Name: 一种用于培养胚胎 C。线虫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习大规模培养秀丽隐杆线虫胚胎细胞的方法，用于细胞特异性基因表达研究。该方法支持免疫荧光、显微成像和电生理等技术应用，为发育生物学和神经科学研究提供可靠的体外实验模型。

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星号（*）表示与 Christensen et al.1 相比新增或修改的步骤
1. 材料准备
<ol>
	<li>细胞培养过程需要从怀卵成虫中分离出大量卵。培养 C. elegans 在接种了NA22的8P琼脂平板上（NA22可通过 秀丽隐杆线虫 基因组联盟 - CGC）细菌以大量分离卵。这些培养基中所用的蛋白胨量是NGM平板常规用量的8倍。较高的蛋白胨浓度能更有效地维持NA22细菌的生长，而与OP50不同，NA22细菌会形成较厚的菌层。</li>
</ol>
8P 培养基配方：
将3 g NaCl、20 g Bacto-Peptone、25 g琼脂溶解于1 L无菌蒸馏水中，121 °C高压灭菌30 min。待培养基冷却至55 °C后，加入经无菌滤膜过滤的1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml，溶于乙醇）、1 ml 1 MgCl2、1 ml MgSO4和25 ml KP缓冲液（储备液500 ml：5 g K2HPO4，30 g KH2PO4，pH 6.00）。将液体琼脂培养基倒入10 cm培养皿中（每皿25 ml）。
<ol start="2">
	<li>次日，用 1 ml 在 2XYT 培养基（每升无菌水中含 16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母提取物、5 g NaCl，pH 7.0）中于 37 °C 过夜培养的 NA22 大肠杆菌（E. coli）均匀涂布于每块富集的蛋白胨琼脂平板表面。这些细菌将作为丰富的食物来源，形成致密菌层，支持大量成年 gravid 线虫的生长。将接种后的平板在室温下放置过夜，以允许细菌生长；也可在 37 °C 培养 4–5 小时以加快该过程。</li>
	<li>将饥饿状态的线虫转移至接种好的 8P 平板。用 5–6 ml M9 缓冲液或水从饥饿的 NGM 平板上冲洗下线虫，并将 1–2 ml 此悬浮液加至每个 8P 平板中。</li>
	<li>让线虫在平板上生长并繁殖，直至平板上布满成年 gravid 线虫。</li>
	<li>使用 5–6 ml 裂解液，从成年 gravid 线虫中分离出用于制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎细胞所需的卵。</li>
</ol>
裂解液配方
5 ml 新鲜漂白剂、1.25 ml 10 N NaOH 和 18.5 ml 无菌 H2O。该混合液必须在每次使用前新鲜配制。
<ol start="6">
	<li>使用卵缓冲液清洗从怀卵成虫中分离的卵：</li>
</ol>
卵缓冲液配方
118 mM NaCl，48 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，25 mM Hepes，pH 7.3，渗透压 340 mOsm。
<ol start="7">
	<li>用几丁质酶处理去除包裹卵的卵壳。几丁质酶是一种在酸性pH条件下活性最高的酶25。将几丁质酶（Sigma，货号 C6137）溶解于pH 6.5的卵缓冲液中，终浓度为2 mg/ml。将几丁质酶储存液以1 ml分装于无菌15 ml锥形管中，于-20 °C保存。分装液可在-20 °C下保存数月。</li>
