Name: 在FDA批准的Vero细胞疫苗开发产生重组沙粒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解在FDA批准的Vero细胞中利用质粒DNA转染和免疫荧光技术产生重组沙粒病毒的标准化流程，该方法具有高重复性，可用于疫苗种子开发和抗病毒药物筛选研究。

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我们感谢JCT和LM-S实验室的历任及现任成员在沙粒病毒反向遗传学技术与质粒的开发与改进方面所做的贡献。我们同时感谢Snezhana Dimitrova提供的技术支持。针对JUNV NP的单克隆抗体（SA02-BG12）由BEI资源库（NIAID生物防御与新发传染病研究资源库）提供。BYHC的研究得到美国国家研究服务奖（Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）资助项目GM068411的支持。EO-R曾获得富布赖特-CONICYT奖学金（BIO 2008）和罗切斯特疫苗研究奖学金（2012）。EO-R目前由罗切斯特大学教师发展与多样性办公室资助的“多样性与学术卓越博士后奖学金”支持。LM-S实验室的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、NIAID流感研究与监测卓越中心项目（HHSN266200700008C）以及罗切斯特大学生物防御免疫建模中心（HHSN272201000055C）提供经费支持。
JCT实验室的研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目RO1 AI047140、RO1 AI077719和RO1 AI079665的支持。

