Name: 活性检测在培养细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习多种细胞活性检测方法，通过测量ATP水平评估代谢功能，并结合红外免疫染色与成像技术全面分析细胞结构与生理状态。该方法为神经科学和药理学研究提供客观可靠的细胞健康评估手段。

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我们感谢Juliann Jaumotte提出在ATP检测中节约试剂用量的想法。我们深切感谢Mary Caruso、Deb Willson和Jackie Farrer提供的出色行政支持，同时感谢Mylan药学院为本研究提供的经费支持。此外，我们还要感谢Hunkele疑难疾病基金会以及帕金森病与运动障碍基金会对原代神经元研究提供的经费支持。

各实验方案的示意图见图1。
1. 细胞接种
在96孔板中以不同的接种密度接种细胞（图2）。对N2a神经母细胞瘤细胞系进行线性检测时，每孔分别接种2.5k、5k、10k和15k个细胞，每组设3或6个复孔。对大鼠原代皮层神经元进行线性检测时，每孔分别接种25k、50k、100k和200k个细胞，每组设3或6个复孔。如果目标细胞系或原代细胞在不同接种密度下形态健康，应选择该细胞类型的最佳接种密度及其附近密度进行接种。
注意：在本研究中，N2a 细胞以 100 μl 培养基接种，原代皮层神经元以 200 μl 培养基接种于设计用于减少蒸发的培养板中。有关细胞处理、培养基、血清、抗生素及毒素处理的详细信息，请参见 Unnithan et al. 关于 N2a 细胞的研究8 和 Posimo et al. 关于原代皮层培养物的研究22。
<ol>
	<li>
		<ol>
			<li>在第二个96孔板上重复铺板。一个孔板用于ATP检测（图2A），另一个用于红外检测（图2B）。不能使用同一块孔板进行ATP和红外检测，因为细胞必须裂解以测定胞内ATP含量。</li>
			<li>确保在最佳铺板密度下（第2列；图2B），为红外检测至少额外铺设3个孔用于背景扣除。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>在A行和H行以及第1列和第12列的外周孔中加入不含细胞的培养基，或更经济地使用无菌水。应避免使用边缘孔的数据，因为这些区域常因培养基蒸发和温度梯度的影响而导致细胞活力较低。微孔板中的此类问题通常称为边缘效应23,24。切勿让这些孔保持空置，否则B行和G行以及第2列和第11列也会受到边缘效应的影响。 
		可通过将新接种的孔板在转移至CO2培养箱前于常温环境下静置孵育，以减少边缘效应24。此外，Carralot最近的一项研究描述了一种利用单个对照列对微孔板数据进行数学校正的方法23。Oliver及其同事则使用一种特制的强制通风微孔板培养箱来降低热梯度25。如果边缘效应问题较为显著，可购买微孔板稳定培养舱（例如 BT&amp;#38;C Incorporated）以建立高湿度、温度均匀的微环境。</li>
	<li>若因需测试更多试剂稀释度或更多铺板密度而需要比图1所示更多的孔，则可利用边缘孔进行背景扣除。</li>
	<li>静置过夜以待细胞贴壁，次日早晨按如下所述进行检测。</li>
</ol>
2. 发光法ATP检测
<ol>
	<li>按照 Cell Titer Glo 试剂盒生产商的建议，使用缓冲液重悬底物，并遵循推荐的孵育时间。
		<ol>
			<li>分别从 100 或 200 μl 铺板培养基中移除 50 或 150 μl 培养基，每孔中约剩余略少于 50 μl。向第 2 至第 6 列加入 25 μl 试剂（底物加缓冲液），进行 1:2 稀释（图 2A）。 
				注意：移除培养基后残留体积的差异可能导致 ATP 检测试剂在不同孔中的稀释或浓缩程度不一致。操作时应确保多通道移液器各枪头中的液面高度一致。在加入 ATP 检测试剂前，立即使用移液器测量板中若干代表性孔的残留液体体积，以保证准确性。若因板面不同区域蒸发速率差异导致显著变异，可在加入 ATP 检测试剂前，将所有旧培养基完全移除，并向各孔加入等量的新鲜培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）。若板存在蒸发不均问题，可尝试改用 Corning Costar 生产的低蒸发板。在后者中，如 图 2 所示的 60 个内圈孔位，过夜平均蒸发量仅为 0.995%±0.41%。因此，在检测时培养基体积的差异可忽略不计。</li>
			<li>在第 7 至第 11 列、B 至 D 行的孔中，移除适量培养基，使每孔剩余 50 μl（具体操作如上所述），然后加入 50 μl 试剂，进行 1:1 稀释。</li>
