Name: 抗体在染色 C。线虫使用冻结开裂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 了解冷冻开裂技术用于秀丽隐杆线虫抗体染色的方法。该技术减少化学处理，有效暴露内部组织，便于蛋白质定位研究，适用于神经科学和细胞生物学实验。

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本研究由美国国家科学基金会（NSF CCLI#0633618）和俄亥俄大学提供资助。部分菌株由秀丽隐杆线虫遗传中心提供。研究生 Reetobrata Basu 在视频中出镜。

注意：多个实验步骤根据实验的具体条件提供了不同的设置和准备选项。在这些情况下，替代步骤以 A、B、C 的形式列出。 等等。 包含替代步骤的方案概述如下 图1.
1. 多聚赖氨酸包被载玻片的制备
根据制备难易程度、相对黏附性以及抗体非特异性结合之间的权衡需求，可选择使用三种不同类型的载玻片。以下步骤1A-1C按黏附性及复杂性递增的顺序，介绍了载玻片制备方法的不同选择。通过这些不同方法制备的载玻片可在同一实验中联合使用。
1A. 无需载玻片制备
市售的多聚赖氨酸包被载玻片具有低黏附性和低背景。
1B. 甲醇-丙酮固定法的最佳载玻片制备
中等黏附性且背景值低。
<ol>
	<li>准备用于浸泡载玻片的多聚赖氨酸溶液：将400 mg高分子量（150,000 - 300,000 D）的聚-L-赖氨酸加入200 ml双蒸水中。加入2 ml 10%叠氮化钠储备液（终浓度0.1%）作为防腐剂。注意：干燥的叠氮化钠具有反应性，所有形态均有毒性。配制10%储备液称量粉末时需佩戴口罩和手套。</li>
	<li>用无绒布擦拭单面磨砂玻璃载玻片，去除污渍和颗粒。即使购买的载玻片标有&#34;预清洁&#34;字样，也应进行此操作。</li>
	<li>将载玻片背对背放入载玻片架、考林瓶或其他染色用容器中，保持磨砂边缘朝上且未完全对齐（以便后续分离）。将载玻片架放入盛有70%乙醇（无需试剂级酒精）和1% HCl的蒸馏水溶液的烧杯中，或向染色罐中加液至磨砂面高度。在溶液中摇动载玻片至少5分钟。注意：该溶液具有腐蚀性，操作时需佩戴手套。备注：此溶液可重复使用多次（最长可达数月）。</li>
	<li>用流动的蒸馏水冲洗载玻片1分钟。</li>
	<li>将载玻片置于无尘环境中彻底干燥，可选择在40-60 °C烘箱中放置30-60分钟，或在室温下过夜。</li>
	<li>将载玻片放入多聚赖氨酸溶液中（覆盖无磨砂部分），在摇床上孵育15分钟。</li>
	<li>重复载玻片干燥步骤。</li>
	<li>重复多聚赖氨酸溶液孵育和干燥步骤。</li>
	<li>使用细金属物体（如薄型称量勺）分离载玻片。若粘附良好，分离将较为困难。操作时需佩戴适当的安全防护装备（护目镜），并在实验台面上铺上一次性纸张（使用后丢弃），因为分离过程中可能有细小玻璃碎片飞溅。</li>
	<li>将载玻片储存于洁净（无尘）的载玻片盒中，置于4 °C保存，直至使用。</li>
</ol>
1C. 适用于甲醛固定的载玻片制备最佳条件
黏附性最高，但背景值也高。
<ol>
	<li>将采用方法1B制备的载玻片平放于无尘、可耐受烘箱的容器内（用于烘箱干燥）或无尘的平坦表面上（用于室温风干）。</li>
	<li>在每张载玻片中央滴加20–60 μl多聚赖氨酸溶液。</li>
	<li>将载玻片在烘箱内或室温下彻底干燥。随着多聚赖氨酸蒸发，会留下浅色椭圆形痕迹。这些椭圆形区域具有很强的黏附性。但遗憾的是，即使经过封闭处理，它们仍会非特异性结合一抗和二抗。</li>
	<li>将载玻片存放于洁净（无尘）的玻片盒中，置于4 °C保存，待用时取出。</li>
</ol>
2. 冻结线虫玻片的制备
使用方法2A（针对线虫培养板）或方法2B（针对单个线虫）将线虫彻底冲洗去除细菌，以备染色。
2A. 从线虫培养皿制备载玻片
<ol>
	<li>将一块平整的金属放在干冰上进行预冷。</li>
	<li>使用蒸馏水和玻璃移液管（可减少线虫损失）或微量移液器，将含有细菌的NGM平板上的线虫冲洗至1.5 ml微量离心管中。平板可为同步化发育阶段或混合龄期；除非必要，避免使用含有大量滞育幼虫（难以裂解）或饥饿线虫（自发荧光增强）的平板。</li>