	<li>在覆盖花生凝集素的已灭菌盖玻片（直径12 mm）上培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养细胞。将花生凝集素溶于无菌水（0.5 mg/ml）。花生凝集素溶液不应过滤或高压灭菌，也无需进行紫外照射处理。将2 ml分装液于-20 °C保存，可保存长达6个月。</li>
	<li>完全细胞培养基（500 ml）包含500 ml Gibco公司的L-15培养基、50 ml胎牛血清（热灭活）、7.7 g蔗糖（45 mOsm）、5 ml青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）（2%）。将完全培养基用0.20 μm孔径滤膜过滤。</li>
</ol>
请注意，卵缓冲液和培养基的渗透压分别为 340 和 345 mOsm。事实上，与哺乳动物细胞不同，C. elegans 细胞具有相对较高的渗透压，在配制与细胞质膜直接接触的溶液时必须予以考虑。这些试剂的配方已调整至目标渗透压，并使用渗透压计进行测定1。如果严格按照本配方配制试剂，并在操作过程中保持谨慎，则无需使用渗透压计。然而，若需配制本文或其他使用 C. elegans 培养细胞的文献中未列出的其他溶液，则应使用渗透压计进行测定。
2. 卵的分离
<ol>
	<li>建议至少从四个 8P 培养板开始，以收集足够的卵用于 12 孔培养细胞（置于 24 孔板中）。</li>
	<li>开始操作前，解冻一管花生凝集素储备液。将灭菌的盖玻片放入 24 孔板的孔底，每孔加入 200 μl 花生凝集素溶液。孵育 1 小时，或直至细胞准备接种。彻底去除花生凝集素溶液，并用 1 ml 无菌灭菌水洗涤各孔一次。必须完全去除盖玻片上的花生凝集素，以避免细胞成团。</li>
	<li>用无菌灭菌水将产卵成虫从琼脂平板上冲洗下来。将悬浮液收集至两个无菌的 50 ml 锥形管中。将管子置于冰上最多 5 分钟，使线虫沉淀至管底（*）。用移液塑料吸管吸去上清液，并替换为新鲜的无菌灭菌水。在台式离心机中以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟，使线虫沉淀（*）。重复此步骤至少 3 次。</li>
	<li>将线虫转移至一个无菌的 15 ml 锥形管中，并以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟（*）。不要使用更高的离心速度，以免同时沉淀细菌。有时离心后线虫未能完全沉淀。每次洗涤后、去除上清液前，将管子在冰上放置 5 分钟。低温下线虫会沉淀至管底。</li>
	<li>去除上清液，加入 5–6 ml 裂解液（见材料准备）。轻轻摇动悬浮液 5–10 分钟，然后每隔 2–3 分钟在体视显微镜下观察线虫裂解情况。也可将一滴悬浮液置于盖玻片上以便更清晰地观察。孵育时间因次氯酸钠的新鲜程度而异；建议购买小瓶装次氯酸钠，并每月更换新瓶。</li>
	<li>当约 70–80% 的线虫已裂解（自孵育开始约 10 分钟后），加入 9 ml pH 7.3 的卵缓冲液终止裂解反应（见材料准备）。将悬浮液以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟。自此步骤起，在实验台开启本生灯，以防止卵再次污染（*）。</li>
	<li>使用无菌塑料移液吸管小心去除上清液，并用卵缓冲液洗涤沉淀物 3–4 次，直至溶液澄清。每次洗涤时务必充分混匀沉淀物与卵缓冲液。</li>
