Name: 高解析度全山在原位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学习使用原位杂交技术检测斑马鱼胚胎中特定基因的时空表达模式。该方法通过优化探针制备和染色流程，显著提高低丰度转录本的检测灵敏度，同时有效降低非特异性背景信号，为发育生物学研究提供可靠工具。

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1. 整体装片 原位 斑马鱼胚胎杂交
1.1 胚胎的制备
<ol>
	<li>在所需发育阶段收集胚胎。请参见 Kimmel 等.5 用于描述胚胎发育阶段。</li>
	<li>使用镊子（Dumont 钟表匠镊子 5 号）手动去除卵膜。</li>
	<li>在4 °C下，用PBS（磷酸盐缓冲盐水）配制的4%多聚甲醛（PFA）溶液固定胚胎，过夜。</li>
	<li>用 PBS 在室温下清洗胚胎，每次 5 分钟，至少重复 3 次。</li>
	<li>将胚胎保存在 -20 °C 的 100% 甲醇（MeOH）中，直至后续用于整装标本等实验技术 原位 杂交。</li>
	<li>将处于不同阶段的胚胎在液氮中冷冻，用于RNA提取，并于-80 °C保存。</li>
	<li>从不同发育阶段的胚胎中提取RNA，并合成cDNA用于PCR扩增及后续克隆。</li>
</ol>
1.2 地高辛标记RNA探针的合成
<ol>
	<li>探针模板的PCR扩增与基因克隆。按照表1所示配制总体积为50 μl的PCR反应体系。在PCR反应中用作模板时，基因组DNA的用量应较多，cDNA的用量应较少。最后一个循环结束后，在72 °C延伸10分钟，以确保PCR产物全长且3'端带有腺苷酸化修饰，从而有利于TOPO克隆。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 缓冲液 (10x)</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物 (10 mM)</td>
			<td>各 1 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>加水至终体积</td>
			<td>49.7 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 聚合酶 (5 unit/μl)</td>
			<td>0.3 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反应体积 </td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. PCR扩增反应。
<ol start="2">
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的大小。用于探针合成的PCR产物预计大小接近1 kb。</li>
	<li>实验过程中需特别注意避免核酸酶污染，应在无菌条件下操作，并使用无核酸酶的水。如果观察到多个条带，应在使用TOPO TA克隆试剂盒进行克隆前，通过凝胶纯化获得正确大小的PCR产物。优化PCR反应条件以消除拖尾和多条带现象。</li>
	<li>按照表2所示进行TOPO克隆反应。将TOPO载体与PCR产物混合，室温孵育5分钟。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>化学感受态细胞</td>
			<td>电转感受态细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新鲜的PCR反应产物</td>
			<td>1-4 μl</td>
			<td>1-4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐溶液</td>
			<td>1 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释的盐溶液</td>
			<td></td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>加至总体积为5 μl</td>
			<td>加至总体积为5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO载体</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终体积</td>
			<td>6 μl</td>
			<td>6 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. TOPO克隆反应。
<ol start="5">
	<li>将TOPO克隆产物导入One Shot感受态细胞中。该过程称为转化。</li>
	<li>将转化后的细胞在37 °C、260 rpm条件下孵育至少1小时，以确保抗生素抗性基因的表达。取50–100 μl转化混合物，接种于预热的含50 μg/ml氨苄青霉素和X-gal的Luria Bertani（LB）琼脂平板上，37 °C过夜培养。</li>
	<li>根据菌落呈现白色或浅蓝色判断插入片段的存在。TOPO载体含有lacZ基因，该基因编码β-半乳糖苷酶。在X-gal存在下，β-半乳糖苷酶的表达会产生蓝色。当DNA插入质粒后会破坏功能性β-半乳糖苷酶的形成，从而产生白色菌落。白色或浅蓝色菌落表明插入片段存在。</li>
	<li>用无菌移液器吸头挑取琼脂平板上的白色菌落，转移至含有4 ml LB培养基的无菌10 ml离心管中，在37 °C、200 rpm摇床中过夜培养。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用质粒DNA试剂盒纯化质粒DNA。</li>
	<li>质粒纯化后，通过适当的限制性内切酶消化5 μg cDNA（每个探针）来线性化cDNA，该酶在插入片段的3'端（正义探针）或5'端（反义探针）具有唯一的酶切位点。</li>
	<li>采用酚/氯仿抽提法纯化线性化DNA。加入等体积酚/氯仿，剧烈涡旋振荡30秒，于4 °C、13,000 rpm离心3分钟。将上层水相转移至洁净离心管中，加入等体积氯仿，再次于4 °C、13,000 rpm离心3分钟。将上层水相转移至新的洁净离心管中。加入1/10体积的醋酸钠（3 M，终浓度为0.3 M）和2.5倍体积的100%乙醇以沉淀DNA，于-20 °C过夜保存。于4 °C、13,000 rpm离心15分钟。弃去乙醇，用75%乙醇洗涤沉淀。本实验步骤可在此暂停，DNA可在-20 °C保存，次日继续操作。于4 °C、10,000 rpm离心10分钟。小心弃去上清液，室温干燥沉淀2分钟。将沉淀重悬于10 μl经DEPC处理的水中，55 °C孵育20分钟。使用紫外分光光度计测定DNA浓度。</li>
	<li>取1 μl DNA样品在1%琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，运行约30分钟，以评估DNA纯度。</li>