	<li>用液体冲洗线虫3-4次&#160;用蒸馏水洗涤，直至无细菌。（为减少线虫损失，请使用同一支玻璃移液管。）为沉淀线虫，可将其在台面上静置3–5分钟（主要使成虫沉降至管底），或在台式离心机中以约1,000 rpm（约500 g）离心30秒（以收集成虫、幼虫和胚胎）。</li>
	<li>用移液器吸出大部分含有线虫的水，仅留下约为线虫体积两倍的水量（但总体积至少为25 μl）。</li>
	<li>标记磨砂面 &#34;底部&#34; 用永久性墨水标记（在步骤1中处理过的）多聚赖氨酸载玻片，并将载玻片标签面向上放置在盛有干冰的容器旁的台面上。</li>
	<li>具有相同数量的普通载玻片（擦拭干净但未经多聚赖氨酸处理） &#34;顶部&#34; 载玻片可用。</li>
	<li>将约 25 μl 蛔虫置于水中 &#34;底部&#34; 用移液枪头侧面将含有线虫的液体在载玻片中央区域涂布均匀。</li>
	<li>让线虫静置30秒至2分钟。如果载玻片具有适当的黏性，线虫的两端在接触载玻片时会黏附住。</li>
	<li>一手握住底部载玻片，将顶部载玻片覆盖在底部载玻片上，使除磨砂部分外其余部分完全重叠。液体应使两张载玻片保持轻微分离，以便线虫仍可轻微移动。 切勿让载玻片相互滑动——这会扭伤线虫.</li>
	<li>轻轻向下按压上层载玻片用双手的拇指和食指夹住载玻片边缘。施加适当压力时，载玻片边缘少数最大的两性个体将破裂，而大多数成虫和幼虫会与载玻片接触但保持完整。</li>
	<li>立即且谨慎地不打滑 将载玻片置于干冰上的金属片上。载玻片应在一分钟内呈现冻结状态。继续在干冰上保持5分钟。&#160;直至完全冻结。</li>
	<li>此时，载玻片可置于标记好的盒子中，在 -80 °C 下保存数天。（若在 -80 °C 下保存数周，水分将开始升华，导致线虫染色效果下降）。若载玻片存放在 -80 °C，使用前需在干冰上放置 10 分钟使其“回温”后再进行裂解。</li>
	<li>进入第3步（固定）。</li>
</ol>
2B. 单个线虫玻片的制备
<ol>
	<li>将一块平整的金属放在干冰上进行预冷。</li>
	<li>使用线虫挑取工具将单个线虫转移至NGM平板上的水滴中，以去除其表面的细菌。若条件允许，应选用充分喂食的线虫，以减少自发荧光。根据需要重复将线虫转移至新的水滴位置，直至线虫完全脱离细菌。</li>
	<li>标记磨砂面一侧 &#34;底部&#34; 用永久性墨水标记多聚赖氨酸载玻片，并将载玻片正面朝上放置在装有干冰的容器旁的台面上。准备数量相等的低黏附性载玻片 &#34;顶部&#34; （未处理）载玻片可用。</li>
	<li>在经多聚赖氨酸双重处理的载玻片底部区域放置一滴5-10 μl的水。若转移的线虫较多，应使用较大体积，以防止水滴在操作完成前蒸发。</li>
	<li>用挑虫针在显微镜下将线虫转移至水滴中，观察线虫沉降至粘性载玻片表面并接触固定。每滴水可转移1条至20条以上的线虫。</li>
	<li>一手握住底部载玻片，将顶部载玻片覆盖在底部载玻片上，使除磨砂部分外的区域完全重叠。</li>
	<li>立即且谨慎地不打滑或压缩将载玻片置于干冰上的金属片上，于干冰中保存5–30分钟。（切勿长期储存这些载玻片，因为载玻片容易干燥。）</li>
	<li>进入第3步（固定）。</li>
</ol>
3. 固定
固定剂对于将细胞内的抗原“固定”在原位是必需的，其作用方式包括通过沉淀（&#34;轻度固定&#34;）或交联（&#34;强固定&#34;）来实现。固定过程可能会破坏抗原性；大多数已知抗体在特定的固定条件下效果最佳。对于新抗体，应测试一系列不同的固定条件。
对于任何固定处理，第一步均为配制磷酸盐缓冲液。随后使用方法A（甲醇和丙酮的轻度固定）或方法B（甲醛或戊二醛的较强固定）对载玻片上的线虫进行固定，以进行抗体染色。
<ol>
	<li>通过加入 80 g NaCl、2.0 g KCl、27.2 g Na2HPO4•H20、2.4 g KH2PO4 和 20 ml 10% 叠氮化钠储备液，配制无菌的 10x&#160;PBS（磷酸盐缓冲盐水）储备液。配制该储备液时，称取叠氮化钠粉末，用双蒸水配制成 10% 溶液。将盐溶液在温和加热条件下搅拌至完全溶解。注意：干燥的叠氮化钠具有反应性，所有形态均具毒性。操作干燥叠氮化钠或其溶液时应佩戴口罩和手套。</li>