	<li>使用 30% 蔗糖溶液将卵与动物残体分离。将沉淀物重悬于 2 ml 无菌卵缓冲液中，加入 2 ml 60% 蔗糖溶液（以无菌卵缓冲液配制的储备液）。充分混匀后，在 200 × g（约 1,200 rpm）下离心 20 分钟（*）。</li>
	<li>小心从离心机中取出管子。卵将漂浮在溶液上层。使用 P1000 移液器和无菌吸头，将所有卵转移至一个新的无菌 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>向管中加入 10 ml 无菌卵缓冲液，并以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟。重复洗涤 3 次。每次洗涤时务必确保卵在卵缓冲液中完全重悬。</li>
</ol>
3. 胚胎细胞解离
在超净工作台中进行无菌操作，完成后续实验步骤。当动物在含有细菌的培养基上生长时，洗涤及含漂白剂的裂解液处理应能消除大部分（即使非全部）细菌。因此，在该实验阶段使用超净工作台可防止卵悬液受到新的污染。
<ol>
	<li>将沉淀的卵重悬于1 ml含2 mg/ml溶菌酶（溶于pH 6.5的卵缓冲液中的储存液（*））中，并转移至新的无菌15 ml锥形管中。室温下轻轻摇动孵育10–30分钟。确切的孵育时间取决于酶的新鲜程度和室温，因此每次制备时应单独确定。建议在孵育10分钟后，使用倒置细胞培养显微镜观察卵的消化情况。注意：根据我们的经验，较低的pH值可提高溶菌酶的酶活性。因此，我们使用pH 6.5的卵缓冲液溶解溶菌酶（配方见上文，其中使用NaOH将pH调节至6.5）。</li>
	<li>当约80%的卵壳被溶菌酶消化后（图1 A-B），在900 × g（约2,500 rpm）下离心3分钟收集卵（*）。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除上清液，并加入3 ml L-15培养基（*）。</li>
	<li>将卵转移至直径6 cm的培养皿中，使用配备18 G针头的10 ml无菌注射器轻轻吹打以解离细胞。取一滴细胞悬液置于新的塑料培养皿中，在显微镜下观察解离程度。此过程中切勿吸入空气，以免损伤细胞。持续解离直至约80%的细胞被分散。</li>
	<li>使用无菌5 μm Millipore滤膜过滤细胞悬液。必须进行过滤以去除细胞团块、未消化的卵和已孵化的幼虫。再用4–5 ml新鲜L-15培养基冲洗滤膜，以回收所有细胞。过滤过程中避免施加过大压力，以防损坏滤膜或细胞。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>将解离的细胞在900 × g（约2,500 rpm）条件下离心3分钟（*），使细胞沉淀。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除全部上清液。将沉淀的细胞重悬于完全L-15培养基中，并接种至每孔1 ml。所加培养基的量取决于使用的8P板数量、板上蠕虫的汇合度以及后续实验的类型。细胞密度可通过血细胞计数板测定。进行膜片钳记录时，接种密度约为230,000个细胞/cm2为最佳。</li>
	<li>将24孔板置于塑料保鲜盒中，并在盒内放置湿润的纸巾以防止培养基蒸发。将容器置于20 °C、空气环境的湿化培养箱中保存。</li>
	<li>通常在接种后24小时内，细胞即可用于实验，此时形态学分化及GFP标记物的表达已基本完成。细胞可在培养条件下维持长达2周，但通常在接种后7–9天内状态最佳。为维持细胞健康，需每天更换一次培养基。</li>
</ol>