1. 沙粒病毒拯救转染
我们的拯救系统基于使用两种质粒：一种是利用RNA聚合酶II表达核蛋白（NP）和依赖RNA的RNA聚合酶（L）的表达质粒，这两种病毒反式作用因子是沙粒病毒基因组RNA复制和基因表达所必需的7, 19；另一种是能够通过细胞RNA聚合酶I（pol-I）指导S和L抗原组RNA在细胞内合成的质粒7。在本研究中，我们使用pCAGGs蛋白表达质粒，该质粒含有鸡β-肌动蛋白启动子及多聚腺苷酸化（pA）信号序列，以及人源pol-I质粒，该质粒含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠终止子序列（图2）。S和L RNA片段以抗基因组方向克隆至hpol-I质粒中，以便在hpol-I转录时生成基因组RNA片段。为拯救野生型重组淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（rLCMV）和Candid#1（rCandid#1），将分别来源于这两种病毒的pCAGGs-NP和pCAGGs-L质粒，与其对应的人源pol-I S和L RNA片段共同转染细胞（图3）。重组三片段LCMV（r3LCMV）和Candid#1（r3Candid#1）的拯救采用类似方案，但将S片段拆分为两个不同的pol-I S质粒，每个质粒编码一个独特的报告基因：其中一个质粒中，NP开放阅读框（ORF）被绿色荧光蛋白（GFP）报告基因取代（hpol-I S GFP/GP）；另一个质粒中，病毒糖蛋白前体（GPC）ORF被Gaussia荧光素酶（Gluc）报告基因取代（hpol-I S NP/Gluc）。该方案的示意图见图4。以下转染与感染操作流程适用于6孔板。
<ol>
	<li>OptiMEM-Lipofectamine 2000（LPF2000）混合液： 准备250 μl OptiMEM培养基，并根据病毒拯救实验的需要，每转染反应加入10–12 μg LPF2000（1 μg/μl）（见表1）。建议LPF2000与DNA的质量比为2.5 μg : 1 μg。室温孵育5–10分钟。在此期间，在另一个微量离心管中准备质粒转染混合液（步骤1.2）。</li>
	<li>质粒DNA转染混合液： 在微量离心管中，根据每种病毒拯救实验推荐的量配制质粒转染混合液（见表1）。用OptiMEM将最终体积调至50 μl。</li>
	<li>OptiMEM-LPF2000-DNA质粒混合液： 将250 μl OptiMEM-LPF2000混合液（步骤1.1）加入质粒DNA转染混合液（步骤1.2）中。室温孵育20–30分钟。在此期间，准备并计数每转染反应所需的1 × 106个Vero细胞。Vero细胞将以悬浮状态进行转染。</li>
	<li>Vero细胞的准备： Vero细胞在100 mm培养皿中培养。实验开始前，将1×PBS、含10% FBS和1% PS的DMEM培养基以及胰蛋白酶-EDTA混合液预热至37 °C。
	<ol>
		<li>用5 ml 1×PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入1 ml胰蛋白酶-EDTA消化细胞，直至细胞脱落（约5分钟）。可轻敲培养皿以帮助细胞完全脱落。</li>
		<li>在15 ml离心管中，用10 ml含10% FBS和1% PS的DMEM培养基轻柔重悬细胞。</li>
		<li>在离心机中以1,000 rpm离心5分钟。</li>
		<li>用10 ml含10% FBS和1% PS的DMEM培养基重悬细胞，使用血细胞计数板计数，并调整细胞浓度至1 × 106个/ml。观察发现，每转染反应使用0.5–1 × 106个Vero细胞可获得最佳结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>混合LPF2000/DNA与细胞： 在室温孵育20–30分钟后（步骤1.3），向OptiMEM-LPF2000-DNA质粒混合液中加入1 ml Vero细胞（1 × 106个）（步骤1.4），室温孵育5分钟。</li>
	<li>将LPF2000/DNA-细胞混合物接种至6孔板： 将DNA-LPF2000-Vero混合液（步骤1.5）加入6孔板的各孔中。轻轻摇动6孔板，然后在37 °C、5% CO2的培养箱中过夜孵育。</li>
	<li>更换转染培养基： 转染后约16–24小时，移除转染培养基，加入2 ml感染培养基，并继续孵育转染细胞48小时。</li>
	<li>细胞传代： 在感染培养基中孵育48小时后，收集组织培养上清液（TCS），并将转染后的细胞传代至100 mm培养皿中。TCS中通常不含感染性病毒，因为转染细胞需要进一步孵育才能产生病毒颗粒。进行细胞传代时：
	<ol>
		<li>用2 ml 1×PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入0.5 ml胰蛋白酶-EDTA消化细胞，直至细胞脱落。</li>
		<li>在1.5 ml微量离心管中，用1 ml含10% FBS和1% PS的DMEM培养基重悬细胞。</li>
		<li>在微量离心机中以5,000 rpm、4 °C离心5分钟。</li>
		<li>小心地用1 ml感染培养基重悬细胞，并将细胞转移至100 mm培养皿中。用感染培养基将培养皿中的总体积补至8 ml，该体积足以防止细胞干燥，并有利于病毒浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻摇动100 mm培养皿，并在37 °C、5% CO2的培养箱中继续孵育Vero细胞72小时。</li>
