19）；200 μg/ml：GDNF；IGF；bFGF；EGF；PDGF；aFGF；HGF（浓度约为细胞培养使用浓度的1,000倍）。</li>
	<li>将25 mg MDL28170（钙蛋白酶抑制剂）溶解于1.3 ml DMSO中，配制成50 mM的DMSO储存液，然后用PBS稀释50倍，得到1 mM的储存液。</li>
	<li>取每种生长因子组分各100 μl，加入100 μl MDL28170（1 mM储存液），混合配制成总体积为1,000 μl的生长因子混合溶液（图1）。</li>
	<li>将500 μl纤维蛋白原2倍储存液与500 μl生长因子混合溶液混合，得到含生长因子的25 mg/ml纤维蛋白原工作液，并分装为10或20 μl，于-70 °C保存。该溶液在-70 °C下可稳定保存长达12个月。</li>
	<li>同样，将500 μl凝血酶2倍储存液与500 μl生长因子混合溶液混合，得到含生长因子的25 U/ml凝血酶工作液，并分装为10或20 μl，于-70 °C保存，最长可保存12个月。</li>
	<li>在移植当天，将含生长因子的纤维蛋白原和凝血酶混合液置于冰上，直至与细胞混合使用。</li>
</ol>
2. T3 脊髓横断
<ol>
	<li>使用可接受的方法对成年雌性Fischer 344大鼠或裸鼠进行麻醉。当动物对尾部和足部夹捏无任何反应时，表明已达到深度麻醉状态。注意：我们通常使用150–200 g的Fischer大鼠或180–220 g的裸鼠，并采用麻醉混合液（2 ml/kg），其中包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（1.3 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.25 mg/ml）。</li>
	<li>在动物麻醉期间，涂抹眼膏以防止眼睛干燥或受损。</li>
	<li>剃除胸部上段区域的毛发，并用碘伏清洁皮肤。</li>
	<li>使用#15刀片切开皮肤和肌肉，用手术拉钩暴露T3椎骨，然后使用咬骨钳在T3椎骨处进行椎板切除，以暴露T3/4脊髓。</li>
	<li>使用#11刀片在硬脊膜上做一条长约2 mm的纵行正中切口。</li>
	<li>将虹膜剪置于硬脊膜下方，横断右侧整个脊髓侧索，并在同一侧再向尾侧1.5 mm处做另一切口。</li>
	<li>使用连接中等强度负压的钝头23 G&#160;针头抽吸两个切口之间的脊髓组织。通过视觉确认腹侧和侧方组织已完全切断，从而完成一侧脊髓半切。</li>
	<li>为将损伤扩展为全横断脊髓损伤，需在左侧脊髓半侧做对称的镜像切口。除最初的切口外，尽量保持硬脊膜完整，以便在两周后移植时能牢固地保留移植物/纤维蛋白基质于损伤部位。</li>
	<li>缝合肌肉层，涂抹抗生素粉末，并用皮钉闭合皮肤。</li>
	<li>术后立即注射乳酸林格液（3 ml）、Banamine（2.5–5 mg/kg）和氨苄青霉素（80–100 mg/kg）（见材料表），并将大鼠置于温暖的孵育箱中，直至体温调节功能恢复。</li>
	<li>每日两次排空膀胱，并注射林格液和氨苄青霉素溶液，持续约两周，直至建立反射性排尿功能（图1B）。</li>
</ol>
3. 胚胎第14天脊髓神经干细胞的原代分离制备
<ol>
	<li>从密苏里大学大鼠资源与研究中心获取近交系转基因 GFP F344 大鼠（F344-Tg(UBC-EGFP)F455Rrrc）。</li>
	<li>注射 40 &#956;g des-Gly10，[D-Ala6促黄体生成素释放激素乙酰胺（LHRH）用PBS稀释至浓度为200 &#956;每只性成熟雌性大鼠（8周龄或以上）在光照诱导2-3小时以同步化胚胎采集后，腹腔注射（IP）g/ml</li>