C. elegans 是解析发育、行为和衰老过程中相关遗传通路的强有力模式生物。其便利性主要源于易于进行遗传操作以及具有较短的生命周期。尽管如此，C. elegans 也存在一定的局限性。C. elegans 的细胞体积微小，且被包裹在具有压力的角质层内，这限制了需要直接接触细胞的技术的应用，例如电生理学和药理学技术，或特定细胞类型的分离，如通过微阵列分析获取基因表达谱。C. elegans 的细胞培养方法为克服该模式生物的诸多局限性提供了解决方案。
在本文中，我们描述了一种改进的分离和培养胚胎的方法 C. elegans 基于Christensen及其同事早期工作的大规模细胞培养 1我们还报告了使用多种技术（包括免疫细胞化学、电生理学和钙成像）所获得的已发表的代表性结果，这些技术增进了我们对细胞功能背后生理过程及遗传需求的理解 秀丽隐杆线虫. 目前在培养细胞中已完成的工作 秀丽隐杆线虫 细胞支持它们的分化 体外 正如...

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种用于研究细胞功能、分化和行为分子基础的强有力模式生物。尽管其基因组、代谢途径和生物合成途径与脊椎动物相似，但其遗传和分子操作的便利性远高于脊椎动物 2其优势包括体型小、解剖结构简单、生命周期短（在25 °C条件下为3天）、寿命短（2周）以及后代数量多（&gt;200）。由于其雌雄同体的特性和较短的生命周期，对其进行分子和遗传操作较为简便 秀丽隐杆线虫，包括转基因动物的制备 3,4 以及基因敲低技术的应用，例如RNA干扰 5. 秀丽隐杆线虫 身体和卵壳是透明的，因此可以使用标准显微镜轻松观察成体和胚胎中的细胞。在过去40年中， 秀丽隐杆线虫 社区已创建了宝贵的资源 秀丽隐杆线虫 包括大量突变体、基因敲除和转基因品系的研究，以及对解剖结构和发育过程的详细描述 6,7，包括 nervous system 的完整重建 8，以及一个基因组已完全测序、注释完善并可向整个科研社区公开获取的基因组（<a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a>).
尽管具有诸多优势，某些实验方法在实施过程中仍面临挑战 秀丽隐杆线虫这些包括需要接触细胞质膜以及分离组织或特定细胞类型的方法。确实 C . elegans 组织被限制在其加压的流体静力骨架内，这种结构不易被酶处理或去污剂消化。20世纪90年代末，Miriam Goodman 和 Janet Richmond 率先建立了对线虫进行电生理记录的方法。 秀丽隐杆线虫 神经元和肌细胞 原位 9,10. 尽管这些方法使我们对神经元和肌肉功能获得了重要的认识 体内，它们具有挑战性且通量较低。研究细胞功能的替代方法 体内 已经开发出来，尤其是 体内 使用基因编码钙离子传感器（如 GCamP 和 cameleon）进行钙成像 11-13然而，这些方法无法使用药理学工具，因为它们应用于完整的活体动物。
首次尝试培养 秀丽隐杆线虫 细胞 体外 由Laird Bloom在其博士论文准备期间大规模制备 14遗憾的是，由于细胞与基质黏附性差、细胞分化和存活率低等问题，该早期方案未能成为一种可靠的细胞培养方法。1995年，Edgar 及同事发表了一种通过分离和培养单个细胞来研究细胞分裂和形态发生的方案 C. elegans 胚胎 15通过酶消化与手动解离相结合的方法消化卵壳获得的胚胎细胞继续增殖，可产生多达约500个细胞 15随后，Leung 及其同事培养了少量的卵裂球以研究肠道形态发生。他们证明，其中一个 体外 分离的E卵裂球通过顶端黏附连接相互作用，形成了极化的肠细胞，并构建出类似于肠腔的结构 16Buechner 及其同事还报道了一种类似的培养方法 C. elegans 胚胎细胞 体外 17.
基于早期研究，Christensen 及其同事开发出一种稳定的胚胎培养方案 C. elegans 细胞 体外 1他们表明，分离的 C. elegans 细胞可分化为多种细胞类型，并维持其原有的特性 在体内 包括细胞特异性标志物的表达。多种具有挑战性的技术 体内，可应用于分离的 秀丽隐杆线虫 胚胎细胞。这些包括电生理学 1,18 19成像和免疫化学技术 20,21以及通过荧光激活细胞分选（FACS）分离特定细胞类型，用于构建细胞特异性cDNA文库 22,23基因敲低技术（如RNA干扰，RNAi）可用于培养的 秀丽隐杆线虫 细胞 1 一种利用叠氮糖作为糖蛋白发现工具的新型代谢标记方法 recently developed for 体外 培养的 秀丽隐杆线虫 细胞 24.
总之，细胞培养方法拓展了可应用于该领域的技术范围 C. elegans 在活体生物背景下解析基因功能的模型。本文描述了培养的方案 秀丽隐杆线虫 胚胎细胞 体外，该方法主要基于Christiansen及其同事首次描述的实验方案 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco 琼脂颗粒</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 胰蛋白胨</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基（1×）液体</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>来自灰色链霉菌的几丁质酶</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 遗传学中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>花生凝集素</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基&amp;#8211;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;蓝色刻度移液器吸头</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 无菌吸管，单独包装</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>人体工学可调体积（100-1000 &amp;mu;l) 带吸头弹出装置的移液器</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>便携式移液器辅助器，Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管 </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>无菌18号针头</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>无菌 10 ml 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>康宁塑料注射器滤器 0.20 &amp;mu;m 孔径大小 </td><td>康宁</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm 注射器滤器 w/5 &amp;mu;m versapor 膜</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm 无菌培养皿</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm 无菌培养皿</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 直径玻璃盖玻片</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>24孔平底带盖透明细胞培养板 </td><td>托马斯科学</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 细镊子 </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备10倍物镜的倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>环境空气加湿培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种培养胚胎期 c. elegans 细胞的方法