			<li>在第 7 至第 11 列、E 至 G 行的孔中，保持细胞处于 100 μl 培养基中，加入 100 μl 试剂，同样进行 1:1 稀释。该公司建议将 100 μl 试剂与 100 μl 培养基以 1:1 比例稀释。 
				注意：为节约成本，可考虑减少试剂体积或调整稀释比例。但在实施前，需确认该调整不会降低检测的线性范围和灵敏度。</li>
			<li>一旦确定某一特定试剂体积和稀释倍数效果满意，则在后续所有实验中保持一致。满意数据的标准详见结果部分。</li>
			<li>未使用的重悬试剂可重新冷冻保存，以备后续使用，从而降低成本。根据生产商说明，重悬后的试剂在 -20 °C 可保存 21 周，活性损失约为 3%。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>将板置于轨道摇床上震荡 2 分钟，或置于旋转摇床上震荡 10 分钟。若板的部分区域需用于其他检测而不能震荡，则仅对目标孔进行简单的上下吹打以混匀培养基。但此步骤中产生的过多气泡会干扰发光信号。
		<ol>
			<li>加入试剂后 10 分钟，将每孔中的 60 μl 液体转移至白色 96 孔板中。白色板的发光值高于透明或黑色板，因其可将光反射至检测器方向。 
				注意：根据我们的经验，细胞在 Corning Costar 生产的低蒸发透明板上的存活状态优于其他类型板。然而，此类板不提供白色孔壁版本。其次，不透明孔壁、透明孔底的板比完全透明板更昂贵。若将发光液体转移至白色板中，则白色板可清洗后重复使用，从而避免每次实验均使用新的白色板，长期来看更为经济。</li>
			<li>在读板前用针头或更优地使用塑料移液器吸头吹出的气流消除任何气泡。使用化学发光仪检测，积分时间为 1 秒（该公司建议 0.25–1 秒已足够）。在加入 ATP 检测试剂后 10–12 分钟读取板。由于发光信号具有短暂性和快速衰减特性（如 Gilbert 及其同事26所示），因此不同板之间的检测时间必须严格一致，以确保可比性。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>计算每组 3 或 6 个孔的发光值平均值，并以细胞数量为自变量绘制散点图（见 图 3）。首先从每个数据点中减去相应空白孔（2B–2G、11B–11D 和 11E–11G 孔）的平均背景发光值。在本初始实验中，每个铺板密度对应三个不同的组（图 2A）。ATP 水平可能与其中一个或所有组的细胞密度呈线性相关。为节约成本，应选择仍能获得满意结果的最高试剂稀释度。满意结果的标准详见结果部分。 
		注意：在本研究所用培养基条件下，该检测的背景值较低，可省略空白孔。然而，生产商 Promega 报道不同培养基会导致发光值差异。本研究使用 Hyclone Fetal Clone III（一种用于 N2a 细胞的胎牛血清合成替代物）和用于原代皮层培养的牛犊血清。据生产商说明，犊牛血清会降低发光值，但不会降低检测的灵敏度。尽管如此，若对此问题较为关注，可在检测时将 ATP 检测试剂稀释于 PBS 而非培养基中。
		<ol>
			<li>若观察到细胞在过夜培养后在各列间生长不均，可尝试在铺板后 6 小时内进行检测。但需注意，检测时的细胞密度（例如处理后 24 小时）必须达到线性关系所要求的密度。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. 红外检测
<ol>
	<li>铺板后的第二天早晨，在通风橱中于室温下固定第二块培养板中的细胞。此步骤务必佩戴手套，并将固定液作为化学废物妥善处理，因为甲醛具有致癌性。向现有培养基中加入终浓度为4%的甲醛和4%的蔗糖溶于0.1 M磷酸盐缓冲液的溶液，进行1:1稀释。也可在固定前先用PBS洗涤去除培养基，再使用全浓度固定液。两种方法均有效。
		<ol>
			<li>在固定液中孵育20分钟，随后去除固定液，并用200 μl PBS洗涤3次。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>若当天不进行检测，可将培养板置于含0.2%叠氮化钠的PBS中，于4 °C保存。否则应继续进行检测，并将细胞置于封闭液中以最大程度减少抗体的非特异性结合。
		<ol>
			<li>用PBS将鱼血清Odyssey封闭液按1:1稀释，并加入0.3% Triton-X 100作为细胞通透剂。配制足够量的封闭液，以及一抗和二抗溶液，确保每孔可加入35 μl。然而，若在加样过程中观察到大量气泡，则建议每孔加入&#62;50 μl，否则气泡会深入孔底影响细胞，阻碍抗体结合。过多的泡沫状气泡会在孔中央形成未染色的圆形区域。若出现此情况，请尝试调整加样操作。</li>