	<li>设置RNA标记反应。在无RNase的反应管中，将1–5 μg纯化的模板DNA加入无菌、无RNase、经DEPC处理的双蒸水中，总体积为13 μl。将反应管置于冰上冷却，然后加入以下试剂（见 表3）：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP 标记混合物 (10x)</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转录缓冲液 (10x)</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase 抑制剂</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 聚合酶 SP6 或</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 聚合酶 T7</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终体积</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. RNA标记反应。
<ol start="14">
	<li>轻轻混匀试剂，然后在室温下以2,000 rpm短暂离心30秒，使液体沉至管底，并将反应混合物在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>加入2 μl无RNase的DNase I以去除模板DNA。在37 °C孵育30分钟，随后加入2 μl 0.2 M EDTA（pH 8.0）终止反应。</li>
	<li>加入2.5 μl 4 M LiCl和75 μl 100%乙醇沉淀反应产物。混匀溶液后于-20 °C放置45分钟，或在-20 °C过夜保存，次日继续后续步骤。</li>
	<li>在4 °C、13,000 rpm条件下离心悬浮液30分钟，然后用500 μl预冷至-20 °C的70%乙醇洗涤沉淀，再离心10分钟，干燥2分钟，溶于50 μl溶液中，并在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>取1–2 μl产物在1%琼脂糖凝胶上电泳约30分钟，以检测探针的质量和完整性。若凝胶上出现单一、大小符合预期的条带，则表明结果合格。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA含量，以确定探针浓度。本反应的RNA产量约为10 μg（100–200 ng/μl）。</li>
</ol>
1.3 整体装片 原位 杂交
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>再水化 
		<ol>
			<li>使用尼龙网（孔径小于1 mm）和Eppendorf管制备篮子。通过将Eppendorf管（1.5 ml）切割以去除锥形末端来构建篮子。为区分各个篮子，可使用不同颜色的管子，并将其中一半的管子顶部边缘切除。</li>
			<li>将尼龙网剪成小片，用于覆盖离心管的切口端。在通风橱内，将离心管切口端置于电热板（中高温度）上加热，使其粘附于尼龙网上。冷却后，去除篮状结构上多余的尼龙网，并将制备好的篮子置于室温的100%甲醇中保存。</li>
			<li>在六孔板的前三个孔中，用PBS配制甲醇的系列稀释液（75% [vol/vol] 甲醇、50% [vol/vol] 甲醇和25% [vol/vol] 甲醇），随后在接下来的三个孔中加入100% PBST（含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲盐水）。</li>
			<li>将受试胚胎进行处理 原位 使用定制篮子进行杂交的步骤如图所示 图1a 和 b使用无RN酶的溶液进行操作，直至在6孔板中进行杂交步骤（每孔4 ml）。为实现此目的，可将最多6个篮子置于第一孔中。先放置带边篮子，随后依次放入不同颜色的无边篮子。通过此种排列方式，可同时检测最多6种基因表达模式。</li>
			<li>将相同发育阶段的脱水胚胎放置于同一个篮子中（见 图1).</li>
			<li>将装有胚胎的篮子从六孔板的一个孔转移至下一个孔进行胚胎重水化（每步5分钟），共使用六个孔，每个孔中加入适量缓冲液。每个稀释梯度中胚胎仅处理一次，以此方式对胚胎进行6次洗涤，每次5分钟。通过逐步用PBS替代甲醇，随后用100% PBST洗涤3次，完成脱水胚胎的重水化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>透化 用蛋白酶K（10 μg/ml）在室温下消化复水后的胚胎，以使其通透，如图所示 表4.
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>胚胎期（受精后小时数） </td>
					<td>蛋白酶K消化时间 </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>最多6个</td>
					<td>15 秒</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>6-12</td>
					<td>30 秒</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>12-18</td>
					<td>3 分钟</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>24</td>
					<td>12-15 分钟</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>48</td>
					<td>25-30 分钟</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>72</td>
					<td>40 分钟</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>96-120</td>
					<td>50 分钟</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		 表4. 透化反应。 
		</li>
		<li>后固定及PBST洗涤
		<ol>
			<li>将胚胎在4%（质量/体积）多聚甲醛的1x PBS溶液中孵育20分钟以固定。</li>
			<li>用1×PBST洗涤胚胎3次，每次5分钟，以去除残留的多聚甲醛。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>乙酰化 制备乙酰化混合液（10 ml ddH₂O 中含 125 μl 三乙醇胺和 27 μl 乙酸酐）2O ），每次孵育10分钟。为最大限度减少内源性磷酸酶活性，乙酰化混合液需现用现配。为去除多余试剂，用PBST洗涤胚胎两次，每次10分钟。</li>
		<li>预杂交 将胚胎从篮子中转移至1.5 ml无菌Eppendorf管中，加入200 μl杂交混合液，在70 °C水浴中孵育2–4小时进行预杂交。</li>
		<li>抗体预吸附 从篮子中取出约50个胚胎，转移至1.5 ml无菌Eppendorf管中。用封闭缓冲液（1x PBST，2% 小牛血清 [vol/vol]，2 mg/ml 牛血清白蛋白 [BSA]）稀释抗DIG-AP抗体至1:500，加入胚胎中，在室温下孵育2–4小时，随后于4 °C过夜孵育。次日早晨从孵育器中取出，使胚胎恢复至室温。</li>