	<li>注射后第4天，与一只性成熟的GFP纯合子或杂合子雄性大鼠过夜交配。</li>
	<li>在交配后13.5–14.5天（p.c.）用冷的HBSS缓冲液收集胚胎，在荧光显微镜下观察GFP表达情况 &#34;NightSea&#34; 手电筒和滤光眼镜（BLS1 - BlueStar 手电筒和 VG1 型阻挡滤光片）或荧光显微镜。</li>
	<li>无菌条件下从每只GFP阳性胎鼠中取出脊髓，用虹膜剪和精细钟表镊去除表面的脑膜和附着的脊神经节。</li>
	<li>将解剖得到的脊髓组织收集到含有2 ml冷HBSS缓冲液的15 ml离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>参照文献编号 #20 的方法分离解剖所得的脊髓：
	<ol>
		<li>简而言之，向含有解剖所得脊髓组织的离心管中加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（可将多条脊髓组织合并消化，1 条脊髓可获得足够移植至一名受试对象的细胞），于 37 ℃ 消化 &#176;10–12 分钟，温度为 C</li>
		<li>通过向管中加入含有10%胎牛血清（FBS）的10 ml DMEM终止胰蛋白酶反应，并在2,500 rpm下离心组织2分钟。</li>
		<li>将组织重悬于 2 ml 含 2% B27 的 NeuroBasal 培养基中，使用经火焰抛光且口径逐渐减小的巴斯德吸管吹打匀浆脊髓组织。</li>
		<li>以 2,500 rpm 离心细胞 2 分钟，重悬于 2 ml 含 B27 的 NeuroBasal 培养基中，并用 40 μm 细胞滤网过滤细胞 &#956;m细胞滤膜筛</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞均等地分装至两个离心管中。</li>
	<li>离心细胞并彻底去除上清液（使用低真空吸头完全吸走上清液需要1-2分钟），以避免细胞重悬后残留的上清液稀释生长因子混合物。</li>
	<li>将每半份细胞分别重悬于含有生长因子的纤维蛋白原或凝血酶工作溶液中，细胞浓度为250,000个细胞/&#956;l（细胞沉淀计数约为 &#8531; 最终体积）并置于冰上，以备移植前使用（图1A）。请注意，纤维蛋白原在与细胞混合后、尚未与凝血酶在病灶/移植部位结合前，可能会发生自发凝胶化；为避免过早凝胶化，应在细胞移植前立即混合细胞与纤维蛋白原 体内.</li>
</ol>
4. 移植
<ol>
	<li>在脊髓横断术后两周，重新暴露损伤的T3/4脊髓区域。</li>
	<li>可通过封闭的瘢痕组织和完整的硬脊膜，直接将5 μl纤维蛋白原-细胞混合液和5 μl凝血酶-细胞混合液注射至损伤部位的九个位点，无需重新打开损伤区域。</li>
	<li>在损伤后1–2周，使用27 G针头在瘢痕组织和完整硬脊膜表面制造9个孔洞：中心区域3个（一个位于中点，两个位于侧方，彼此间隔0.5 mm），头端界面3个，尾端界面3个（分别位于损伤中心头侧或尾侧约0.5 mm处）。</li>
	<li>然后将纤维蛋白原-细胞溶液的一半体积注入损伤部位的三个中心位点，四分之一体积注入头端界面的3个位点，另四分之一体积注入尾端界面的3个位点。</li>
	<li>随后立即向相同位点注射凝血酶-细胞混合液。纤维蛋白原-细胞与凝血酶-细胞在损伤部位内混合后将形成纤维蛋白凝胶，以固定细胞位置，同时生长因子混合物可支持细胞存活。细胞注射使用连接至PicoSpritzer（General Valve, Inc.）的拉制玻璃移液管进行。</li>
	<li>按照上述相同步骤移植培养的人源NSCs21，并使用人源试剂制备的纤维蛋白及生长因子混合物。</li>
</ol>