	<li>TCS的收集： 孵育72小时后，将TCS收集至15 ml离心管中。在离心机中以2,500 rpm离心5分钟以去除细胞碎片。感染性沙粒病毒存在于TCS中，因此应弃去细胞碎片沉淀，将TCS储存于-80 °C。</li>
</ol>
2. 重组沙粒病毒拯救的确认
通过焦点形成单位（FFU）免疫荧光检测法（IFA）可检测rLCMV和rCandid#1的成功拯救。对于野生型病毒的拯救，我们使用针对病毒NP的特异性抗体。r3LCMV和r3Candid#1编码两个报告基因（GFP和Gluc），因此可通过荧光显微镜（GFP）和/或发光检测（Gluc）实现病毒的检测与滴定，无需使用抗体。
<ol>
	<li>确认野生型重组沙粒病毒的拯救：滴定前一天，用 PBS 清洗 Vero 细胞两次，胰酶消化后接种至 96 孔板，使次日细胞融合度达到 80–90%（每孔 4 × 104 个细胞）。手动轻轻摇晃培养板，使细胞分布均匀。将细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养过夜。在进行感染前，于显微镜下检查细胞，确认形成单层细胞：
	<ol>
		<li>将从转染细胞（100 mm 培养皿）中回收的含病毒 TCS（步骤 1.10）用 OptiMEM 进行连续十倍梯度稀释。</li>
		<li>移除接种的 Vero 细胞中的培养基，用 50 μl 1× PBS 洗涤两次，每孔加入 50 μl 梯度稀释的病毒进行感染（步骤 2.1）。在 37 °C、5% CO2 条件下感染 1.5 小时。</li>
		<li>感染后，移除病毒接种液，每孔加入 100 μl 感染培养基，继续培养 16–18 小时。若培养超过 18 小时可能发生病毒再感染，导致病毒滴度被高估。</li>
		<li>感染后 16–18 小时，移除各孔中的 TCS，用 PBS 稀释的 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 15 分钟。</li>
		<li>随后移除固定液，用 PBS 稀释的 0.1% Triton X-100 在室温下对细胞进行 10 分钟透化处理。</li>
		<li>吸除透化液，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。</li>
		<li>用含 2.5% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS（封闭液）在室温下封闭细胞 1 小时。或者，也可在 4 °C 下封闭过夜，次日继续进行抗体孵育。</li>
		<li>同时准备一抗。将 LCMV 和 Candid#1 特异性的一抗用封闭液稀释，然后将抗体/封闭液混合物在 3,500 rpm 下离心 15 分钟。检测 rLCMV 可使用单克隆抗 LCMV NP 抗体克隆 1.1.3（1:30 稀释）16，检测 rCandid#1 可使用 BEI Resources 提供的单克隆抗 JUNV NP 抗体 SA02-BG12（1:500 稀释）。</li>
		<li>封闭 1 小时后，吸除封闭液，每孔加入 50 μl 一抗，在 37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>在此期间，将二抗用封闭液稀释，然后将抗体/封闭液混合物在 3,500 rpm 下离心 15 分钟。为获得 图 5 中所示图像，使用了用于检测一抗单克隆抗体的兔抗小鼠 IgG FITC 多克隆二抗。</li>
		<li>一抗孵育 1 小时后，吸除一抗，用 1× PBS 洗涤 3 次，每孔加入二抗，在 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>二抗孵育 30 分钟后，吸除二抗，用 1× PBS 洗涤 3 次。此时细胞即可用于荧光显微镜观察，通过计数每毫升的焦点形成单位（FFU/ml）来评估病毒拯救是否成功并进行滴定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>r3LCMV 和 r3Candid#1 病毒拯救：由于这些病毒表达两个报告基因，其拯救可通过荧光显微镜检测 TCS 中的 GFP 表达或 Gluc 表达进行监测。也可通过检测 TCS 中 Gluc 的表达来确认拯救成功。对于三节段病毒的滴定，我们遵循 步骤 2.1 至 2.1.4，但由于存在 GFP 表达，无需固定细胞即可判断病毒拯救是否成功。病毒滴度通过计数 FFU/ml 确定。为通过 Gluc 表达判断病毒拯救是否成功，可使用 Gluc 检测试剂盒（Biolux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒，New England Biolabs）检测 TCS 中的 Gluc 表达。具体操作如下：
	<ol>
		<li>将 100 μl TCS 加入 96 孔白色培养板中（平底微孔板，Fisher Scientific）。</li>
		<li>设置化学发光仪（LumiCount，Packard Biosciences）。</li>
		<li>向每个样品中加入 50–100 μl Gluc 检测试剂（按制造商推荐量），使用化学发光仪检测 Gluc 报告基因的表达。作为阴性对照，检测野生型病毒感染细胞后 TCS 中的 Gluc 表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织培养上清液的传代
病毒拯救依赖于转染效率。已有研究表明，Vero 细胞的转染效率低于其他细胞系14。如果TCS中的病毒滴度较低，可在多重感染指数（MOI）为0.01（LCMV）或0.1（Candid#1）的条件下感染新鲜Vero细胞，培养72小时以扩增病毒。