			<li>在封闭液中于室温孵育30–60分钟。 
				注：为节省鱼血清封闭液的成本，也可使用5%牛血清白蛋白或与二抗同源物种的正常血清作为封闭液。封闭液可能影响抗体性能，因此每种抗体的最佳封闭条件应通过实验确定。 
				注：部分研究人员在孵育过程中将细胞内Western板置于摇床上，但此操作并非必需。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>配制一抗溶液：抗α-微管蛋白抗体（小鼠单克隆，表1）按1:10,000稀释；抗MAP2抗体（小鼠单克隆，表1）按1:2,000稀释。这些抗体针对本细胞模型中目标蛋白具有特异性；特异性是任何免疫细胞化学染色的关键。 
		注：MAP2是神经元的标志物，适用于神经元/胶质细胞混合培养。本研究所示的出生后培养物中也含有部分胶质细胞（约25%），因为星形胶质细胞最早出现在胚胎第18天，其数量在新生儿早期达到高峰27,28。在ATP和DRAQ5 + Sapphire检测中无法区分星形胶质细胞与神经元。若需分别测定神经元和星形胶质细胞，可参考Mullett等人的方法4,29，在800 nm和700 nm通道中同时进行MAP2和GFAP染色，并省略DRAQ5 + Sapphire染色。然而，若需评估培养物中所有细胞，可使用泛细胞标记物，如α-微管蛋白、β-肌动蛋白或GAPDH。 
		注：上述稀释比例已针对N2a细胞和原代皮层细胞优化，可能不适用于所有模型。因此，建议至少尝试两种一抗稀释比例，分别加于培养板左半侧和右半侧（见图2B）。或者，在3个孔中分别尝试3–4种一抗稀释比例。例如，可在抗体说明书推荐稀释比例的基础上，上下各增加两倍稀释梯度。换言之，若免疫细胞化学推荐稀释比例为1:500，则同时尝试1:250和1:1,000的稀释比例。
		<ol>
			<li>将抗体用1:1稀释的Odyssey封闭液:PBS溶液配制，并加入0.3% Triton-X。为节省成本，可尝试在步骤3.2.1中使用过的封闭液来配制抗体，即在孵育结束后回收该溶液。操作时需保持细胞处于PBS中，防止干燥。</li>
			<li>一抗孵育可在室温下进行1–2小时，或在4 °C过夜。对于结合能力较弱或表达量较低的蛋白，过夜孵育有助于增强信号。 
				注：在每个二抗浓度下，至少保留3个孔仅含封闭液，用于背景扣除（图2B中的2B–2D孔和2E–2G孔）。这些孔不得接触任何一抗。它们可反映二抗的非特异性结合程度，有助于信噪比的计算。若担心二抗可能导致较高水平的非特异性结合，还可增设既不加一抗也不加二抗的对照孔，但经历相同次数的洗涤。这些孔与“仅二抗”孔之间的差异可揭示仅由二抗引起的非特异性结合程度。在我们对小鼠N2a细胞的测试中，单独使用抗小鼠二抗的信号强度为0.557±0.032，单独使用抗兔二抗为0.533±0.041，无二抗时为0.357±0.003，而一抗和二抗均使用时为11.867±0.911。因此，即使在小鼠细胞上使用抗小鼠二抗，我们也未观察到高水平的非特异性结合。市面上有多个厂家提供红外二抗，我们建议仅购买高度交叉吸附的产品。请注意，不同来源的IgG二抗浓度可能存在差异。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>用PBS（每孔200 μl）洗涤3次，每次10分钟，以去除一抗。一抗溶液可在含0.2%叠氮化钠的条件下于4 °C保存数周，并重复使用，直至在透光条件下可见微小颗粒杂质为止。此做法仅为节省成本。若成本不是问题，建议每次使用新鲜配制的一抗。</li>
	<li>将二抗用含0.3% Triton-X的1:1 Odyssey封闭液:PBS溶液稀释1:1,000或1:2,000（图2B）。将1:1,000稀释液加至培养板上半部分，1:2,000稀释液加至下半部分。为节省成本，这些浓度可进一步降低，但在确定前需验证其线性关系。 
		注：务必向背景扣除孔（图2B第2列）中加入相应的二抗溶液。
		<ol>
			<li>若将用第二种蛋白检测替代DRAQ5 + Sapphire，则可用700 nm通道的山羊抗小鼠IgG对α-微管蛋白或MAP2进行标记，同时使用非小鼠来源的一抗，在800 nm通道中标记第二种蛋白。800 nm通道背景较低，应保留给最关键的靶蛋白。</li>
			<li>在避光条件下，于室温孵育1小时。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>用PBS（每孔200 μl）洗涤3次，每次10分钟，以去除二抗。</li>