		<li>杂交 向预杂交的胚胎中加入100–200 ng探针，于70 °C水浴中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>SSC（氯化钠-柠檬酸钠）洗涤液
		<ol>
			<li>将装有杂交混合液（HM）、2×SSC 和 0.2×SSC 的 50 ml 离心管放入盛有水的烧杯中，置于 70 °C 水浴中预热至少 20 分钟。移除含有探针的杂交反应液，向各管中加入 1 ml 预热的杂交混合液，于 70 °C 孵育 15 分钟。用预热的 HM 在 2×SSC 中配制不同稀释比例的溶液，依次以 100%、50% 至 25% HM 更换六孔板中的液体，以去除过量试剂。</li>
			<li>等待期间，将六孔板中加入 2x SSC 用于洗涤，并置于 70 °C 下保温。</li>
			<li>15分钟后，将管中的胚胎转移至六孔板的篮子中，六孔板内装有HM与2x SSC的稀释液，通过将篮子依次转移至各孔中（每孔70 °C水浴中15分钟）洗涤杂交后的胚胎。在70 °C下用100% 2x SSC洗涤胚胎2次，每次15分钟。</li>
			<li>将另一水浴锅设定为 65 °C。向六孔板中加入 0.2x SSC，用于高严谨性洗涤，以避免转录本与探针发生非特异性杂交。</li>
			<li>胚胎在70 °C下用2x SSC洗涤两次后，再在65 °C下用0.2x SSC进一步洗涤两次，每次30分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PBST 洗涤 在六孔板中按以下顺序用 PBST 配制 0.2x SSC 的系列稀释液：75%（体积比）0.2x SSC、50%（体积比）0.2x SSC、25%（体积比）0.2x SSC，其余两孔加入 100% PBST。将杂交后的胚胎置于篮子中，依次从一个孔转移到下一个孔进行洗涤（每步 5 分钟，室温下使用摇床）。</li>
		<li>预孵育 在室温下用封闭缓冲液（1x PBST，2% 小牛血清 [vol/vol]，2 mg/ml BSA）预孵育胚胎 3–4 小时。</li>
		<li>与抗DIG抗体孵育 在4 °C下，用封闭缓冲液稀释的抗DIG-AP抗体溶液（1:5,000）避光孵育胚胎过夜，同时轻轻振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>PBST 洗涤 在六孔板中每孔加入4 ml PBST。将孵育后的胚胎连同篮子一起在六孔板的PBST中洗涤6次，每次15分钟。胚胎可在4 °C保存，并于次日继续实验步骤。</li>
		<li>预染色 用预染缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤胚胎2次，每次15分钟，随后在BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐）和NBT（硝基蓝四唑）存在下进行孵育。BCIP和NBT是用于碱性磷酸酶活性显色反应的底物。由于探针连接有碱性磷酸酶，紫色颜色的出现表明目标基因的表达。胚胎可在4 °C保存，并于次日继续后续实验步骤。</li>
		<li>染色
		<ol>
			<li>在避光条件下于室温用 BCIP 和 NBT 孵育胚胎 30 分钟。</li>
			<li>每30分钟使用体视显微镜监测染色反应。反应时间因基因表达水平而异，范围为15分钟至16小时。高表达基因所需时间较短，低表达基因所需时间较长。若目标基因表达互补的反义（AS）转录本，则正义探针可检测到信号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>终止反应 当达到理想的染色强度后，将装有胚胎的篮子转移至含有终止液（1x PBS，pH 5.5，1 mM EDTA，0.1% Tween）的孔中以终止反应，避免颜色进一步加深。在室温下，于摇床上以温和振荡方式用终止液清洗胚胎，每次10分钟，共清洗两次。</li>
		<li>后固定
		<ol>
			<li>将胚胎在含4%（wt/vol）多聚甲醛的PBS中孵育20分钟。</li>
			<li>用PBST清洗胚胎三次，每次5分钟，以去除残留的多聚甲醛。将固定后的胚胎置于终止液中，于4 °C避光保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>封片、观察与图像采集
		<ol>
			<li>将胚胎转移至含有100%甘油的六孔板中，尽量减少PBS的体积。将六孔板置于摇床，在室温避光条件下轻轻振荡过夜。</li>
			<li>将胚胎置于100%甘油中，然后在体视显微镜下观察信号。</li>
			<li>采集图像并保存为 TIFF 文件格式或其他支持使用 Photoshop 等图像软件生成高质量图像的文件类型图3-6).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 双重 In Situ 杂交
<ol>
	<li>为实现双重标记，采用上述1.1至1.3.1.7中所述方法，但在杂交过程中同时孵育地高辛（digoxygenin）和荧光素（fluorescein）标记的探针。</li>
	<li>按照相同的杂交后洗涤程序进行SSC和PBST洗涤（步骤1.3.2.1和1.3.2.2），以及封闭孵育（步骤1.3.2.3）。随后按以下说明依次进行抗体结合和染色反应。</li>
	<li>将胚胎与碱性磷酸酶（AP）偶联的抗地高辛抗体（1:5,000）在4 °C条件下轻柔振荡孵育。</li>
	<li>洗涤后使用BCIP-NBT进行显色（步骤1.3.3.1 - 1.3.3.6）。</li>
	<li>显色完成后，将胚胎在室温下用PBST洗涤两次，每次20分钟。</li>
	<li>将胚胎在含1 mM EDTA的PBST中于65 °C孵育30分钟，以灭活抗地高辛抗体。</li>
	<li>将胚胎依次在100%甲醇中孵育，随后用75%、50%和25%甲醇（溶于PBST）进行复水，最后回到PBST中，每步1小时。</li>
	<li>将胚胎在封闭缓冲液中与碱性磷酸酶（AP）偶联的抗荧光素抗体（1:2,000）于4 °C轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>用PBST洗涤胚胎（步骤1.3.3.1），并在加入Fast Red试剂前，用预染缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 8.2）在室温下轻柔振荡预染两次，每次15分钟。此步骤可暂停，胚胎可在4 °C轻柔振荡条件下保存，并于次日继续操作。</li>
	<li>在使用前立即用2 ml染色缓冲液溶解一片Fast Red试剂片。</li>
	<li>将胚胎放入含Fast Red试剂的染色缓冲液中，启动染色反应。</li>
	<li>当达到所需染色强度时停止染色反应。在室温下可能需要数小时，而在4 °C过夜染色则可能需要一至两天。若染色强度不再增强，或与正义对照相比出现非特异性染色，则应立即终止反应。</li>
	<li>后续步骤按照上述流程进行，包括固定后处理、封片、观察及图像采集（步骤1.3.3.5和1.3.3.6）。</li>
</ol>