	<li>待盐溶液冷却后（Tris 的 pH 值对温度敏感），用 1–10 M NaOH 调节 pH 至 7.2。用双蒸水定容至 1 L，经高压灭菌以实现无菌。室温保存，并根据需要使用无菌双蒸水稀释至 1x&#160;。注意：NaOH 具有腐蚀性，使用时应佩戴手套。</li>
</ol>
3A. 使用甲醇-丙酮进行轻度固定
<ol>
	<li>将100%甲醇、100%丙酮和1x&#160;磷酸盐缓冲液（PBS）放入染色缸中，置于冰上预冷至少10分钟。注意：甲醇和丙酮具有毒性，操作时需佩戴手套。</li>
	<li>从干冰中取出一对底面和顶面载玻片，迅速将其扭转分开，并立即将&#34;底面&#34;载玻片浸入冰冻甲醇中固定2分钟。&#34;顶面&#34;载玻片可丢弃。</li>
	<li>将载玻片从甲醇转移至冰冻丙酮中，继续固定4分钟。若载玻片上虫体较多，即使制备良好的样品，大多数（90%）虫体也会在固定过程中脱落；若单条线虫载玻片制备得当，虫体应仍牢固附着于载玻片上。</li>
	<li>将载玻片放入盛有PBS的染色缸中（以洗去固定剂），随后进行第4步（染色）。</li>
</ol>
3B. 使用甲醛或戊二醛进行硬固定
<ol>
	<li>将试剂级甲醛或戊二醛溶液用1x缓冲液稀释&#160;PBS 至终浓度为 0.5–4%。分装（1.5 ml）后盖紧，于 -20 至 -30 °C 保存；使用前在冰上解冻。注意：甲醛溶液会随时间推移及接触空气而降解。警告：甲醛和戊二醛具有毒性，操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。</li>
	<li>从干冰中取出一对上下载玻片，迅速扭开，并立即放置 &#34;底部&#34; 将装有线虫的载玻片放入带盖的平皿中。（顶部的载玻片可丢弃）。</li>
	<li>立即用移液器将200 μl有毒固定液滴加到载玻片上含有线虫区域的中心。固定液会先部分冻结在原位，随后融化并覆盖载玻片上更大的区域。</li>
	<li>如果线虫未被固定液完全覆盖，应立即使用微量移液器小心地添加更多固定液。注意勿使固定液溢出载玻片边缘。</li>
	<li>用盖子盖住培养皿，在室温下孵育10分钟至过夜。若使用较长的孵育时间，需确保培养皿内保持湿润——可通过在培养皿中加入折叠好的无绒湿布来实现。注意勿使湿布接触载玻片。</li>
	<li>固定完成后，小心地将含有松散线虫的固定液用移液器转移至1.5 ml离心管中，并将载玻片浸入盛有PBS的染色缸中。</li>
	<li>将脱落的线虫在高速下离心30秒以形成沉淀。用PBS冲洗线虫两次，然后与载玻片上的线虫平行处理（在微量离心管中进行步骤，而非在载玻片上）。</li>
	<li>进入第4步（染色）。</li>
</ol>
4. 抗体染色
抗体染色方案与载玻片上任何组织的标准方案相似。无论步骤1-3中的制备方式如何，所有载玻片均采用相同的方案。
<ol>
	<li>通过混合700 ml双蒸水和100 ml 10x抗体缓冲液，制备抗体缓冲液。&#160;PBS，5 ml Triton X-100（终浓度0.5%），2 ml 0.5 M EDTA（pH 8，终浓度1 mM），1 g BSA（终浓度0.1%），5 ml 10%叠氮化钠溶液（终浓度0.05%）。用HCl调节pH至7.2，然后加双蒸水至1 L；4 °C保存。</li>
	<li>用双蒸水重悬驴血清，随后将5 ml血清加入45 ml抗体缓冲液中（终浓度为10%血清），配制封闭液。</li>
	<li>通过将抗体稀释于含1% BSA的抗体缓冲液中，配制一抗和二抗溶液。一抗的推荐稀释比例为1:50至1:2,000，二抗（针对一抗宿主物种的Cy3或OG488标记驴抗体）的推荐稀释比例为1:1,000至1:5,000。</li>
	<li>配制DAPI储存液：将2.5 mg/ml溶于双蒸水中，分装为8 μl每份，于-30 °C冷冻保存。注意：DAPI为有毒的DNA结合染料，称量及分装时需佩戴手套。</li>
	<li>在15 ml锥形管中，通过混合200 mg没食子酸丙酯（n-propyl gallate）、0.3 ml 1 M Tris（pH 9）和2.7 ml重蒸水配制10 ml封片液。于65 °C加热约10分钟至完全溶解。加入7 ml甘油和8 μl DAPI溶液，充分涡旋混匀。将封片液分装至1.5 ml离心管中，用铝箔包裹，于4 °C避光保存（空气和光照均可降解封片液——若液体变黄，应弃置于生物危害废物容器中）。注意：没食子酸丙酯为活性抗氧化剂，称量时需佩戴手套。</li>