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</ol>

未声明利益冲突。

利用基于质粒的反向遗传学技术生成重组沙粒病毒已成为研究沙粒病毒生物学多个方面的常用方法。本文记录了现有系统的一项关键改进，即在Vero细胞中进行沙粒病毒的拯救，从而有望开发出针对沙粒病毒的美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗候选株，以及用于其他传染病的疫苗载体。
实验操作步骤总体上已较为成熟，通常不会造成显著困难。然而，为确保实验稳定成功，有几个因素需要密切监控。Vero 细胞的正确维护对于成功拯救病毒至关重要。此外，必须具备高质量的质粒制备物，以生成重组沙粒病毒（参见实验方案中关于细胞培养和质粒制备的正确方法）。在拯救 rLCMV 和 rCandid#1 野生型病毒或其三节段版本时，建议每种重组病毒进行三次独立的转染，以提高成功拯救的概率，因为 Vero 细胞不易被转染14。若同时尝试拯救多种重组病毒，应根据待拯救病毒的数量相应扩大以下步骤的规模。作为阴性对照，我们设置了不加入 pCAGGs NP 的转染组（-pCAGGs NP）。
由于LCMV和Candid#1感染的细胞不表现...

沙粒病毒是一类具有双分段负链RNA基因组的有包膜病毒，属于沙粒病毒科（Arenaviridae）3。沙粒病毒的基因组通过两个独立的病毒片段以双向编码方式编码四种蛋白质3。大（L）片段编码RNA依赖性RNA聚合酶（L）和小型RING（Really Interesting New Gene）指蛋白（Z），后者是病毒出芽的主要驱动力。小（S）片段编码病毒核蛋白（NP）和表面糖蛋白（GP）（图1）。
沙粒病毒科（Arenaviridae）的多个成员可导致人类致命性出血热（HF）3。其中主要令人关注的是拉沙病毒（LASV）和胡宁病毒（JUNV），已知这两种病毒在住院患者中具有较高的致死率8, 9。尽管这些病毒分别在西非和阿根廷农村地区呈地方性流行，但由于旅行活动日益频繁，LASV 和 JUNV 被输入非流行地区的风险正不断增加10。此外，虽然原型沙粒病毒——淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）通常不与人类严重疾病相关，但它被认为是一种被忽视的病原体，因为在免疫功能低下患者中已出现致死性感染病例6, 15，并且该病毒还可导致孕妇发生先天性出生缺陷和自然流产2, 13。目前尚无获得美国食品药品监督管理局（US FDA）批准的针对沙粒病毒的疫苗，治疗手段仅限于使用核苷类似物利巴韦林，但其疗效有限，且常伴随显著的副作用。
基于质粒的反向遗传学技术的建立4以及重组沙粒病毒的获得7, 19极大地推动了沙粒病毒研究领域的发展。目前，由于小鼠RNA聚合酶I（pol-I）启动子具有物种特异性，能够驱动S和L基因片段的初始转录，因此通常使用啮齿类动物细胞（如BHK-21细胞）来生成重组沙粒病毒。然而，在BHK-21细胞中进行病毒拯救的方法尚未被批准用于制备潜在的疫苗种子候选株。本文中，我们记录了在Vero细胞中利用人源pol-I启动子高效拯救典型旧世界（OW）淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）和新世界（NW）胡宁病毒Candid#1株的方法。采用类似的方法，我们构建了含有两个额外外源基因的重组三分段LCMV（r3LCMV）和Candid#1（r3Candid#1）沙粒病毒，这两个外源基因分别编码于两个不同的S RNA片段中5。这一新系统不仅具有高度可重复性和操作简便的特点，还可立即应用于制备作为潜在疫苗或疫苗载体种子的重组沙粒病毒。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料与方法&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;细胞系&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;Vero E6（非洲绿猴肾上皮细胞）在37 &amp;deg;C 恒温培养箱，含 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在含10% FBS和1% PS的DMEM中。细胞可从美国典型培养物保藏中心（ATCC，目录号CRL-1586）获得。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;质粒&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;除 hpol-I L 外，所有质粒均可在 37 ℃ 下培养 &amp;deg;C，培养16-18小时。我们建议在30℃下培养hpol-I L细胞 &amp;deg;C 培养 24 小时。质粒使用质粒大提试剂盒（EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit，Omega Bio-tek）按照制造商说明书进行制备，并储存于 -20 &amp;deg;C. 通过在260 nm处进行分光光度法测定纯化后的DNA质粒浓度，并利用260:280 nm比值评估其纯度。260:280 nm比值在1.8–2.0之间的样品被认为适用于病毒拯救实验。此外，应通过琼脂糖凝胶电泳进一步确认质粒的浓度和纯度。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;病毒&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;所述的rLCMV（Armstrong 53b）和rCandid#1病毒拯救方案可在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。受污染的材料（包括TCS和细胞）在丢弃前应进行灭菌处理。其他沙粒病毒的拯救可能需要更高级别的生物安全实验室设施，因此必须遵循适当的安全与防护措施。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;组织培养基与溶液&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;&lt;strong&gt;DMEM 10% FBS 1% PS&lt;/strong&gt; 445 ml 改良型杜尔贝科氏伊格尔培养基（DMEM）、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100倍青霉素/链霉素（PS）。4 ℃保存 &amp;deg;C. 此培养基将用于Vero细胞的维持。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;感染性培养基：&lt;/strong&gt; OptiMEM 与含 10% FBS 和 1% PS 的 DMEM 按 2:1 体积比混合。4 ℃ 保存。 &amp;deg;C. 此培养基将用于病毒感染过程。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）：&lt;/strong&gt; 80 g 氯化钠，2 g 氯化钾，11.5 g 氯化钠&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;. 加入ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最多加至1升，调节pH至7.3，通过高压灭菌法灭菌，室温保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1× PBS：&lt;/strong&gt; 将10X PBS用ddH₂O按1:10比例稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 高压灭菌后室温保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;2.5 % BSA&lt;/strong&gt;：2.5 g BSA 溶于 97.5 ml 1X PBS 中。4 ℃ 保存 &amp;deg;C. 此溶液用于IFA的封闭。 </td></tr></tbody></table>