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<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们已开发出可高分辨率可视化 RNA 的改进方法。原位杂交实验采用底部带孔的自制篮子进行（图 1）。胚胎在无RNA酶溶液中处理，于室温下在6孔板中无菌操作。
为了区分胚胎，使用不同颜色的Eppendorf管制作篮子。使用有边缘或无边缘的篮子便于定位，并识别篮子内的胚胎所对应的特定探针。
在65 °C下预杂交和在70 °C下杂交，同时使用50%去离子甲酰胺，对于获得高分辨率信号尤为关键。此外，在与抗DIG抗体孵育后，经PBST洗涤，再用碱性Tris缓冲液孵育胚胎两次，每次15分钟。 和 在含有BCIP和NBT的条件下孵育之前进行适当的处理，有助于获得高质量且清晰的信号。在我们的实验中发现，胚胎的透化和固定时间的精确控制，以及在70 °C下进行杂交，对于获得清晰信号至关重要。透化不足会导致背景信号升高；透化时间过长或固定不充分会引起胚胎降解，而固定时间过长则会抑制信号的检测。在55–60 °C之间进行杂交同样会产生较高的背景信号。 <strong...

斑马鱼（Danio rerio）已成为研究脊椎动物发育、疾病、行为以及药物筛选的强有力动物模型1-3。单次交配即可获得大量斑马鱼胚胎。其受精和发育过程在体外（ex utero）进行，胚胎具有良好的光学通透性且发育迅速。关键的发育事件发生在受精后的前48小时（hpf）内，包括器官原基的出现和细胞分化的启动。通过在单细胞或双细胞期（0.75 hpf）向胚胎显微注射反义吗啉代寡核苷酸（MO）或mRNA，可分别实现蛋白质的表达敲低或过表达。
斑马鱼胚胎的原位杂交（WISH）有助于研究特定目的基因的时空表达模式。在对胚胎进行mRNA或吗啉代寡核苷酸（MO）显微注射以过表达或敲低特定蛋白水平后，应用WISH技术可揭示其他基因的差异性调控情况。
基因表达模式的变化可与表型变化相关联，并揭示早期器官发生过程中靶基因的功能。由于探针可预先制备并储存，利用六孔板和自制的篮子，原位杂交（ISH）技术可同时检测至少20个基因的表达模式。