	<li>配制DRAQ5 + Sapphire溶液。对于培养板左侧，将DRAQ5按1:10,000稀释（终浓度0.5 μM），Sapphire按1:1,000稀释，溶于含0.3% Triton-X的PBS中（第3–6列；图2B）。对于右侧，将DRAQ5按1:20,000稀释（0.25 μM），Sapphire按1:2,000稀释（第7–10列；图2B）。 
		注：DRAQ5曾以1 mM储备液出售，而非目前的5 mM。因此，一些早期发表的研究中使用了1:4,000或1:2,000的DRAQ5稀释比例8。
	<ol>
		<li>为节省成本，若同时检测两块培养板，可依次将同一DRAQ5 + Sapphire溶液用于两块板，即从第一块板吸出后加入第二块板。若以这种方式重复使用同一批溶液，应在一天内完成使用。稀释后的DRAQ5 + Sapphire溶液不可在4 °C保存或冷冻以备后续使用。</li>
		<li>在避光条件下于室温孵育30分钟。若时间紧迫，且DRAQ5 + Sapphire溶液不会在其他含不同二抗的板上重复使用，可在步骤3.5中将染料直接加入二抗溶液，共同孵育1小时。 
			注：不得向背景扣除孔（图2B第2列）中加入DRAQ5 + Sapphire溶液，因为这些孔不应在700 nm通道中染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS（每孔200 μl）洗涤3次，每次10分钟。若在红外成像完成后还需使用其他可见光范围的二抗进行染色，则最后一次PBS洗涤中应加入0.2%叠氮化钠。</li>
	<li>使用Odyssey成像仪扫描培养板。首先以强度5、分辨率169 mm进行扫描。“中等质量”或“低质量”设置即可满足要求。公司未公开详细的激发/发射滤光片信息，但据制造商说明，发射滤光片宽度约为20 nm，中心波长分别位于720 nm和820 nm附近。 
		注：可直接扫描湿润的培养板，以便后续继续使用其他标记物染色。但公司在线方案建议干燥的培养板可减少孔间信号扩散。若需比较湿板与干板的扫描结果，务必彻底去除孔内PBS，因为残留盐分蒸发后可能导致边缘出现高背景荧光。
		<ol>
			<li>Odyssey成像仪从上方扫描并穿透培养板底部。不同厂家的培养板可能需要不同的聚焦偏移量，因为孔底厚度和深度存在差异。尝试在不同聚焦偏移量（如2.5 mm、3.0 mm、3.5 mm、4.0 mm）下扫描，观察何处获得最高的信噪比和最清晰（最聚焦）的信号。也可用尺子测量培养板底部至孔底的深度以验证Odyssey的设置结果。请注意，孔底塑料可能使尺子测量值增加额外高度。本研究使用的Costar培养板需设置聚焦偏移量为4.0 mm。</li>
			<li>在软件中使用“细胞内Western”功能，将合适尺寸的网格覆盖在培养板图像上，并将数据导出至Microsoft Excel。比较不同聚焦偏移量下相同孔的“总积分强度”值，找出荧光信号最强的条件。选择能提供最高信噪比（免疫染色孔信号与“无一抗阴性对照”孔信号之比）的聚焦偏移量作为后续实验的标准。</li>
			<li>确定一个聚焦偏移量后，可进一步以更小增量重新扫描。例如，若最强信号出现在3.5 mm和4.0 mm，可尝试3.6、3.7、3.8和3.9 mm，观察信号强度是否进一步提升。若聚焦偏移量设置错误，在空板上12列的信号强度（理论上应相等）将呈现U形曲线而非平坦直线。若塑料板持续存在此问题，可尝试使用玻璃底培养板。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>从700 nm和800 nm通道中每个数据点的积分强度值中减去背景扣除孔（图2B；2B–2D孔或2E–2G孔）的平均积分强度值。然后计算每组孔的平均积分信号强度。将数据以散点图形式绘制，横坐标为细胞密度（见图3）。
		<ol>
			<li>比较不同一抗和二抗稀释比例，以及不同DRAQ5 + Sapphire稀释比例的结果，确定后续实验所用的单一稀释比例。若未达到线性关系，可尝试以不同强度重新扫描。例如，改用强度3和7代替强度5，重新分析数据。若某一强度下数据有所改善但仍不理想，可在该强度附近以更小增量重新扫描。</li>
			<li>分析图像时需避免软件显示孔内有白色斑点的情况，这些斑点表示信号饱和，超出成像仪检测范围。若出现此情况，应降低扫描强度重新扫描。</li>
			<li>若仍未达到线性关系，可尝试在铺板后6小时内进行固定，因为细胞可能在过夜期间在不同列中生长或死亡不均。也可尝试不同的铺板密度、扫描强度、试剂稀释比例的进一步优化、玻璃底培养板、单独使用DRAQ5作为仅标记细胞核的染料，或更换其他非抗α-微管蛋白或抗MAP2的抗体。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