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

神经干细胞（NSC）移植治疗脊髓损伤面临的主要难题之一，是移植细胞在损伤中心区域存活率低。损伤部位若存在任何空隙或空腔，均可能减少或削弱脑脊髓上行轴突与损伤下方分离的脊髓节段之间功能性神经环路的形成。此外，移植的神经干细胞存活率低可能影响其与宿主组织的整合，从而降低移植神经元与宿主神经元之间的连接性。可能导致细胞丢失的潜在机制包括急性脊髓损伤（SCI）所引发的细胞毒性微环境、宿主脊髓的继发性退变，以及损伤区域血管化不足4。
纤维蛋白已被用于在多种实验模型和临床应用中递送细胞、药物和生长因子，因为它在聚合后能够保留细胞和分子23。先前的一项研究表明，人源纤维蛋白封闭剂可作为生物基质，促进部分横断脊髓中的轴突再生，且未引起可检测到的不良反应24。我们此前曾利用纤维蛋白基质包埋骨髓基质细胞，并将其移植至慢性损伤的脊髓中17。移植细胞在慢性损伤部位存活良好，并与宿主脊髓实质组织实现了良好整合17。因此，我们进一步将纤维蛋白应用于包埋神经干细胞（NSCs），以将其移植至脊髓横断后形成...

脊髓损伤（SCI）不仅常常损害传递脑部信号的白质纤维束，还会损伤中央灰质，导致节段性中间神经元和运动神经元的丧失。SCI 的后果是损伤平面以下运动和感觉功能的丧失。遗憾的是，成年中枢神经系统（CNS）无法自发再生，从而造成永久性的功能缺陷1。因此，重建受损的成年脊髓，并改善运动、感觉及自主神经功能，是 SCI 研究的重要目标。无论是直接从胚胎或成年 CNS 中分离的神经干细胞（NSCs），都是替代丢失神经元和胶质细胞的有力候选细胞。此外，这些细胞具有形成新的功能性神经环路的潜力，以恢复轴突在损伤部位的传导功能2,3。
迄今为止，对于严重脊髓损伤（SCI）后移植神经干细胞（NSCs）所形成的神经元中继连接在解剖学、电生理学及行为学方面的效应，尚无详细阐明。造成这一现状的原因有多个：首先，移植的NSCs或胎儿中枢神经系统组织在植入较大的损伤空腔后存活率较低。既往研究表明，早期细胞丢失显著，最终留下较大的空洞性囊性损伤空腔4,5在某些研究中，移植的细胞会进一步分裂并填充病灶腔4,5，但这可能在数天至数周后才会发生，且后续病灶区域的填充可能不完全或不一致。其次，缺乏一种高效的追踪系统，以提供有关移植神经干细胞存活、分化/成熟及其突起生长的可靠数据。早期大多数研究采用顺行性和逆行性标记来追踪移植物的轴突投射2,3然而，这些技术仅能部分且通常不清晰地标记出移植物细胞发出的轴突投射，且示踪剂方法容易因染料从植入细胞外渗而产生人为假象。其他研究团队则采用人特异性神经元标志物，来标记人胎儿神经干细胞移植至损伤啮齿类动物脊髓后所形成的轴突投射5,6。然而，在这些研究中， 异种移植瘤 未能 consistently 存活良好。最近，病毒性 &#160;GFP 报告基因的递送用于标记培养的神经干细胞7,8然而，GFP的表达常常不一致，且可能被下调7近年来，使用稳定表达报告基因GFP或人胎盘碱性磷酸酶的转基因供体小鼠或大鼠，已显著改善了移植神经干细胞/前体细胞的追踪效果 体内9,11第三，多项研究表明 体外 源自胚胎或成年中枢神经系统的培养大鼠NSCs，当移植至完整或受损的成年脊髓微环境时，仅分化为胶质细胞谱系7,12,13，尽管这些神经干细胞具有分化为神经元和胶质细胞的能力 体外，表明局部微环境可能决定干细胞的命运。或者，培养的神经干细胞（NSCs），尤其是源自成体中枢神经系统的NSCs，可能具有向胶质细胞谱系分化的内在默认特性 体内13.
由于上述讨论的局限性，我们课题组近期开发了一种新方案，以改进在严重损伤的成年脊髓中对胚胎神经干细胞（NSC）的示踪、存活及其分化/成熟过程。简而言之，我们采用了一种稳定表达GFP报告基因的转基因Fischer 344近交系大鼠品系，该品系可在细胞中持续表达GFP 体内 移植14接下来，我们采用了从胚胎第14天Fischer 344大鼠脊髓中 freshly 分离的神经干细胞（NSCs），该发育阶段的细胞仍具有分化为神经元和胶质细胞的潜能。最后，我们将 freshly 解离的NSCs包埋于含有生长因子的纤维蛋白基质中15-17 以保留细胞并使其在较大的损伤腔内均匀分布，旨在支持移植物细胞的存活、分化和整合。移植物被植入脊髓损伤后两周的T3完全横断部位。这些移植的细胞持续填充完全横断区域，并分化为大量神经元，其轴突长距离延伸进入宿主脊髓18. 采用培养的人类神经干细胞移植物移植至免疫缺陷大鼠，也获得了类似结果18.