<table><tbody><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA 克隆试剂盒- 双启动子 pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini 质粒提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>罗氏</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 和 HindIII 限制性内切酶</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>超纯缓冲饱和酚</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C. 对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，且可能具有致癌性。操作时应小心谨慎。</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>有毒且疑似致癌物。请在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>无RNase的DNA酶I</td><td>罗氏</td><td>4716728001</td><td>分装成小份并置于 -20 保存&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DIG-RNA标记混合物（含Sp6、T7和T3 RNA聚合酶）</td><td>罗氏</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>罗氏</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M 醋酸钠 (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>商用酒精</td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC 对眼睛、皮肤和呼吸道具有刺激性。避免与皮肤和眼睛接触。使用安全眼镜、手套和口罩。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M（pH 8.0）</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>在 -20 ℃ 下准备并保存&amp;deg;分装为40 ml等份，以备后续使用。PFA具有毒性，操作时需佩戴护目镜、手套和防尘口罩。</td></tr><tr><td>苯硫脲（Phenylthiocarbomide, PTC）</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC 具有高毒性。使用时需佩戴护目镜、手套和防尘口罩。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙（钟表匠）&amp;rsquo;s) 镊子型号5号</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>六孔细胞培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>篮子由尼龙网和Eppendorf管制成</td><td>自行制备</td><td></td><td>制作篮子时，将Eppendorf管（1.5 ml）剪去锥形末端，可保留或不保留管口边缘。将尼龙网剪成与管口大小相应的小片&amp;nbsp;Eppendorf管被剪开的末端。将尼龙网覆盖在剪开末端的试管放置于电热板上&amp;nbsp;加热板加热至试管和尼龙网粘合在一起（在通风橱中操作）。剪去篮子上多余的网膜，并将其保存在100%甲醇中备用。</td></tr><tr><td>聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺，高纯度级</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 树脂</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>盐水-柠檬酸钠缓冲液（SSC）</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>酿酒酵母tRNA，X型</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺&lt;br/&gt; 无水（DMF）</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>刺激性、有毒、易燃，且疑似致畸物。操作时应穿戴适当的防护装备，包括手套和护目镜。</td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>避光保存此溶液。</td></tr><tr><td>硝基蓝四唑（NBT）</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>避光保存此溶液。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，纯化组分V（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>羊抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段</td><td>罗氏</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