所有作者均无任何利益冲突需要披露。

我们发现，所有三种活力检测方法的信号强度均与铺板密度呈线性关系且相互关联。然而，并非所有检测方法对铺板密度的2倍或1.5倍变化均具有相同的敏感性。对于N2a细胞，红外检测法的敏感性低于ATP检测法，尤其是在较低的铺板密度下。尽管红外检测法的敏感性低于ATP检测法，但DRAQ5 + Sapphire检测法与α-微管蛋白检测法结果一致，均显示出N-乙酰半胱氨酸具有显著的保护作用。在这两种检测方法中，红外信号均呈剂量依赖性下降，且三种活力曲线在加入N-乙酰半胱氨酸后均向右偏移。这种一致性并非在所有N2a细胞处理条件下都能观察到，因为α-微管蛋白检测法和ATP检测法对氯化铵等化合物的敏感性似乎高于DRAQ5 + Sapphire检测法（参见Unnithan et al.8中的图4）。因此，三种检测方法并不总能同等程度地反映细胞活力表型。尽管ATP检测法的信号强度与铺板的N2a细胞数量之间的比例关系优于α-微管蛋白检测法和DRAQ5 + Sapphire检测法，但在毒素处理后，信号强度反映细胞数量这一假设并不总是成立。在某些未引起红外检测信号类似升高的毒素浓度下，ATP水平却出现上升。这些数据揭示了N2a细...

在生命科学领域，最常见的活力检测方法是细胞计数。这一结论得到了文献分析的支持：对2013年4月29日和4月30日PubMed数据库中以“in vitro”或“culture”为关键词发表的最新200篇文献进行统计发现，其中23.5%的研究使用了细胞计数检测方法，包括手动细胞计数、利用成像软件进行的自动细胞计数以及台盼蓝排斥法。仅有1%的文献使用了活/死细胞染色法（Live/Dead assay）。使用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）检测细胞代谢活力的文献占比为11%。该文献调研还显示，同时结合细胞计数与MTT等检测方法的研究仅占3.5%。尽管目前存在单独使用一种活力检测方法的趋势，但将细胞功能评估与细胞数量测定相结合，似乎是评价细胞完整性的最佳策略。仅依靠细胞计数并不充分，因为即使细胞仍存在于孔板中，这些残留细胞也可能不具备正常功能或处于非健康状态1,2。相反，某些功能性指标（如ATP水平）可能在细胞数量未发生相应变化的情况下升高或降低。代谢读数与细胞数量之间的解耦现象表明，ATP和MTT检测绝不能作为唯一的活力检测手段。本报告中描述了三种同时评估细胞结构和代谢功能的活力检测方法，以提供比单一检测更为全面的细胞完整性评估视角。

我们的两项检测需要使用能够测量700 nm和800 nm通道荧光的红外成像仪。红外波长范围内的背景噪声较低，因而具有更高的信噪比3。我们使用的Odyssey成像仪具有4.5个对数级的动态范围和16位的位深度，相当于216即65,536种红外灰度等级。相比之下，8位彩色成像每个波长仅能提供28即256种颜色等级。因此，16位成像具有更高的分辨率。需要注意的是，在已发表的报告中，原始红外图像通常以伪彩色形式呈现，其中800 nm通道显示为绿色，700 nm通道显示为红色。Odyssey成像仪广泛应用于Western印迹和细胞内Western（In-Cell Western）检测4-7。针对甲醛固定细胞的细胞内Western检测，使用针对目标蛋白的一抗，并通过红外荧光标记的二抗进行检测。该技术特别适用于磷酸化水平的检测6。在我们的细胞内Western实验中，我们在800 nm通道对固定细胞中的细胞骨架蛋白α-微管蛋白或神经元微管相关蛋白2（MAP2）进行染色。这些蛋白表达量较高，可获得良好的信噪比。同时，我们在700 nm通道使用DRAQ5染料对细胞核染色，并使用Sapphire染料对细胞质染色。因此，细胞骨架蛋白以及DRAQ5与Sapphire染色共同反映了细胞结构的形态。

