一种用于制备天然去细胞肠道基质的脱细胞方法
2013年10月7日
本文描述了一种从大鼠肠道制备无细胞基质的方法。肠道支架的构建对于组织工程、干细胞生物学以及药物测试等未来应用具有重要意义。
本实验的总体目标是为肠道组织工程构建一种天然的脱细胞支架。首先，通过插管大鼠肠系膜上动脉（SMA），连同血管通路一并获取小肠组织。第二步，冲洗肠腔内残余物，并将肠腔内和血管插管连接至蠕动泵。
接下来，在4摄氏度条件下，用去离子水对小肠灌注24小时。最后一步中，在室温下用脱氧胆酸钠、Coate和DNA对小肠进行灌注。最终，可通过组织学和电子显微镜分别观察小肠的完全脱细胞效果及其结构和组分。
目前我们面临着肠功能衰竭这一临床难题，这是一种影响儿童和成人的严重疾病。肠外营养和传统移植方法均无法提供完全治愈。如以下视频所示，三维血管化肠道支架的制备，为肠功能衰竭的治疗提供了新的方向。
该技术的显著之处在于，使用温和的脱细胞化学试剂能够保留肠道的微观结构，电子显微镜结果清晰地证明了这一点。此外，在脱细胞处理后仍可维持层级化的血管网络结构，从而允许将该支架结构重新连接至宿主的血液供应系统。开始操作时，先将两根导管连接至蠕动泵，然后以最大流速让70%乙醇流经蠕动泵导管15分钟，随后用新配制的含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS AA）再冲洗15分钟。
在冲洗泵喷头后，用70%乙醇擦拭已处死的250至350克Spra Dolly大鼠的腹部。然后使用经高压灭菌的外科器械，在腹部做XO耻骨横切口（XO pubic laparotomy incision），以暴露清晰的手术视野，将小肠移至动物右侧，并置于喷有70%乙醇的纸巾上。注意持续用PBS-AA润湿肠道，以防止组织脱水以及细胞外基质变性。
接下来，找到肠系膜上动脉（SMA），该动脉以90度角从主动脉发出，走向肠道。在SMA周围放置缝线并准备打结。使用27号套管从主动脉插入SMA，然后迅速撤出针头，以避免撕裂血管壁。
现在将套管的塑料管推进至肠系膜上动脉（SMA）中，用Vicryl 5-0缝线固定导管，然后注入10毫升PBS-AA以确认插管成功。接着，使用剪刀在SMA近端和远端切开主动脉，以松解套管，防止在分离大肠时粪便泄漏；在回盲交界处近端打一个丝线5-0结，在乙状结肠远端打另一个丝线5-0结。然后在两个结扎线之间切断末端回肠和结肠，并移除大肠。
现在在十二指肠连接处切断小肠，并分离小肠与腹腔之间可能存在的任何结缔组织。将小肠转移至含有PBS aa的培养皿中。然后使用塑料后端移液器对肠管近端进行插管，并用缝线固定。
最后，将移液管剪裁至可适配60毫升注射器的接头锁，然后用两轮各60毫升的PBSAA溶液冲洗肠腔，以去除所有粪便和碎片。在开始脱细胞过程前，确保肠腔和血管套管内无气泡存在。随后，将一个三通止流夹连接至血管套管，并将培养皿放入容器中以收集任何溢出的溶液。接下来，启动Masterflex LS可调速滚轴泵，以每小时0.6毫升的速度通入去离子水。
小心操作组织，确保气泡从远端排出。一旦套管中的所有气泡均被去除，将装置转移至冷室。随后通过以每小时 0.6 毫升的流速持续灌注去离子水 24 小时，开始脱细胞过程，灌注同时进行于肠腔和血管系统。
定期检查装置，确保所有连接处均牢固。肠道内无泄漏且无气泡产生。24小时后，将脱细胞装置移回室温环境。
在抽吸罩下，肠道的颜色应变为浅粉色。称取足量的脱氧胆酸钠，以配制300毫升去离子水中4%的溶液。使用涡旋振荡器混匀溶液，直至澄清。
现在，将去离子溶液更换为脱氧胆酸钠溶液。检查连接处，排除所有气泡，并以每小时0.6毫升的速度灌注小肠，持续四小时。
脱氧胆酸钠处理步骤后，组织会变得透明。向泵中加入PBS AA后，血管网络的完整性也变得清晰可见。用PBS AA冲洗肠道30分钟，以避免脱氧胆酸钠与DNA之间发生任何相互作用。
然后以每小时0.6毫升的速度，在室温下用新配制的DNA溶液灌注组织。三小时后，将支架转移至组织培养超净台中，并采用无菌技术更换培养板。通过让乙醇流经管路，对蠕动泵的管路进行重新灭菌。
用PBSAA溶液最后一次清洗肠道30分钟，以确保彻底去除脱细胞溶液的所有残留物。最后，将支架转移至紫外交联仪中，运行两个循环的灭菌程序。随后将支架保存于PBSAA溶液中。
每隔三天更换一次溶液。脱细胞成功后，支架的宏观外观应与天然肠道相似，但管壁呈半透明状。通过血管树的通畅性，也应能明显观察到大体结构的保留情况。
当通过SMA插管注入染料时，染料应均匀分布于整个支架中，并到达毛细血管树。支架应无细胞核和细胞质成分，这一点可通过DNA定量试剂盒和简单的组织学分析进行评估。本图所示的苏木精-伊红染色应显示无细胞核和细胞质成分的存在，同时保留小肠各层结构。
特别是，通过扫描电子显微镜应能明显观察到管腔侧绒毛和皱襞的保存情况。此外，如图所示，还应预期到胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖等细胞外基质成分得到了进一步的保留。例如，马松三色染色可用于显示支架中完整的结缔组织。