本文重点介绍整体装片 原位 斑马鱼胚胎的原位杂交（WISH）。WISH技术有助于评估基因表达在组织分布和发育阶段两个方面的特征。本文描述了使用地高辛标记的反义RNA探针进行斑马鱼胚胎WISH的实验方案。探针通过将地高辛标记的核苷酸掺入到转录过程中而生成 体外 对已克隆并线性化的基因模板进行转录。在特定发育阶段收集的胚胎，需先去除卵膜，再与特异性探针孵育。经洗涤步骤去除多余探针后，将胚胎与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育。通过使用碱性磷酸酶的显色底物，可检测特定基因的表达情况。根据基因表达水平的不同，整个实验过程可在2至3天内完成。

采用每篮50个胚胎（每个基因/每种实验条件）的方案，可在一次实验中获得该基因的表达模式。对于特定基因，几乎所有胚胎均显示出相似的表达模式。原位杂交染色的代表性结果如图3-6所示。
正义与反义核糖探针均从对应于 PC5.1 和 PC5.2 的 cDNA 合成6SCL/tal-17, gata-18,9，flk/kdrl10，shh11，dlx212，fkd7/foxa113胰岛素14,15和胰蛋白酶16 通过使用Taq DNA聚合酶扩增全长mRNA的一段序列，构建了克隆并插入pCRII-TOPO载体（Invitrogen）。各个扩增产物的真实性通过测序确认。在验证克隆方向后，按照相应方案合成对应的反义RNA探针17 经修改18,19 如文中所述，使用 Sp6 或 T7 RNA 聚合酶。整体染色标...

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位 杂交。我们改进的方案能够检测丰度较低的转录本，同时降低非特异性背景信号。

