在 C. Elegans 中使用"冷冻裂解"进行抗体染色

本实验的总体目标是对秀丽隐杆线虫进行抗体染色。为此，首先将线虫冲洗后铺在载玻片上，并小心地将其夹在两张粘附性载玻片之间，随后在干冰上冷冻。接着，将载玻片分开以裂解线虫，并立即将其放入固定液中。

随后使用标准的抗体染色技术对线虫进行染色，通过荧光显微镜分析可观察到半完整线虫成功实现了抗体染色。该技术相较于现有的完整线虫固定方法的主要优势在于，它最大限度地减少了对样品的化学处理。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为制备载玻片和线虫的过程在操作上具有一定的挑战性。

该实验步骤将由我本人和来自我实验室的研究生 RTO Basu 共同完成。开始染色前的线虫平板制备时，首先将一块平的金属片置于干冰上冷却。使用蒸馏水和玻璃移液管冲洗。将生长在一个60毫米NGM平板（含细菌）上的线虫转移到1.5毫升微量离心管中。线虫可以是同步发育的，也可以是不同龄期的混合群体，但应避免使用含有大量菌丝（dowers）的平板，因为这类线虫难以裂解；同时避免使用饥饿状态的线虫，因其会增强自发荧光。整个过程中使用同一根玻璃移液管。

用蒸馏水将线虫冲洗三到四次，以去除细菌。随后，为收集大部分成虫，将其在实验台上静置三到五分钟。待线虫沉降至离心管底部后，吸除管中大部分液体，保留的水量约为线虫体积的两倍，但总体积至少为25微升。

用永久性墨水标记多聚赖氨酸载玻片的磨砂面，并将载玻片放置在实验台面上，靠近盛有干冰的容器，磨砂面朝上。此载玻片将作为底部载玻片。准备相同数量的洁净非多聚赖氨酸处理载玻片。

提供顶部载玻片。接下来，用移液器吸取约25微升含有线虫的水样，滴加到底部黏附载玻片上，并用移液器吸头侧面将线虫均匀铺展至载玻片中央区域。静置30秒至2分钟，使线虫沉降。

当蠕虫接触到载玻片时，其两端会粘附在上面。该操作中最困难的部分是在进行接下来的几个步骤时，防止蠕虫发生过度变形。最佳做法是保持耐心，提前准备好所有用具，并避免摄入过多咖啡因，以确保双手稳定。

用一只手握住底部载玻片，将顶部载玻片覆盖其上，使除磨砂部分外其余部分完全重叠。液体应使两张载玻片略微分开，以便线虫仍具有一定的活动性。切勿让载玻片相互滑动，否则会扭伤线虫。

接下来，用双手的拇指和食指小心地垂直向下按压顶部的载玻片。施加适当压力后，部分体型最大的两性个体将在载玻片边缘破裂。大多数成虫和幼虫会与载玻片接触，但会保持完整；此时需立即且小心地将载玻片放置在干冰上的金属片上，避免其滑动。一分钟内载玻片将呈现冻结状态，但需继续放置五分钟，以确保其完全冻结。

载玻片现已准备好进行固定。若不立即进行后续操作，可将载玻片置于标记好的盒子中，于-80°C保存数天。载玻片应在制备后约一周内使用。

长期储存后请勿使用这些载玻片。也可采用与前述类似的方法在载玻片上制备单个线虫。将一块平的金属放在干冰上冷却。

接下来，使用线虫挑取工具将单个线虫转移至NGM平板上的一滴水中，以去除其表面的细菌。线虫应充分喂食，以减少自发荧光。如有可能，根据需要重复将线虫转移至新的水滴，直至线虫完全脱离细菌。

接下来，按之前的方法制备上层和下层载玻片。然后在显微镜下观察，于下层载玻片经多聚赖氨酸处理的区域滴加 5 至 10 微升水。使用线虫挑取工具将最多 20 条线虫转移至水滴中。

蠕虫应沉降至接触粘性载玻片表面。然后如前所述放置上层载玻片，但不要施加压力，同时确保载玻片不会立即滑动。将载玻片置于干冰上的金属表面。

将样本置于干冰上保存 5 至 30 分钟，随后立即进行固定。这些载玻片不能长期保存，需即刻使用。为对线虫进行轻微固定，首先将盛有固定液的染色缸放在冰上预冷 10 分钟。

所需的溶液包括100%甲醇、100%丙酮和磷酸盐缓冲液。从干冰中迅速取出一对上下载玻片，快速扭开，立即将底部载玻片浸入冰冻甲醇中两分钟，丢弃顶部载玻片。接着，将载玻片从甲醇转移至冰冻丙酮中四分钟。

如果载玻片上的线虫较多，即使载玻片制备良好，大多数线虫也会在固定液中脱落。如果单条线虫的载玻片制备得当，线虫应仍能牢固附着。最后，将载玻片浸入盛有PBS的容器中，以洗去固定液。