<table><tbody><tr><td>纤维蛋白原（大鼠）</td><td>Sigma</td><td>F6755-25MG</td><td>2 小时，37℃ &amp;deg;C 以溶解&lt;br/&gt; 储存浓度：50 mg/ml&lt;br/&gt; 终浓度：25 mg/ml</td></tr><tr><td>凝血酶（大鼠）</td><td>Sigma</td><td>T5772-100UN</td><td>用10 mM CaCl溶解&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 储存浓度：50 U/ml&lt;br/&gt; 终浓度：25 mg/ml</td></tr><tr><td>bFGF（人）</td><td>Sigma</td><td>F0291 (25 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>EGF（小鼠）</td><td>Sigma</td><td>E1257（0.1 mg）</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>BDNF（人）</td><td>Peprotech</td><td>452-02（1 mg）</td><td>储存浓度：1,000 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：50 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>NT-3（人）</td><td>Peprotech</td><td>452-03（1 mg）</td><td>储存浓度：1,000 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：50 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>GDNF（大鼠）</td><td>Sigma</td><td>G1401 (10 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>IGF-1（小鼠）</td><td>Sigma</td><td>I8779 (50 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>aFGF（人）</td><td>Sigma</td><td>F5542 (25 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l </td></tr><tr><td>PDGF-AA（人）</td><td>Sigma</td><td>P3076（10 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>HGF（人）</td><td>Sigma</td><td>H9661 (5 &amp;#956;g)</td><td>储存浓度：200 ng/μL&amp;mu;l&lt;br/&gt; 终浓度：10 ng/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>MDL28170</td><td>Sigma</td><td>M6690（25 mg）</td><td>DMSO 储存液&lt;br/&gt; 储存浓度：1 mM&lt;br/&gt; 终浓度：50 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td>工作浓度：1×&lt;br/&gt; 终浓度：1×</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>普特尼</td><td>26637-411-01</td><td>40-80 mg/kg&lt;br/&gt; 储存浓度：100 mg/ml&lt;br/&gt; 终浓度：25 mg/ml</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd</td><td>0410,</td><td>2.5-8 mg/ml&lt;br/&gt; 储存浓度：100 mg/ml&lt;br/&gt; 终浓度：5.8 mg/ml</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>巴特勒</td><td>003845</td><td>0.5-4 mg/ml&lt;br/&gt; 储存浓度：10 mg/ml&lt;br/&gt; 终浓度：0.25 mg/ml</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>健康宠物</td><td>BET16OZ</td><td></td></tr><tr><td>林格氏液</td><td>Abbott</td><td>04860-04-10</td><td>2-3 ml/次</td></tr><tr><td>Banamine</td><td>Schering-Plough</td><td>0061-0851-03</td><td>2.5-5 mg/kg&lt;br/&gt; 储存浓度：50 mg/ml&lt;br/&gt; 终浓度：0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>山德士</td><td>0781-3404-85</td><td>80-100 mg/kg&lt;br/&gt;终浓度：50 mg/ml</td></tr><tr><td>促黄体生成素释放激素</td><td>Sigma</td><td>L4513</td><td>200 &amp;mu;g/kg&lt;br/&gt; 终浓度：200 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-096</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>储存浓度：0.25 %&lt;br/&gt; 终浓度：0.125 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>储存浓度：100 %&lt;br/&gt; 终浓度：10 %</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>储存浓度：100 倍&lt;br/&gt; 终浓度：1×</td></tr><tr><td colspan="4">注意，移植人源NSCs时应使用人源试剂</td></tr></tbody></table>