	<li>将载玻片转移至染色缸中，加入封闭液，在室温下封闭1小时，或在4 °C下封闭过夜（对于较难固定的样品，建议选择过夜封闭）。避免振荡，以防丢失线虫。</li>
	<li>将切片转移至含有初级抗体的染色缸中，或将切片平放于湿盒内，每张切片上加100–500 μl初级抗体。4 °C孵育过夜，避免振荡。</li>
	<li>一抗孵育后，将玻片转移至盛有PBS的染色缸中。</li>
	<li>用铺有滤纸的漏斗过滤封闭液，于4 °C保存；若每隔1-2周进行无菌过滤，封闭液可重复使用1个月或更长时间。同样，将一抗过滤后于4 °C保存，以供重复使用（可用于10次或更多次染色）。</li>
	<li>将载玻片在抗体缓冲液中清洗三次（每次约20分钟）。</li>
	<li>将载玻片放入避光染色容器中的二抗中，在室温下孵育4小时，或在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>将载玻片转移至盛有PBS的染色缸中。过滤二抗并置于4 °C保存，以备重复使用（可重复使用10次或更多次）。</li>
	<li>将载玻片在抗体缓冲液中清洗三次（每次约20分钟）。</li>
	<li>将载玻片转移至PBS中，并在4 °C下于PBS中孵育（数分钟至过夜），直至准备封片。</li>
	<li>快速处理每张载玻片，确保线虫保持湿润。从 PBS 中取出一张载玻片，用无绒擦拭纸擦干背面，然后置于纸巾上。</li>
	<li>在载玻片上的线虫样本上加入约 20 μl 封片剂，使封片剂与 PBS 在载玻片上大致等量，然后轻轻倾斜载玻片以混匀两种溶液。注意：封片剂具有毒性。</li>
	<li>将载玻片倾斜，使磨砂边缘朝下，溶液聚集在磨砂处附近，然后将24 × 60 mm盖玻片的一边接触溶液。</li>
	<li>轻轻放下盖玻片，以尽量减少气泡产生（气泡会加剧荧光淬灭并干扰观察）。若出现气泡，可缓慢抬起盖玻片边缘，然后重新轻轻放下 不滑动盖玻片 在整个蠕虫中。</li>
	<li>用无绒擦拭纸轻轻按压盖玻片边缘，将载玻片边缘擦干，注意不要移动盖玻片。盖玻片四周的载玻片边缘必须均显现出相对干燥的状态</li>
	<li>用2-3层指甲油封固盖玻片。在制备和储存过程中，可将载玻片置于平放的载玻片盒中以避光保护。待载玻片完全密封并干燥后，清洁盖玻片及载玻片背面。</li>
	<li>密封良好的载玻片可在 4 °C 避光保存数天，或在 -20 °C 保存数周。长时间存放后，DNA 的 DAPI 染色以及大多数绿色染料的荧光信号例如&#160;488 nm 激发光下会褪色。根据需要，用更多指甲油重新封固盖玻片， 例如&#160;使用任何油镜后。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明其不存在任何竞争性财务利益。

冻裂法是用于C. elegans抗体染色的多种方法之一。该方法提供了一种相对简单的线虫染色途径，但需要特定试剂并经过练习才能获得最佳结果。关键步骤（如图1所示）包括：1）载玻片的制备（见步骤1和&#160;2）线虫的手动压片（见步骤2和3）以及快速固定（见步骤3）。首先，为了最大程度地增强线虫在载玻片上的黏附性，最好使用高分子量（长链聚合物）多聚赖氨酸自行制备载玻片，而不是依赖市售的预处理载玻片。商业载玻片虽涂有多聚赖氨酸以促进细胞黏附，但冻裂法所用载玻片的设计目的是使整条线虫的角质层牢固附着。其次，在冷冻前将线虫正确地夹在两张载玻片之间进行压片的步骤至关重要。此操作需要稳定的手法和反复练习，以掌握适当的加压力度，使单个线虫与两张载玻片充分接触，同时不破坏其形态结构。压力过大或过小均会导致固定过程中线虫丢失增加。此外，需特别小心地将载玻片转移至干冰冷却的表面进行冷冻，且在此过程中必须保持两张载玻片之间的相对位置不变。任何相对移动都可能导致线虫撕裂或扭曲。第三，与所有固定技术一样，冷冻后的线虫必须在解冻前直接投入固定液中。否则，抗原可能发生扩散，从而导致亚细胞定位信息的误判。如果上述所有...