载玻片现已可进行染色，并使用甲醛或戊二醛进行固定。首先将试剂级甲醛或戊二醛溶液用 PBS 稀释，使其终浓度为 0.5% 至 4%。分装后可于 -20 至 -30 摄氏度保存，并按需解冻使用。请注意，甲醛和戊二醛具有高毒性，操作时必须佩戴手套并在通风橱中进行。

从干冰中取出一对底部和顶部载玻片，立即迅速扭开。将带有线虫的底部载玻片放入带盖的平皿中，立即丢弃顶部载玻片，并用移液器在载玻片区域中央滴加 200 µL 固定液。固定液会在线虫所在位置部分冻结，随后融化并覆盖载玻片上更大的区域。

如果线虫未立即且完全地被固定液覆盖，请使用微量移液器添加更多固定液。注意不要让固定液溢出载玻片边缘。在培养皿中加入折叠好的湿润无尘擦拭布，以保持湿润环境。

请勿让擦拭物接触载玻片。固定完成后，将培养皿盖上盖子，室温下静置10分钟至过夜。然后使用移液器小心地将固定液连同游离的线虫转移至一个1.5毫升离心管中。随后将载玻片浸入含有PBS的染色缸中。

将含有线虫的离心管高速旋转30秒，使线虫沉淀。用PBS缓冲液冲洗线虫两次。随后与载玻片上的线虫平行进行染色处理。

抗体染色方案与载玻片上任何组织的标准方案相似，相关细节在随附文档中有详细描述。染色后，将载玻片转移至PBS中，并在4摄氏度下保存最多12小时，直至准备封片。进行封片时，从PBS中取出一张载玻片。

使用无绒布擦拭样品背面，然后迅速将其放在纸巾上短暂干燥。在蠕虫上方滴加约 20 微升封片介质，使介质与 PBS 的体积大致相等。置于载玻片上。

轻轻倾斜载玻片以混匀两种溶液。注意封片剂具有毒性。请握住磨砂边缘。

将载玻片倾斜，使溶液聚集在磨砂面附近。然后将一块24 × 60毫米的盖玻片的一边接触溶液，以尽量减少气泡的产生，气泡会加剧荧光淬灭并干扰观察。轻轻放下盖玻片。

如果产生气泡，可缓慢抬起盖玻片的一边，然后在不滑动盖玻片覆盖线虫的情况下，重新缓慢放下。如有需要，可添加更多PBS以消除气泡。

使用无绒布小心按压盖玻片和载玻片的边缘，使其边缘干燥。载玻片的边缘必须在盖玻片四周均可见，且不应过于湿润。密封盖玻片，并在边缘涂上两到三层指甲油。

切片密封并干燥后，清洁盖玻片和载玻片背面，将其放入载玻片架的孔中。密封后的载玻片可在4摄氏度下保存数天，或在零下20摄氏度下保存数周。DNA及大多数绿色染料的荧光会随时间减弱，如有需要（尤其是在使用油镜后），可添加更多指甲油重新密封盖玻片。

以下代表性图像来自细胞生物学实验课程中本科生首次进行一抗染色时所制备的载玻片。该图像展示了两个成年雌雄同体线虫头部的示例，其经过适当压片、裂解，并用甲醇-丙酮进行轻度固定，随后使用多种抗体和染料进行标记。

在这种情况下，几乎整个蠕虫均可被抗体接触。通过DPI染色显示细胞核的位置，可以指示蠕虫的哪些部分保持完整。当蠕虫经受更强的固定剂（如甲醛）处理时，其形态可能会发生扭曲。

这在这些图像中表现为红色显示的肌肉出现波浪状外观。使用较硬固定剂相关的另一个常见问题是特定组织的固定不均或渗透不均。此处可见，红色显示的肌肉仅在蠕虫的部分区域被染色。

此处，其他染色的存在（包括显示为蓝色的 DNA）表明至少部分虫体存在。通过练习，可以轻松识别出这种部分染色的模式，从而确定染色的整体分布情况，即使单个线虫的染色不均匀。本图还展示了在任何固定条件下使用冷冻裂解法时常见的问题。

最常见的问题是由于两张载玻片之间的相对运动导致样品扭曲。在压缩过程中，染色组织的形态表明，虫体在咽部后方稍许位置发生扭曲。该图像还显示了由于抗体黏附于载玻片上聚赖氨酸涂层而引起的背景染色问题。

通过使用共聚焦显微镜可以避免上述问题。需要注意的是，即使经过练习，仍会有许多单个线虫丢失或出现此处所示的一些问题。一旦掌握，样品的制备与固定可在一小时内完成，染色则可在一天内完成。

通过此操作步骤，可采用多种固定方法，以优化针对任何特定抗体和组织的染色效果。