在 fda 批准的 vero 细胞中生成用于疫苗开发的重组沙粒病毒

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

沙粒病毒反向遗传学技术的建立与应用是沙粒病毒研究领域的一项重大突破4。基于细胞的沙粒病毒最小基因组系统，结合在基因组中引入预设突变以产生重组感染性沙粒病毒的能力，极大地促进了对病毒决定因子在沙粒病毒生命周期各个阶段、病毒与宿主相互作用以及沙粒病毒致病机制中作用的研究1, 3, 11。此外，三节段沙粒病毒的开发使得利用沙粒病毒基因组表达额外的外源目的基因成为可能，从而为基于沙粒病毒的疫苗载体应用开辟了新途径5。同样，能够表达报告基因的单周期感染性沙粒病毒的开发，为涉及高致病性人类沙粒病毒的研究提供了新的实验工具，有助于提升研究的安全性16。迄今为止，利用质粒依赖的反向遗传学技术生成重组沙粒病毒主要依赖于啮齿类动物细胞系7,19，这在一定程度上限制了获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗或疫苗载体的开发。为克服这一障碍，本文描述了在FDA批准使用的Vero细胞中高效生成重组沙粒病毒的方法。

通过免疫荧光分析法（IFA）检测到病毒抗原的存在，可确认成功拯救出重组野生型沙粒病毒（图5）。对于重组三分段病毒，可通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达来评估病毒拯救是否成功（图6A）。进一步通过检测Gluc的表达来确认拯救是否成功（图6B）。上述代表性结果是采用前述实验方案获得的，展示了野生型及三分段沙粒病毒成功拯救的实例。
<img alt="沙粒病毒基因组结构与病毒颗粒结构示意图，显示RNA组分及蛋白质标注。" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 沙粒病毒基因组结构与病毒颗粒结构。沙粒病毒是一类具有包膜的负链RNA病毒，其基因组分为两个片段3。每个片段采用双向编码策略，可在...