第三种活力检测方法用于测量细胞代谢功能，称为“Cell Titer Glo”。该检测基于荧光素酶反应，其发光值与ATP水平成正比。ATP检测通常用于定量活细胞数量8-12。然而，将“titer”一词用于该检测名称中在一定程度上具有误导性，因为每个细胞的ATP产量可能随毒素处理而变化，因此并不总是与细胞数量成正比8。ATP水平还可能受到昼夜节律13、细胞分裂14和细胞分化15的影响。尽管如此，本文所示的ATP检测操作简便且具有实用价值，因为ATP是衡量代谢活力的一个可靠指标16-21，尽管其并不直接等同于细胞数量per se。将该检测与红外In-Cell Western检测联合使用，可比单独使用任一检测更全面地反映细胞完整性。

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>购买100 ml规格并分装，比购买更昂贵的10 ml规格更经济。重悬后未使用的试剂可在-20 &amp;deg;C下重新冷冻，至少可稳定保存21周</td></tr><tr><td>18% 甲醛</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>购买此固定液可避免称量甲醛粉末及煮沸溶液的过程，从而最大限度减少蒸气暴露</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>在甲醛溶液中添加蔗糖并非必需，但可改善固定后细胞的形态外观</td></tr><tr><td>Odyssey 封闭液</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>该鱼血清可批量购买，并于-20 &amp;deg;C长期冻存使用</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>我们将10% Triton-X 100的储存液溶于无菌水中，于4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>也可购买PBS片剂或10倍浓缩PBS溶液，但成本更高</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>同上</td></tr><tr><td>叠氮化钠（250倍）</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>切勿购买粉末状叠氮化钠，因其毒性极强。我们将所有使用过的抗体储存于含1倍浓度叠氮化钠的溶液中，于4 &amp;deg;C保存，直至出现杂质污染</td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>该抗体价格昂贵，但可高度稀释使用，且具有高度特异性</td></tr><tr><td>小鼠抗-MAP2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>该抗体价格昂贵，但特异性极高（是进行细胞内Western检测的前提条件）</td></tr><tr><td>800 nm 山羊抗小鼠IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>其他公司也销售红外荧光二抗。请确保购买经过高度交叉吸附处理的抗体，并注意不同来源的IgG浓度可能存在差异</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>该化合物曾由LI-COR以1 mM浓度销售</td></tr><tr><td>蓝宝石染料（Sapphire）</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>发光仪</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 1420 多功能微孔板检测仪</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 成像仪</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>摇床/混合器</td><td>Research Products International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞培养中的活力检测方法

Viability Assays for Cells in Culture

在显微镜下进行人工细胞计数是评估细胞活力的一种敏感方法，但耗时较长，因此成本较高。计算机化的活力检测方法在设备上投入较高，但相比人工细胞计数更快且更具客观性。本报告介绍了三种此类活力检测方法的应用。其中两种为红外检测法，一种为发光检测法。两种红外检测法均依赖于16&#160;位的Odyssey成像仪。第一种红外检测法使用DRAQ5染料标记细胞核，Sapphire染料标记细胞质，并在700 nm通道中成像。另一种红外检测法为细胞内Western（In-Cell Western），利用针对细胞骨架蛋白（α-微管蛋白或微管相关蛋白2）的抗体，并在800 nm通道中进行标记检测。第三种活力检测法是一种常用的ATP发光检测法，但我们仅使用推荐体积的四分之一以降低成本。这三种检测方法的信号均呈线性，且与接种的细胞数量相关，但敏感度有所不同。三种方法均可避免耗时的显微镜观察，并对整个孔板进行采样，从而减少取样误差。最后，所有检测均可在实验结束后的当天内完成，有利于在短时间内开展更多实验。然而，这些方法均基于一个前提：处理后细胞数量与信号强度保持比例关系，而这一假设并不总是成立，尤其是对于细胞内ATP水平而言。此外，若细胞在处理后体积增大或缩小，可能在不影响细胞数量的情况下影响信号强度。我们总结认为，所有活力检测方法（包括人工计数）均存在若干局限性，但计算机化活力检测方法值得初期投入。联合使用这三种检测方法可全面评估细胞的结构与功能状态。