为了确定蛋白质的细胞和亚细胞定位，科学家传统上会使用特异性识别特定蛋白质的抗体对组织进行标记1某些模式生物中，例如 秀丽隐杆线虫，抗体染色常被分子遗传学技术所取代，因为后者能更快地获得结果。这些技术包括将含有目的基因启动子与编码区与绿色荧光蛋白基因融合的构建体转化到生物体中。然而，分子技术也存在多种人为假象问题，例如难以确定真正的启动子，以及高拷贝数构建体（通常采用的技术）在表达水平上的改变 秀丽隐杆线虫)2,3因此，利用抗体进行染色仍是许多研究蛋白质功能的科学家追求的目标 体内.
使用抗体对组织进行染色可能较为困难，因为抗体通常仅能识别特定构象的抗原1。例如，某些抗体可能仅识别以特定方式固定的变性或完整抗原，而无法识别原位（in situ）的抗原。在线虫中，抗体染色的问题更为突出，原因是线虫的角质层形成了一层相对不透性的屏障，阻碍了抗体进入组织。
在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，抗体染色有多种不同的方法（详见我们之前的工作综述4）。为了对完整的“线虫”进行染色，研究人员开发了在相对较强的固定剂（甲醛或戊二醛）中进行冷冻和解冻的方法；冷冻-解冻循环有助于使角质层产生裂纹，从而促进固定剂快速渗透5。固定后，还需对角质层进行通透处理以允许抗体进入，常用方法包括使用还原剂、胶原酶或两者联合处理5–7。这些处理方法虽能较好地保持形态结构，但常常会降低甚至破坏抗体的识别能力。其他替代方法包括通过解剖8来促进抗体渗透。
&#34;冷冻裂解&#34;是一种进入半完整线虫内部以进行抗体染色的方法9-10。该方法可在多种固定条件下进行，同时避免使用胶原酶和还原处理。将线虫置于两张粘附载玻片之间，冷冻后分开载玻片，使大部分线虫保留在底面载玻片上，而大部分角质层则留在顶面载玻片上。将底面载玻片放入固定液中，并将附着有线虫的整个载玻片用于后续抗体染色流程。该方法存在两个主要难点：首先，难以施加适当的压力将线虫裂开而不造成严重变形；其次，许多线虫无法粘附于任一载玻片，会在固定液或洗涤过程中丢失。然而，使用合适的载玻片并经过适当练习后，该方法可快速获得形态较为完整的线虫，适用于多种固定剂和抗体。
该方法可根据实验者的具体目标稍作调整。如果需要对单个线虫进行染色（例如&#160;以确定单个转化子是否出现抗体染色的改变），则可使用黏附性最强但背景染色较高的载玻片，例如实验室自制的高浓度多聚赖氨酸载玻片（见下文）。对于采用甲醛或戊二醛固定的样品，应使用黏附性较高的载玻片（实验室自制的多聚赖氨酸载玻片），因为线虫在经过此类固定后对多聚赖氨酸的黏附能力会下降。若对野生型线虫使用甲醇和/或丙酮进行固定，则应选用黏附性较低且背景染色较弱的载玻片（商用或实验室自制载玻片）。如果实验室中需使用多种抗体和固定剂，可预先制备不同类型的载玻片，并在需要时取出使用。
在获得线虫组织的通路后，抗体染色步骤遵循标准方法（相较于细胞，组织通常需要更长的孵育时间1,11）。

<table><tbody><tr><td>多聚-L-赖氨酸载玻片（ESCO 品牌）</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Sigma 品牌载玻片同样适用</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td>&lt;strong&gt;重要提示：&lt;/strong&gt; 多聚赖氨酸的品牌和高分子量至关重要</td></tr><tr><td>单侧磨砂载玻片</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>有毒，称量粉末配制 10% 储存液时需佩戴手套和口罩。移液储存液时也需戴手套</td></tr><tr><td>考普林染色缸</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>5 片装载玻片邮寄盒</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>71549-01</td><td>多种小型载玻片架品牌之一，适用于染色操作</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>&lt;strong&gt;重要提示：&lt;/strong&gt; 普通福尔马林溶液（37% 甲醛）不适用。