从克隆的cDNA中拯救重组沙粒病毒，这一方法被称为反向遗传学，可使研究人员探究特定病毒基因产物及其不同结构域和残基在沙粒病毒生物学多个方面所起的作用。同样，将反向遗传学技术应用于经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疫苗开发的细胞系（Vero）中，为研制有效且安全的疫苗以对抗人类致病性沙粒病毒提供了新的可能性。

在 FDA 批准的 Vero 细胞中生成用于疫苗开发的重组沙粒病毒

沙粒病毒反向遗传学系统的建立与应用是沙粒病毒研究领域的一项重大突破4。基于细胞的……

本实验的总体目标是展示一种简单且高度可重复的方案，用于在经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Vero细胞中生成重组沙粒病毒，以用于潜在的疫苗或疫苗载体种子的开发。该目标首先通过谨慎制备质粒DNA转染混合物来实现；第二步是将Vero细胞用该质粒DNA转染混合物进行转染。接下来，需要将转染的细胞扩增至100毫米培养皿中。最终，通过免疫荧光法检测野生型病毒或双荧光显微镜观察，以及使用三段式病毒检测GIA荧光素酶的表达，来确认病毒拯救是否成功。与现有的方法（如病毒拯救和Rine细胞系）相比，本方案可在Vero细胞中生成肾源性病毒，而Vero细胞已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疫苗开发。除了可用于制备潜在的疫苗种子外，所报道的表达三节段基因的病毒还可应用于高通量筛选针对VIRs的抗病毒药物，且无需进行病毒检测的二次检测。首先，准备250微升的最适培养基，根据病毒种类，每转染使用10至12微克的Lipo 2000，在室温下孵育5至10分钟。在此期间，于另一支微量离心管中配制质粒转染混合物，各病毒拯救所需的质粒用量请参照推荐方案。用最适体积将终体积调至50微升。随后，将250微升最适脂质混合物加入血浆DNA转染混合物中，在室温下孵育20分钟。为准备Vero细胞，首先将含10%FBS和1%青霉素-链霉素的PBS-DMEM培养基以及胰蛋白酶-EDTA混合液预热至37摄氏度；用于收集细胞，用5毫升PBS洗涤细胞培养物两次。如需要，加入1毫升胰蛋白酶EDTA以使细胞脱离，轻轻拍打培养容器使细胞完全脱落。现在将细胞重悬于15毫升离心管中的10毫升完全DMEM培养基中。然后以1000 RPM离心5分钟，再将细胞重悬于10毫升完全DMEM培养基中。计数细胞，并将浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞。室温孵育20至30分钟后，向Vero细胞中加入1毫升最适lemine、DNA质粒混合物，室温孵育5分钟。现在将脂质体-DNA-细胞混合物接种至6孔板中。轻轻摇晃后放入培养箱。转染后16至24小时，移除转染培养基，加入2毫升感染培养基，继续培养细胞48小时。传代前，移除组织培养上清液，用1倍PBS洗涤两次，并按前述方法用胰蛋白酶处理冰上细胞。然后将细胞重悬于1 mL完全DMEM培养基中，于4 °C、5,000 ×g离心5分钟以收集细胞。小心地将细胞沉淀重悬于1 mL感染培养基中，并将细胞转移至100 mm培养皿中。加入感染性培养基，将培养板中的总体积补至8毫升，此体积足以防止细胞干燥，并有利于病毒的浓缩。转染细胞培养后，轻轻摇动100毫米培养皿，使细胞形成均匀的单层。72小时后，收集组织培养上清液，离心去除细胞碎片，并于滴定前一天将上清液保存在-80摄氏度条件下。用 PBS 和冰冷的胰蛋白酶洗涤 Vero 细胞两次。将细胞重悬于 10 毫升完全 DMEM 培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将浓度调整为每孔 4 × 10⁴ 个细胞，然后准备 96 孔板，使细胞融合度达到 80% 至 90%。第二天，用手轻轻摇动培养板，使细胞分布均匀。在感染当天，将细胞培养过夜。在进行感染前，于显微镜下检查细胞，确认形成单层。现在，将之前回收的含有病毒的组织培养上清液在96孔板中用最适条件进行连续稀释，然后吸去接种了Vero细胞的培养基。用50 µL PBS洗涤两次，再用50 µL连续稀释的病毒液感染细胞。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下感染细胞一个半小时。随后，每孔移除100微升感染培养基，继续将细胞孵育16至18小时。现在，从每个孔中移除组织培养上清液。在室温下用 PBS 稀释的 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。然后去除多聚甲醛，再用 0.1% Triton X-100 在室温下透化 10 分钟。接着吸除透化液，用 100 微升 PBS 洗涤细胞三次，并用含 2.5% 牛血清白蛋白的 PBS 封闭细胞。将针对沙粒病毒蛋白的特异性一抗用2.5% BSA稀释后，以3,500 RPM离心15分钟。用PBS洗涤细胞三次后，加入一抗，于37°C孵育1小时；随后加入适量的荧光标记四抗，在37°C孵育30分钟。孵育结束后，移除二抗，并用100 µL PBS洗涤三次。接下来通过荧光显微镜计数荧光灶形成单位来测定滴度。方法类似于野生型重组沙粒病毒。首先对组织培养上清液中的三节段病毒进行连续稀释，然后接种于96孔板中的Vero细胞，孵育16至18小时后，通过荧光显微镜计数荧光灶形成单位来测定病毒滴度。或者，使用96孔白色培养板中的100微升组织培养上清液，通过Gaia荧光素酶表达来检测病毒拯救是否成功。按照制造商的建议设置发光仪。向每个样品中加入50至100微升Gaia检测溶液。然后使用发光仪检测Gaia报告基因的表达，作为阴性对照。检测野生型病毒感染细胞中TCS的Gaia表达。沙粒病毒科病毒为包膜型负链RNA病毒，其基因组分为两个片段。每个片段采用双向启动子策略来指导两种病毒蛋白的合成。以相反的方向，使用两种类型的拯救质粒在Vero细胞中产生重组沙粒病毒。PCA的表达质粒可指导病毒蛋白L和np的合成。人源聚合酶I质粒指导病毒RNA片段的合成。通过IFA在感染后16至18小时检测到病毒抗原，可确认重组野生型沙粒病毒的成功拯救。用组织培养方法使Vero细胞感染后，上清液中的细胞使用LCMV或犬源性病毒特异性抗体进行染色。在三片段分段的沙粒病毒拯救实验中，将人源聚合酶的一个质粒拆分为两个质粒：其中一个质粒中的NP被GFP取代，另一个质粒中的GP被Gaia基因取代。通过荧光显微镜观察GFP的表达情况，即可简单评估病毒拯救是否成功。此外，可通过检测 Gaia 表达来确认拯救是否成功。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何在 Vero 细胞中高效且可重复地拯救野生型和三节段结构的 arena 病毒。我们建议每种推荐病毒进行三次独立的转染，以提高成功拯救的概率，因为此类细胞不易转染。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在FDA批准的Vero细胞疫苗开发产生重组沙粒