本文重点介绍斑马鱼胚胎的整装原位杂交（WISH）。WISH技术有助于评估基因表达……

本实验的总体目标是评估特定目的基因在不同发育阶段斑马鱼胚胎中的时空表达模式。首先通过体外转录法，将地高辛标记的核苷酸掺入，从而合成cDNA探针；随后，在确定的发育阶段收集胚胎。去除蜕膜后，将胚胎保存在负20摄氏度的甲醇中。随后经过消化和后固定处理，胚胎与相应的探针进行杂交。最后，使用抗地高辛抗体和抗体对胚胎进行染色，并用碱性磷酸酶的底物显色。最终，通过整体原位杂交和成像技术，可以获得特定发育阶段基因表达在组织中的分布结果。尽管该方法能够深入揭示目标基因的正常表达情况，也可应用于其他条件下的研究，例如在疾病模型中目标基因的表达，或其他基因过表达或低表达时的情况。利用显微注射技术，针对目的基因的cDNA，在无RNase的反应管中加入1至5微克纯化的模板DNA，并用经DEPC处理的无RNase双蒸水补至13微升体积，从而建立RNA标记反应，以合成地高辛标记的RNA探针。将反应物置于冰上冷却，轻轻混匀后加入以下试剂，室温下以2000转/分钟离心30秒。随后在37摄氏度孵育反应2小时。孵育结束后，加入2微升无RNase的DNase I，在37摄氏度孵育30分钟以去除模板DNA。加入2微升0.2摩尔EDTA终止反应。通过加入2.5微升4摩尔氯化锂和75微升100%乙醇沉淀反应产物。混匀溶液后，在负20摄氏度孵育45分钟或过夜。在4°C、13,000 RPM条件下离心悬浮液30分钟。离心10分钟后，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。干燥沉淀2分钟，然后将其重悬于50微升无核酸酶的双蒸水中。然后在37摄氏度下孵育30分钟。取一到两微升探针在1%琼脂糖凝胶上电泳约30分钟，以验证其质量和完整性。随后使用分光光度计对探针进行定量，用于重悬先前固定并冷冻的胚胎。首先，通过剪切1.5毫升微量离心管的锥形末端来制作小篮。然后将其中一半的管口顶部边缘去除。剪取小块尼龙网覆盖管口末端，接着在通风橱内，将管端放在电热板上加热，待冷却后压入尼龙网中。去除多余的尼龙网，并将篮子置于室温下的100%甲醇中保存。根据文本方案配制PBS中的甲醇梯度稀释液，并将每种稀释液各四毫升加入六孔板的各个孔中，将每个探针对应的胚胎放入单独的篮子中，依次在甲醇-PBS梯度溶液中孵育，每孔5分钟，最后用PBST洗涤三次。使用蛋白酶K在室温下对胚胎进行通透处理，不同发育阶段的孵育时间如下。然后将胚胎置于含4%多聚甲醛的PBS中固定20分钟，并用PBST洗涤三次，每次5分钟。接着根据文本方案配制乙酰化混合液，将胚胎分别孵育两次，每次10分钟。然后用PBST洗涤胚胎两次，每次10分钟。将胚胎转移至无菌微量离心管中，加入200 µL杂交混合液（HM），于70 °C水浴中孵育2至4小时。向溶液中加入100至200 ng探针，于70 °C水浴中孵育过夜。用预热的HM替换探针溶液，于70 °C水浴中继续孵育样品15分钟。将样品经过 H

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高解析度全山<em&gt;在原位</em杂交斑马鱼胚胎内，研究基因表达和功能

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

本文介绍了一种快速对斑马鱼胚胎心脏进行免疫染色的方法。与整体免疫染色法相比，该方法显著增强了抗体的渗透性，可在更短的处理时间内获得高分辨率图像，从而清晰显示心脏中的细胞/亚细胞结构。...

解剖的斑马鱼胚胎心脏免疫染色

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。...

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH)...

用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

本文描述了在整只斑马鱼胚胎中对磷酸化表位进行免疫染色的技术，并进一步在小至初级纤毛的细胞结构中进行双色荧光共聚焦定位。这些固定和成像技术可用于确定特定蛋白质出现或激活的位置及其动力学特征。...

对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

纤毛发育对正常器官形成至关重要。本方案描述了一种优化的方法，用于标记和观察斑马鱼的纤毛细胞。...

通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。...

一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

本文介绍了一种利用荧光抗体在斑马鱼胚胎和幼鱼整体样本中检测蛋白质的实验方案。...

斑马鱼胚胎和幼鱼的整体免疫组织化学染色

本方案描述了如何通过结合获取图像的方法 原位 斑马鱼胚胎切片的杂交与免疫组织化学 原位...

原位 杂交联合免疫组织化学在冰冻切片斑马鱼胚胎中的应用

学习使用原位杂交技术检测斑马鱼胚胎中特定基因的时空表达模式。该方法通过优化探针制备和染色流程，显著提高低丰度转录本的检测灵敏度，同时有效降低非特异性背景信号，为发育生物学研究提供可靠工具。

高分辨率整体成像原位斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

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