可选择：1）将结晶多聚甲醛溶解于磷酸盐缓冲液中，分装后冷冻保存；或 2）购买电子显微镜级多聚甲醛分装品。有毒——操作时需戴手套；多余废液应随水流冲入下水道处理。</td></tr><tr><td>戊二醛溶液，25% 水溶液</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td>&lt;strong&gt;重要提示：&lt;/strong&gt; 应购买电子显微镜级、安瓿封装的戊二醛；有毒——操作时需戴手套；多余废液应随水流冲入下水道处理。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>冻干驴血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>Cy3 标记驴抗小鼠 IgG 多重标记抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>推荐该公司提供高质量多重标记（亲和力耗竭）抗体。请根据一抗来源动物选择合适的荧光染料和抗原匹配。</td></tr><tr><td>正丙基棓酸酯</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>其他品牌亦适用</td></tr><tr><td>DAPI，4&amp;rsquo;,6&amp;rsquo;-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>有毒。操作时需戴手套，并分装为小份量后冷冻保存，以减少暴露风险</td></tr><tr><td>Whatman #1 滤纸，直径 15 cm</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1 1/2，矩形，24 × 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 厚度在光学性能上最佳</td></tr><tr><td>显微镜载玻片保存夹</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>其他品牌亦适用</td></tr></tbody></table>

在 c. elegans 中使用&quot;冷冻裂解&quot;进行抗体染色

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

为了使用抗体对C. elegans进行染色，必须通过化学或机械方法绕过其相对不易渗透的角质层。“冻裂法”是一种通过物理方式将线虫角质层剥离的方法，其操作包括将线虫夹在两张粘附性载玻片之间，冷冻后将载玻片强行分开。冻裂法无需化学处理即可快速简便地暴露组织，并可与多种固定剂联合使用。然而，该方法会导致大量样本丢失，且施加的压力会机械性地扭曲样本形态。需要经过一定练习才能最大限度地回收形态良好的样本。冻裂法可根据特定的固定条件、样本回收率或降低非特异性染色进行优化，但无法同时兼顾所有参数。对于需要强烈固定条件、并能耐受用于化学通透角质层的化学处理的抗体，优先选择在溶液中直接处理完整线虫的方法。如果抗体需要较温和的固定条件，或最佳固定条件尚不明确，冻裂法则是一种非常有效的快速检测抗体的方法，可提供目标抗原的特异性亚细胞和细胞定位信息。

当线虫被适当压片、冻裂并轻微固定后，几乎整个线虫均可被抗体染色所覆盖（见图2）。DAPI染色所显示的细胞核位置可指示线虫的哪些部分保持完整。当使用更强的固定剂（如甲醛）时，线虫的形态可能发生扭曲（如图3A-D中肌肉呈现不自然的波浪状外观所示）。另一个常见问题是特定组织的固定不均或试剂渗透不充分。这一点在图3E-H中有所体现：尽管其他染色（包括DNA染色）的存在表明线虫的部分身体结构仍然存在（即在冻裂过程中未被完全去除），但肌肉仅在部分区域被染色。通过练习，可以很容易地识别出这种部分染色的模式，从而即使单个线虫表现出染色不均，仍可确定染色的整体分布情况。
使用任何固定条件进行冰裂法时常见的问题如最终图示（图4）所示。最常见的问题是由于压缩过程中两张载玻片之间发生相对移动，导致样品扭曲。通过染色组织的形态可以观察到，线虫咽部后方的虫体部分出现扭曲。该图像还显示了背景染色的问题，这是由于抗体与载玻片上的多聚赖氨酸涂层发生非特异性结合所致...