这些实验中的限速步骤是红外染色，因为ATP检测的持续时间相对较短。对于红外检测，我们预计通过分两批、每批四块板的方式，可在一天内完成八块96孔板的染色和扫描（见图1）。该估算基于以下步骤：20分钟固定，30分钟洗涤，30分钟封闭，2小时一抗孵育后进行30分钟洗涤，1小时二抗孵育后进行30分钟洗涤，30分钟DRAQ5与Sapphire染色后再进行30分钟洗涤，以及每四块板34分钟的扫描时间。为考虑四块独立板的错时加样操作，图1中额外增加了15分钟的洗涤时间。本估算未包含数据分析所需时间。如果每块红外检测板同时平行进行ATP检测，则一天内可完成十二块板的检测——其中六块用于红外染色，六块用于ATP水平测定。
回归分析中数据合格的标准（如“实验方案”部分所述，参见图3）包括铺板密度与信号强度之间存在显著相关性（双尾p ≤ 0.05）。发光或红外信号的变化幅度也应与细胞数量的变化成比例。理想情况下，5k个细胞的发光值或ATP水平应约为10k个细胞的一半，而15k个细胞的数...

治疗性化合物通常首先被研究 体外 通过活力检测进行评估。由人工观察者进行的盲法细胞计数虽对细胞数量的微小变化高度敏感，但无法评估细胞功能。本文所述的计算机化活力检测方法能够以客观的方式同时评估细胞结构与功能。