严重脊髓损伤后使用纤维蛋白与生长因子混合物促进神经干细胞的存活与分化

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

神经干细胞（NSCs）具有自我更新能力，并可分化为神经元和胶质细胞。移植的神经干细胞可在脊髓损伤（SCI）后替代丢失的神经元和胶质细胞，并形成功能性突触连接，重新连接损伤部位上下方的脊髓节段。既往研究中，神经干细胞移植受到移植物在脊髓损伤腔内存活不完全的限制。此外，对移植物细胞存活、分化及突起延伸的追踪尚未优化。最后，在以往的研究中，培养的大鼠神经干细胞移植至受损脊髓后通常主要分化为胶质细胞而非神经元，除非通过特定手段引导其向特定细胞类型分化。为解决这些问题，我们开发了新方法，以提高神经干细胞在严重脊髓损伤部位的存活、整合与分化能力。神经干细胞从稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的Fischer 344转基因大鼠胚胎第14天（E14）脊髓中新鲜分离，并包埋于含有生长因子的纤维蛋白基质中；该制剂旨在将移植细胞保留在损伤腔内并支持其存活。在胸段第3节（T3）完全性脊髓横断损伤两周后，将含生长因子的纤维蛋白混合物中的神经干细胞进行移植，以避开炎症反应的高峰期。结果发现，移植组织完全填充了损伤腔，并分化为神经元和胶质细胞；其中神经元可向宿主脊髓内延伸轴突，延伸距离极长。表达GFP的人源神经干细胞移植也获得了类似结果。因此，本研究确立了改进神经干细胞移植、提高其存活率以及分析体内实验结果的方法。

GFP 免疫组织化学标记显示，悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中（不含纤维蛋白基质和生长因子）移植的鼠源神经干细胞在 T3 横断部位存活率极低，仅附着于损伤区与宿主组织的交界处，大部分损伤区域未见移植细胞填充（图 2A）。当神经干细胞与纤维蛋白基质单独共移植时，其存活情况有所改善，但移植物仍未能完全填充较大的损伤腔隙（数据未显示）。因此，我们将神经干细胞包埋于含有生长因子混合物的纤维蛋白基质中，以增强其在脊髓横断后的存活能力、对大范围损伤腔隙的填充能力，以及向神经元和胶质细胞的分化能力15-17。无论是大鼠还是人源神经干细胞，在移植后七周进行评估时，均能稳定且完全地填充损伤腔隙18（图 2B-C）。
我们进行了一项时间过程研究，以检测嵌入含生长因子混合物的纤维蛋白基质中的神经干细胞（NSCs）移植后早期的存活情况以及损伤腔隙的填充情况。组织学分析显示，表达GFP的NSCs在移植后24小时仍存活良好（图3A-B）。随着时间推移，移植的NSCs逐...