观看本视频后，您应能充分理解如何构建天然细胞肠道支架。
概述
本文介绍了一种从大鼠肠道制备脱细胞基质的方法，该方法在组织工程和药物测试应用中至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 干细胞生物学
- 药物测试
背景
- 肠功能衰竭是一种影响儿童和成人的严重疾病。
- 传统的治疗方法（如肠外营养和器官移植）常常效果有限。
- 开发一种三维血管化肠道支架可为治疗提供新的选择。
- 保持肠道微观结构的完整性对于支架功能至关重要。
研究目的
- 开发一种用于肠道组织工程的天然脱细胞支架。
- 可视化脱细胞过程及支架结构。
- 解决肠道功能衰竭的临床问题。
使用的方法
- 插管大鼠肠系膜上动脉以获取小肠。
- 用去离子水和脱氧胆酸钠灌注小肠。
- 通过组织学和电子显微镜分析评估脱细胞效果。
- 在脱细胞过程中保持血管网络的完整性。
主要结果
- 脱细胞过程成功保留了肠道结构。
- 血管网络保持完整，具备再血管化的潜力。
- 组织学分析证实细胞成分被完全去除。
- 支架的宏观形态与天然肠道相似。
结论
- 所开发的方法为构建肠道支架提供了一种有前景的途径。
- 该技术可能有助于提升未来针对肠道功能衰竭的治疗方案。
- 仍需进一步研究以探索这些支架在体内的功能性整合。
常见问题
行业重要性概述
构建可血管化的脱细胞肠道支架解决了肠道功能衰竭建模及再生治疗评估中的关键空白。该脱细胞方法保留了绒毛-隐窝轴及细胞外基质结构，从而实现对支架整合与功能更可预测的临床前评估。通过维持通畅的血管网络，该方法支持潜在的再血管化策略，降低了早期肠道组织工程研究中机制解释的不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在生理相关的肠道微环境中研究宿主-支架相互作用及细胞外基质信号传导。
- 操作价值：提供一种可重复的去细胞化组织模型，用于评估生物材料相容性和细胞浸润，且不受混杂免疫因素的干扰。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供具有保留微结构的标准化支架，用于在可控灌注条件下评估细胞接种效率、迁移和分化。
- 操作价值：通过血管插管和灌注实现支架的稳定生产，支持检测的可扩展性，便于对治疗候选物进行高通量筛选。
转化与临床前研究
- 科学价值：保留与疾病相关的结构信号（绒毛-隐窝轴、胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖），为支架在体内的重塑和整合提供可预测的建模依据。
- 操作价值：实现对血管通畅性和细胞外基质稳定性的长期评估，对于降低肠道再生医学项目推进决策的风险至关重要。
流程与工作流整合
该方法通过提供一种特性明确的无细胞支架，支持肠道组织工程中的假设验证、细胞行为研究的检测就绪性，并借助保留的组织结构和血管网络实现转化研究的连续性，从而契合从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：在类原生肠道微环境中支持对细胞外基质依赖性通路及细胞反应的假设验证。
- 筛选：提供即用型支架，具有可重复的微结构和可灌注的血管系统，适用于标准化的细胞评估。
- 分析：通过DNA定量、组织学和电子显微镜技术对脱细胞效果进行定量评估，以确认支架的纯度和结构完整性。
- 转化研究：保留肠道特异性的细胞外基质成分和血管结构，支持支架整合及宿主重塑的临床前验证。
- 企业级复用：建立可扩展的、基于灌注的脱细胞平台，适用于多种组织类型，减少器官特异性支架项目的重复开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过保留肠道微结构和细胞外基质成分，提高临床前疗效评估中的预测可信度，减少假阴性结果。
- 操作价值：通过标准化灌注参数和脱细胞试剂浓度，确保实验可重复性，最大限度降低批次间差异。
- 战略价值：提供可血管化的支架模型，更准确预测体内整合情况和功能结局，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：利用经过验证的支架模型，实现对肠道再生候选方案的风险调整优先排序，降低后期生物学失败率。
实施注意事项
- 脱细胞过程中需具备显微外科血管插管和灌注系统搭建的专业技术，以维持支架的完整性。
- 依赖于蠕动泵、无菌管路以及受控温度环境（4°C 和室温）的获取，以完成分步灌注操作。
- 需要建立标准化的试剂配制流程（如 4% 脱氧胆酸钠、DNA酶）和质量控制方法，以确保完全去除细胞成分的同时不损伤基质结构。
- 在扩大肠段尺寸或应用于不同物种时，需调整灌注压力和时间参数，以保持绒毛-隐窝结构的完整性。
- 实际操作中的限制因素包括灌注过程中必须仔细去除气泡，以防止血管损伤并确保支架内脱细胞的均匀性。