显微镜下的手工细胞计数是评估细胞活力的敏感方法，但耗时较长，因此成本较高。计算机化……

本实验的总体目标是进行多种活力检测，以提供比单一检测更为全面的细胞适应性评估。首先，通过测定贴壁细胞的ATP水平来评估其代谢功能；第二步，使用波长为800纳米的红外抗体对细胞骨架蛋白（如α-微管蛋白或微管相关蛋白2）进行免疫染色。接下来，使用红外染料Drac5和Sapphire在700纳米波长下对细胞进行标记，以染色细胞核和细胞质。最后一步是在红外成像仪上，于700和800纳米波长下对α-微管蛋白（或MAP2）以及Drac5与Sapphire的信号进行成像。最终，这些发光和红外检测方法可提供有关解剖结构和生理功能的信息。与现有的 MTT 活性检测等方法相比，这些技术的主要优势在于能够快速、灵敏地测量细胞完整性的多个方面。这些方法有助于回答神经科学和药理学领域中的关键问题，例如治疗性化合物是否能够保护解剖结构和代谢功能。首先，按照随附方案所述，在 96 孔板中以不同细胞密度将细胞重悬于 100 或 200 微升培养基中，并在周围孔中加入 200 微升无菌水，以减少边缘蒸发效应。将细胞置于37摄氏度、CO2缓冲培养箱中过夜贴壁。次日，将每孔中的培养基从100微升减少至50微升，或从200微升减少至50微升，即每孔保留50微升培养基。随后，向第2至第6列的每个内侧孔中加入25微升细胞活力检测试剂（Cell Titer-Glo reagent）。为了在第7至第11列、B至D行的孔中获得一比二的稀释度，需加入50微升细胞活力检测试剂，以在其余孔中获得一比一的稀释度。第7至第11列、E至G行的孔中不移除任何培养基，而是直接加入100微升细胞活力检测试剂，使总体积达到200微升，从而获得一比一的稀释度。立即将培养板置于振荡器或轨道摇床上，振荡10分钟，使样品在孵育过程中充分混匀。然后从每个孔中转移 60 µL 至白色壁板的 96 孔板中。白色孔板的发光值高于透明或黑色孔板，因为其可将光反射至检测器方向。若在转移过程中产生气泡，可使用塑料移液器吸头产生的气流将其戳破。在加入试剂后的12分钟内，将培养板置于发光仪上读取发光值。取每组三个或六个孔的发光值平均值，并以细胞数量为函数作图，继续使用在随附文本中定义的仍能产生线性且成比例结果的最高试剂稀释度。这将节省红外检测的成本，同时按照随附文本方案所述，收获细胞并在不同密度下重新悬浮细胞。在周围孔中加入 200 微升无菌水，以减少边缘处温度梯度和蒸发的影响。将细胞在 37 摄氏度的 CO2 缓冲培养箱中过夜培养，使其贴壁，然后通过加入 100 微升固定液（如含 4% 甲醛和 4% 蔗糖的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液）固定细胞。将培养板在室温下孵育 20 分钟，随后去除固定液，并用 200 微升 PBS 洗涤细胞三次。接下来，用 PBS 将封闭液按 1:1 比例稀释，并加入 0.3% Triton X-100 作为细胞通透剂。然后向每个孔中加入 35 µL 封闭液，注意避免在孔中产生气泡。将酶标板在室温下用封闭液孵育 30 至 60 分钟。孵育期间，将目标蛋白的一抗进行稀释。例如，在程序优化测试中，将 Antifa tubulin 一抗用含 0.3% Triton X-100 的封闭缓冲液与 PBS 等体积混合液按 1:10,000 比例稀释。此处另进行其他抗体稀释操作：Antifa tubulin 一抗也用含 0.3% Triton X-100 的封闭缓冲液与 PBS 等体积混合液按 1:5,000 比例稀释。接下来，将抗体以此处所示的浓度加入到已固定在孔板上的细胞中。注意将第二列的阴性对照孔保留在封闭液中，因为这些孔仅会接触二抗。将细胞在室温下与一抗孵育1至2小时，或在4°C下孵育过夜。接着，在一抗孵育后，将800纳米抗小鼠IgG二抗用封闭缓冲液与含0.3% Triton X-100的PBS按1:1混合的溶液稀释1000倍或2000倍进行配制。每孔加入200微升PBS，洗涤3次，每次10分钟。然后每孔加入35微升二抗。将1:1000稀释液加入到培养板的上半部分，将1:2000稀释液加入到下半部分。在避光条件下，室温孵育细胞与二抗反应1小时。随后用PBS洗去未结合的二抗，每次每孔加入200 µL，共洗涤3次，每次10分钟。接下来，将DRAC五号原液用含0.3% Triton X-100的PBS稀释10,000倍，得到终浓度为0.5 µM的溶液，同时将sapphire原液稀释1,000倍。向孔板左半部分加入35 µL该混合液，但第2列的阴性对照孔不加任何试剂。对于孔板右半部分，加入35 µL已稀释20,000倍的DRAC五号溶液和稀释2,000倍的sapphire溶液。在室温避光条件下，将样品在上述溶液中孵育30分钟。然后每孔加入200 µL PBS，洗涤3次，每次10分钟。首先使用红外成像仪对微孔板进行扫描，设定强度为5，分辨率为169 µm。中等或低质量设置即可满足要求。随后在2.5毫米、3.0毫米、3.5毫米和4.0毫米的不同焦距偏移下进行扫描，以确定信噪比最高且信号最清晰的位置。焦距偏移优化后，在软件中使用incel western功能将合适尺寸的网格覆盖到平板图像上，并将数据导出至Microsoft Excel。从700和800纳米通道中的每个相应数据点的总积分强度中减去阴性对照孔的平均积分强度。然后对每组孔的总信号积分强度取平均值，并在优化后以细胞密度为横坐标绘制散点图。三种检测方法的信号强度均与每孔细胞数量呈显著相关性；尽管这三种检测方法均具有高度线性，但其灵敏度并不相同。ATP 检测在三种检测方法中表现出最高的敏感性，其定义为在大鼠原代神经元细胞中，随着细胞数量减少，发光信号的变化最为成比例。最佳试剂浓度各不相同，且在整个检测范围内，各检测方法的线性关系较弱。然而，在接种密度低于100,000个细胞时（如本图所示），这些检测方法均表现出良好的线性和敏感性。我们对经蛋白酶体抑制剂 MG 132 处理的神经母细胞瘤细胞绘制了剂量反应曲线。在存在或不存在谷胱甘肽前体 N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine）的条件下，分别施加 MG 132，结果显示 N-乙酰半胱氨酸使三条曲线均向右偏移。例如，通过 DRAC5 加蓝宝石法测得的 IC50 值，在无 N-乙酰半胱氨酸时为 1.64 µmol/L MG 132，而在存在 N-乙酰半胱氨酸时为 4.64 µmol/L MG 132。该结果与 α-微管蛋白检测中测得的相应值（分别为 1.96 µmol/L 和 6.35 µmol/L MG 132）相似。然而，在低浓度 MG 132 处理下，ATP 水平升高，这一现象称为毒物兴奋效应（hormesis）。这些数据表明，ATP 水平并不一定与处理后的细胞数量成正比，且 N-乙酰半胱氨酸也能保护细胞的代谢功能。一旦掌握发光法 ATP 检测技术，该实验可在 30 分钟内完成，而红外染色则可在 8 小时内轻松完成。在进行这些实验操作时，需要注意的是，它们测量细胞数量的方式与高分辨率显微镜不同。例如，一个需要注意的问题是，处理因素可能会改变α-微管蛋白或TP的蛋白水平，而细胞数量并未发生相应的变化。

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