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

秀丽隐杆线虫 是一个功能强大的模式系统，遗传学和分子生物学技术可轻松应用于该系统。然而直到最近，那些需要直接接触细胞并分离特定细胞类型的技术还无法在该系统中应用 秀丽隐杆线虫这一限制的原因在于组织被封闭在加压的角质层内，而角质层难以通过酶和/或去污剂处理有效消化。该结论基于Laird Bloom、Christensen及其同事的早期开创性工作。 1 建立了一种稳定的细胞培养方法 秀丽隐杆线虫 大规模培养胚胎细胞。通过漂白剂/氢氧化钠处理从产卵成虫中分离卵，随后用几丁质酶处理以去除卵壳。然后通过手动吹打使胚胎细胞解离，并接种至含血清的培养基中、铺于包被基质的玻璃表面。分离后24小时内，细胞开始分化，表现为形态改变及表达特定细胞标志物。 秀丽隐杆线虫 采用该方法培养的细胞可存活长达2周 体外 并已用于电生理学、免疫化学和成像分析，同时也经过分选用于微阵列表达谱分析。

C. elegans 培养的细胞发生分化并表达细胞特异性标志物
Christensen 及其同事通过台盼蓝染色证明了 &gt;99%的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞在分离过程中存活。铺板后第9天和第22天，存活率分别为85%和65%。 1分离的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞必须黏附于基质才能分化。未能黏附的细胞会聚集成团，其存活情况尚不明确。细胞的分化在接种后2–3小时开始，持续约24小时。24小时内，细胞呈现出特定的形态，例如神经元会伸出突起。 1,18-20，肌细胞形成类似所见的指状伸长结构 体内 1 以及导管细胞形成管腔 17形态学特征 体外 与那些非常相似 体内例如， 体外 培养的ALM和PLM触觉神经元（通过表达鉴定） Pmec-4::gfp) 仅发育出两条神经突，其中一条长于另一条，与正常情况相同 体内 1,20 (<s...