含有生长因子的纤维蛋白基质被用于将移植的神经干细胞固定在完全性脊髓横断损伤部位。移植的细胞完全填充了损伤空腔，并分化为多种神经细胞类型，包括能够向宿主脊髓长距离延伸轴突的神经元。

神经干细胞（NSCs）具有自我更新能力，并可分化为神经元和胶质细胞。移植的神经干细胞可在脊髓损伤后替代丢失的神经元和胶质细胞……

本实验的总体目标是提高移植到严重损伤的大鼠脊髓病变部位的神经干细胞的存活率和分化能力。首先，制造脊髓损伤，例如T3平面横断，除保留一小开口用于防止移植细胞外溢外，大部分硬脊膜保持完整。实验的第二步是从胚胎期14天的大鼠胎儿中获取 freshly dissociated 神经干细胞。第三步是将神经干细胞重悬于含有生长因子混合物的纤维蛋白基质各组分中。最后一步是将含有神经干细胞、纤维蛋白基质和生长因子的复合物移植到亚急性期损伤中心，并对转染后移植的脊髓进行免疫荧光显微镜检查。移植后七周可观察到神经干细胞存活情况良好，并分化为成熟的神经元，这些神经元向宿主组织延伸出大量轴突。与现有的将细胞接种于细胞培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中的方法相比，该技术的主要优势在于，纤维蛋白凝胶可将细胞保留在损伤中心，而粗脂肪混合物则能支持细胞的存活。尽管该方法可为了解神经干细胞在成年损伤脊髓中的生长和功能提供见解，但也可应用于其他系统，例如创伤性脑损伤。采用可接受的方法，对150至200克的成年雌性Fisher大鼠、344大鼠或180至220克的裸鼠进行麻醉，开始手术操作。等待动物深度麻醉，且对尾部和足部夹捏无任何反应后再进行下一步操作。随后涂抹眼膏，剃除胸部上部的毛发，并用碘伏清洁皮肤。使用15号刀片切开皮肤和肌肉，用手术拉钩暴露第三胸椎（T3），然后在第三胸椎处进行椎板切除术，以暴露第三至第四胸段脊髓（T3-T4脊髓）。接下来，使用11号刀片在DRA上做一道长两毫米的纵向正中切口。现在将虹膜剪置于Dora下方，横向完全切断右侧半脊髓。在同一侧再做另一道切口，距离上一道切口1.5毫米，随后用连接中等强度负压的钝头23号针头抽吸两切口之间段的脊髓组织。确保腹侧和侧方的横切均彻底完成。至此，完成侧方半切（HEMI）部分，使损伤延伸至全宽度的脊髓。在左侧半侧脊髓进行对称的切口。尽量保持完整无损的硬脑膜，以便其能够维持牢固的纤维蛋白基质移植物。两周后进行移植时，缝合肌肉，涂抹抗生素粉末，并固定皮肤。术后即刻情况。注射含有伊诺和氨苄西林剂量的三毫升乳酸林格液。然后将大鼠置于温暖的培养箱中，直至体温调节恢复。在接下来的两周内，每天两次排空膀胱，并注射林格液和氨苄西林溶液。当膀胱排空反射恢复时，可停止该操作。准备3至44只GFPF雌性大鼠，在胚胎收集当天注射DESI以同步胚胎收集，并使其与成熟的表达GFP的雄性大鼠交配。预先配制含有生长因子的纤维蛋白原和凝血酶混合液，并置于冰上保存，直至与细胞混合使用。在受孕后第13.5至14.5天，用冰冷的HBSS缓冲液收集胚胎。使用夜海手电筒配合滤光眼镜，或使用荧光显微镜检测胚胎中的GFP表达情况。随后，在无菌条件下，从每只GFP阳性胎鼠中分离出脊髓组织。用虹膜剪和精细镊子去除覆盖的脑膜，并分离脊神经节。然后将解剖出的脊髓收集到含有2毫升冷HBSS缓冲液的

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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