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo...

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

本文介绍一种仅基于细胞感染的实验方案，与现有其他方案相比，该方案可将重组细小病毒的生产效率提高100倍以上。本方案依赖于使用一种新型的基于腺病毒5型的辅助病毒，该辅助病毒含有细小病毒VP转录单元（Ad-VP）。...

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我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。...

通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

该视频展示了一种构建耐冷重组流感病毒的方法。该方法包括将双向质粒转染至人源细胞，随后在较低温度下孵育，以获得适用于疫苗生产的病毒，这些病毒在较高温度条件下复制能力降低。...

生成用于疫苗的重组减毒流感病毒

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。...

从cDNA拯救重组新城疫病毒

火鸡疱疹病毒（HVT）被广泛用作重组疫苗的载体平台，以预防多种禽类疾病。本文介绍了一种简单且快速的重组HVT载体疫苗制备方法，该方法结合了NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体

通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。...

一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

本方法利用宿主范围选择及重组病毒的可视化鉴定，实现“无痕”重组痘苗病毒的构建。...

利用宿主范围与可视化筛选快速无缝构建重组痘病毒

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

在此，我们提供了一种高效价重组新城疫病毒的制备、纯化与定量的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt; 6 × 109 每毫升噬斑形成单位，提供适用于病毒定量的合适数量 体内 动物实验。为确保安全性而进行的额外质量控制检测 体内...

从尿囊液中制备高滴度重组新城疫病毒

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

了解在FDA批准的Vero细胞中利用质粒DNA转染和免疫荧光技术产生重组沙粒病毒的标准化流程，该方法具有高重复性，可用于疫苗种子开发和抗病毒药物筛选研究。

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