我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫 培养的细胞

一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

秀丽隐杆线虫是一种强大的模式生物系统，其遗传学和分子生物学技术易于应用。然而直到最近，需要……的技术仍受限。

本实验的总体目标是分离并体外培养海兔的胚胎细胞。首先通过大量培养成年海兔，随后从成年个体中分离卵子来实现这一目标。然后用壳多糖酶处理卵子以溶解卵壳。最后，通过人工方法将细胞解离并接种培养。最终可获得结果，通过免疫荧光、显微镜、膜片钳电生理和钙成像技术显示细胞特异性标志物的表达。演示该实验步骤的是来自马尔实验室的博士后 rel ti。在将至少四个培养皿的秀丽隐杆线虫培养至成虫阶段，并根据文本方案配制好培养基和溶液后，开始进行卵的分离：首先取出一管预先配制好的花生凝集素储备液。将高压灭菌的盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入200 µL花生凝集素，于室温孵育至少1小时。随后吸除溶液，用无菌水洗涤各孔，彻底去除花生凝集素残留，以防止细胞成团。然后使用无菌高压灭菌水将GR成虫从琼脂平板上冲洗下来，并将悬液收集到两个无菌的50毫升锥形管中。将管子置于冰上最多5分钟，使线虫沉降到管底。用移液器吸去上清液，并更换为新鲜的无菌高压灭菌水，于200 ×g离心10分钟。最后一次洗涤后，用新鲜的无菌水重悬线虫，并转移至无菌的15毫升锥形管中，再以200 ×g离心10分钟。如果线虫未完全沉淀，将管子置于冰上5分钟。待线虫完全沉降后，吸去上清液，加入5至6毫升裂解液。然后轻轻摇动悬液5到10分钟，每隔2至3分钟取一滴悬液置于盖玻片上，在体视显微镜下检查裂解情况。当72%至80%的线虫已裂解时，加入9毫升卵缓冲液终止裂解反应。从此步骤开始，在离心操作期间点燃本生灯并保持燃烧，以防止卵被重新污染。小心移去上清液，并用卵缓冲液将沉淀物彻底洗涤3至4次，直至溶液澄清。接下来，在移去最后一次上清液后，将卵与动物残体分离，将沉淀物重悬于2毫升无菌卵缓冲液中，并加入2毫升含60%蔗糖的卵缓冲液。离心前将卵充分混匀于溶液中，离心20分钟。在200 G条件下，小心地从离心机中取出试管。卵将漂浮在溶液的顶部。因此，使用移液器和无菌的1毫升吸头将卵转移到新的无菌15毫升锥形管中。在超净工作台内操作，用无菌卵缓冲液洗涤卵三次。为避免引入细菌污染，重悬沉淀的卵于1毫升浓度为2毫克/毫升的激酶溶液中，并将其转移至新的15毫升锥形管中。根据酶的新鲜程度，在室温下摇动试管10至30分钟，直至约80%的蛋壳被消化。以900 G离心卵子3分钟。小心移除上清液后，加入3毫升L-15培养基，将卵子转移至直径6厘米的培养皿中，并使用带有18号针头的10毫升无菌注射器开始手动解离。为监测解离程度，取一滴悬液置于新的培养皿中，在显微镜下观察。持续操作直至约80%的细胞完成解离。为去除细胞团块、未消化的卵及已孵化的幼虫，用孔径5微米的滤膜轻轻过滤悬液，并再加入4至5毫升L-15培养基冲洗滤膜，以回收细胞用于培养。将滤液在900 G离心3分钟后，用完全L-15培养基重悬细胞，每孔加入1毫升，并将培养板置于20摄氏度、空气环境下的密闭加湿 chamber 中。为了使分离的秀丽隐杆线虫胚胎细胞发生分化，细胞必须黏附于基质。分化过程通常在接种后约2至3小时开始，并持续约24小时。体外的形态特征与体内极为相似。例如，如图所示，LM 和 PLM 触觉神经元仅发育出两条神经突，其中一条长于另一条，这与体内的发育情况一致。这表明，驱动秀丽隐杆线虫细胞分化的部分分子机制是细胞自主性的，因此可以在体外重现。体外培养的细胞中也可以观察到具有细胞特异性的蛋白质标志物及翻译后修饰。例如，α微管蛋白仅在秀丽隐杆线虫的触觉神经元中发生乙酰化修饰，如图中所示，体外培养的触觉神经元可被抗乙酰化α微管蛋白抗体特异性染色。此外，如本图所示，体外培养的触觉神经元表达了毒性突变通道MEC-4D，该突变通道在体内会导致触觉神经元的死亡。从MEC四DPE 4G FP品系中分离的表达GFP的神经元在培养初期存在，但随后发生退化。然而，与体内情况一样，如本图所示，通过IDE和丹曲林处理可挽救这些细胞免于死亡。采用膜片钳技术研究海兔培养细胞中的钾离子、非选择性离子以及多巴胺转运体依赖性通道。由于细胞体积较小，玻璃移液管必须具有细小的尖端，同时具备较宽的锥形部分，以抵消输入电阻的增加。此外，与通过抽吸获得全细胞记录（可能损伤细胞）相比，在移液管尖端下的膜片上施加高电压脉冲更有利于成功记录。在本图中，为了研究电压门控钙通道的作用，使用ION four对膜进行穿孔，并校准表达钙指示蛋白Chameleon YC2.12的触觉神经元，以进行钙成像，实验在有钙或无钙条件下进行。此外，已确定触觉神经元中的平均游离钙浓度为 200 纳摩尔。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何分离和培养秀丽隐杆线虫的胚胎细胞。

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