2013年9月21日
我们在这里描述的修订协议,用于胚胎C.大型文化线虫的细胞。 C.胚胎线虫使用这种方法的细胞在体外培养时,出现分化和概括的基因的表达在细胞中的具体方式。需要直接访问到细胞中,或从其它组织中的特定细胞类型的分离技术可以对C.施加线虫培养细胞。
该程序的总体目标是在体外解离和培养胚胎、海洋优雅细胞。这是通过首先种植大量坟墓动物来实现的。接下来从成虫中分离出虫卵。
然后用几丁质酶处理鸡蛋以溶解蛋壳。最后,手动解离细胞并铺板用于培养。最终,可以通过免疫荧光、显微镜检查、电生理学和钙成像技术获得显示细胞特异性标志物表达的结果。
演示该程序的将是 rel ti,一个博士后实验室。在将至少四个 sea elegance 板培养到 GR 成人阶段并根据文本方案准备培养基和溶液后。首先将一管先前制备的花生凝集素原液浸入水中,开始鸡蛋分离。
将高压灭菌器盖玻片放入 24 孔板的孔中,向每个盖玻片中加入 200 μL 花生凝集素,在室温下孵育至少一小时。接下来,吸出溶液并使用无菌水清洗孔。一次去除所有痕迹的花生凝集素以防止细胞聚集。
然后使用无菌高压灭菌水,将 GR 成体从琼脂平板上洗掉,并将悬浮液收集在两个无菌锥形 50 毫升管中。将试管放在冰上长达 5 分钟,让蠕虫沉降到底部用移液管除去水,然后用新鲜、无菌的高压灭菌水离心机代替。蠕虫在 200 G 下放置 10 分钟。
最后一次洗涤后,复苏,将蠕虫悬浮在新鲜的无菌水中,并将其转移到无菌的 15 毫升锥形管中,然后再次以 200 G 离心 10 分钟。如果蠕虫没有完全沉淀,请将试管放在冰上 5 分钟。蠕虫完全沉淀后,除去水并加入 5 到 6 毫升裂解液。
然后轻轻摇动悬浮液 5 到 10 分钟,每 2 到 3 分钟,将一滴悬浮液滴在盖玻片上,并在立体显微镜下检查是否裂解。当 72 80% 的蠕虫被裂解时,加入 9 毫升鸡蛋缓冲液停止裂解反应,然后从此时开始旋转,点燃本生灯并保持打开以防止鸡蛋再次污染,小心去除上清液并使用鸡蛋缓冲液彻底清洗沉淀三到四次,直到溶液澄清。接下来,在去除最终上清液以将鸡蛋与动物尸体复苏分离后,将沉淀悬浮在 2 毫升无菌鸡蛋缓冲液中,并在鸡蛋缓冲液中加入 2 毫升 60% 蔗糖。
将鸡蛋在溶液中充分混合,然后离心 20 分钟。在 200 G 时,小心地从离心机中取出试管。鸡蛋会漂浮在溶液的顶部。
因此,使用移液器和无菌 1 毫升吸头将鸡蛋转移到新鲜的无菌 15 毫升锥形管中。在层流罩下工作时,使用无菌鸡蛋缓冲液清洗鸡蛋 3 次。为避免引入细菌污染,复苏后,将沉淀的鸡蛋悬浮在 1 毫升 2 毫克/毫升的激酶中,然后将它们转移到新鲜的 15 毫升锥形管中。
在室温下摇动试管 10 到 30 分钟,具体取决于酶的新鲜度,当大约 80% 的蛋壳被消化时。将鸡蛋以 900 G 离心 3 分钟。小心去除上清液后,加入 3 毫升 L 15 培养基,将鸡蛋转移到直径为 6 厘米的板中,并使用带有 18 号针头的 10 毫升无菌注射器开始手动解离。
为了监测解离的程度,将一滴悬浮液滴入新鲜的培养皿中,并在显微镜下观察。继续直到大约 80% 的细胞解离。要去除细胞块、未消化的卵和孵化的幼虫,请通过 5 微米过滤器轻轻过滤悬浮液,然后额外运行 4 至 5 毫升 L 15 培养基通过过滤器,以回收细胞以培养细胞。
将滤液以 900 G 离心 3 分钟后,复苏将细胞悬浮在每孔 1 毫升的完全 L 15 培养基中,并将板储存在 20 摄氏度的潮湿密封室中,并置于环境空气中。为了区分分离的胚胎秀丽隐杆细胞必须粘附在底物上。分化过程在铺板后约 2 至 3 小时开始,持续约 24 小时。
体外形态特征与体内形态特征非常相似。例如,如此处所示,LM 和 PLM 触摸神经元只发育两个神经元过程,一个比另一个长,因为它们在体内也是如此。这表明至少一些驱动秀丽隐杆线细胞分化的分子机制是细胞自主的,因此可以概括。
也可以在体外观察到细胞特异性的体外蛋白质标志物和翻译后修饰。例如,α 微管蛋白是 sea elgan 中仅在接触神经元中饱和的,如此处所示的触摸神经元的体外过程用针对饱和 α 微管蛋白产生的抗体染色。此外,如该面板所示,培养的触摸神经元表达有毒突变通道 MEC four D,这确实会导致触摸神经元在体内死亡。
由 MEC 4 DPE 4G FP 菌株制备的表达 GFP 的神经元最初存在于培养物中,但随后退化。然而,就像在体内一样,可以通过用 IDE 和丹曲林处理来拯救细胞免于死亡,如图所示。膜片钳技术用于研究 sea elgan 培养细胞中的钾离子、离子、非选择性和多巴胺转运蛋白依赖性通道。
由于样品池体积小,玻璃移液器必须有一个小吸头,然后是一个宽锥体,以抵消增加的输入电阻。此外,通过在移液器尖端下方的膜片上施加高压脉冲,而不是通过可能损坏细胞的抽吸进入整个细胞,从而获得更大的成功。在该图中,为了研究电压门控钙通道的作用,ION 4 用于渗透膜并校准表达变色龙 YC 两点 12 的触摸神经元,以便在不存在或存在钙的情况下进行钙成像。
此外,还确定了触摸神经元中的平均游离钙浓度为 200 纳摩尔。看完这个视频,你应该对如何进行体外分离和培养有一个很好的了解。参见优雅,胚胎细胞。
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本文介绍了一种修订的协议,用于大规模培养胚胎秀丽隐杆蚯蚓细胞。该方法允许这些细胞在体外分化,从而能够以细胞特异性的方式研究基因表达。
This method enables scalable isolation and culture of embryonic C. elegans cells, providing a genetically tractable system for early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobiology and developmental pathways. By supporting long-term in vitro survival and differentiation, it facilitates reproducible phenotypic screening and biomarker discovery using electrophysiology, imaging, and molecular profiling. The approach enhances predictive confidence in target engagement studies by recapitulating in vivo-like cellular behaviors and marker expression in a controlled, high-throughput compatible format.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling early biological de-risking before significant investment in lead optimization.