演示了一种称为“冻裂”的方法，该方法可用于暴露线虫 C. elegans 的内部组织，使其与抗体结合，从而进行蛋白质定位。

在 C. Elegans 中使用&quot;冷冻裂解&quot;进行抗体染色

为了用抗体对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行染色，必须通过化学或机械方法绕过其相对不易渗透的角质层。“冻裂法”是一种……

本实验的总体目标是对秀丽隐杆线虫进行抗体染色。为此，首先将线虫冲洗后铺在载玻片上，并小心地将其夹在两张粘附性载玻片之间，随后在干冰上冷冻。接着，将载玻片分开以裂解线虫，并立即将其放入固定液中。随后使用标准的抗体染色技术对线虫进行染色，通过荧光显微镜分析可观察到半完整线虫的抗体染色成功。该技术相较于现有的完整线虫固定方法的主要优势在于，它最大限度地减少了对样品的化学处理。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为制备载玻片和线虫的过程在操作上具有一定的挑战性。该实验步骤将由我本人和来自我实验室的研究生RTO Basu共同完成。开始染色前的线虫平板制备时，首先将一块平的金属置于干冰上冷却，然后用蒸馏水和玻璃移液管冲洗。将生长在一个60毫米NGM平板（含细菌）上的线虫转移到1.5毫升微量离心管中。线虫可以是同步发育的，也可以是不同龄期混合的，但应避免使用带有大量菌丝（dowers）的平板，因为这类线虫难以裂解；同时也要避免使用饥饿处理过的线虫，因其会增强自发荧光。整个过程中使用同一根玻璃移液管操作。用蒸馏水冲洗线虫三到四次，以去除细菌。随后，为收集大部分成虫，将其在实验台上静置三到五分钟。待线虫沉降至离心管底部后，移除管中大部分液体，剩余液体体积约为线虫体积的两倍，但总体积至少为25微升。用永久性墨水标记多聚赖氨酸载玻片的磨砂面，并将载玻片放置在实验台面上，靠近盛有干冰的容器，磨砂面朝上。此载玻片将作为底部载玻片。准备数量相等的洁净非多聚赖氨酸处理载玻片。提供顶部载玻片。接下来，用移液器吸取约25微升含有线虫的水样，滴加到底部黏附载玻片上，并用移液器吸头侧面将线虫均匀铺展至载玻片中央区域。静置30秒至2分钟，使线虫沉降。当蠕虫接触到载玻片时，其两端会粘附在上面。该操作中最困难的部分是在进行接下来的几个步骤时，防止蠕虫发生过度变形。最佳做法是保持耐心，提前准备好所有用具，并避免摄入过多咖啡因，以确保双手稳定。 用一只手握住底部载玻片，将顶部载玻片覆盖其上，使除磨砂部分外其余部分完全重叠。液体应使两张载玻片略微分开，以便线虫仍具有一定的活动性。切勿让载玻片相互滑动，以免导致线虫扭曲。接下来，用双手的拇指和食指小心地垂直向下按压顶部的载玻片。施加适当压力后，少数体型最大的两性个体将在载玻片边缘破裂。尽管大多数成虫和幼虫会与载玻片接触，但会立即保持完整，此时需小心操作，避免载玻片滑动，并迅速将其放置在干冰上的金属片上。一分钟内载玻片将呈现冻结状态，但需继续放置五分钟，以确保其完全冻结。载玻片现已准备好进行固定。若不立即进行后续操作，可将载玻片置于标记好的盒子中，于-80°C保存数天。载玻片应在制备后约一周内使用。长期储存后请勿使用这些载玻片。也可采用与前述类似的方法在载玻片上制备单个线虫。将一块平坦的金属放在干冰上冷却。接下来，使用线虫挑取工具将单个线虫转移至 NGM 平板上的水滴中，以去除其表面的细菌。线虫应充分喂食，以减少自发荧光。如有可能，根据需要将线虫重复转移至新的水滴位置，直至线虫完全脱离细菌。接下来，按之前的方法制备上层和下层载玻片。然后在显微镜下观察，于下层载玻片经多聚赖氨酸处理的区域滴加 5 至 10 微升水。使用线虫挑取工具将最多 20 条线虫转移至水滴中。蠕虫应沉降至接触粘性载玻片表面。然后如前所述放置上层载玻片，但不要施加压力，同时确保载玻片不会立即滑动。将载玻片置于干冰上的金属表面。将样本置于干冰上保存 5 至 30 分钟，随后立即进行固定。这些载玻片不可长期保存，需即刻使用。为对线虫进行轻微固定，首先将盛有固定液的染色缸置于冰上，预冷 10 分钟。所需的溶液包括100%甲醇、100%丙酮和磷酸盐缓冲液。从干冰中迅速取出一对上下载玻片，快速将它们分开，并立即将下层载玻片浸入冰冻甲醇中2分钟，弃去上层载玻片。接着，将载玻片从甲醇转移至冰冻丙酮中，浸泡4分钟。如果载玻片上的线虫较多，即使载玻片制备良好，大多数线虫也会在固定液中脱落。如果单条线虫的载玻片制备得当，线虫应仍能保持附着。最后，将载玻片浸入盛有PBS的容器中，以洗去固定液。载玻片现已准备好进行染色，可使用甲醛或戊二醛进行固定。首先将试剂级甲醛或戊二醛溶液用 PBS 稀释，使其终浓度为 0.5% 至 4%。分装后可在 -20 至 -30 摄氏度保存，按需解冻使用。请注意，甲醛和戊二醛具有高毒性，操作时必须佩戴手套并在通风橱中进行。从干冰中取出一对底部和顶部载玻片，立即迅速扭开。将带有线虫的底部载玻片放入带盖的平皿中，立即丢弃顶部载玻片，并用移液器在载玻片区域中央滴加 200 µL 固定液。固定液会在线虫所在位置部分冻结，随后融化并覆盖载玻片上更大的区域。如果线虫未立即且完全地被固定液覆盖，请使用微量移液器添加更多固定液。注意不要让固定液溢出载玻片边缘。在培养皿中加入折叠好的湿润无尘擦拭布，以保持湿润环境。避免擦拭布接触载玻片。固定完成后，将培养皿盖上盖子，在室温下放置10分钟至过夜。然后使用移液器小心地将固定液和游离的线虫转移至1.5毫升离心管中。随后将载玻片浸入含有PBS的染色缸中。将含有线虫的离心管高速离心30秒，使线虫沉淀。用PBS缓冲液冲洗线虫两次。随后与载玻片上的线虫平行进行染色处理。抗体染色步骤与载玻片上任何组织的标准操作流程相似，具体细节详见随附文件。染色完成后，将载玻片转移至PBS中，并可在四摄氏度下保存最多12小时，待封片时取出。进行封片时，从PBS中取出一张载玻片。使用无绒布擦拭样品背面，然后迅速将其放在纸巾上。在蠕虫上方滴加约 20 微升封片剂，使封片剂与 PBS 的体积大致相等。轻轻倾斜载玻片以混合两种溶液。注意封片介质具有毒性。请握住磨砂边缘。将载玻片倾斜，使溶液聚集在磨砂面附近。然后将一块24 × 60毫米的盖玻片的一边接触溶液，以尽量减少气泡的产生，气泡会加剧荧光淬灭并干扰观察。轻轻放下盖玻片。如果产生气泡，可缓慢抬起盖玻片的一边，然后在不滑动盖玻片覆盖线虫的情况下，重新缓慢放下。如有需要，可添加更多PBS以消除气泡。使用无绒布小心按压盖玻片和载玻片的边缘，使其边缘干燥。载玻片的边缘必须在盖玻片四周均可见，且不应过于湿润。密封盖玻片，并在边缘涂上两到三层指甲油。切片密封并干燥后，清洁盖玻片和载玻片背面，将其放入载玻片架的孔槽中。密封后的切片可在4摄氏度下保存数天，或在零下20摄氏度下保存数周。DNA染色及大多数绿色荧光染料会随时间褪色，若使用油镜观察后尤其需要时，可补充指甲油重新密封盖玻片。以下代表性图像来自细胞生物学实验课程中本科生首次进行一抗染色时所制备的载玻片。该图像展示了两个成年雌雄同体线虫头部的示例，其经过适当压片、裂解，并用甲醇-丙酮进行轻度固定，随后使用多种抗体和染料进行标记。在这种情况下，几乎整个蠕虫均可被抗体接触。通过DPI染色显示细胞核的位置，可以指示蠕虫的哪些部分保持完整。当蠕虫经受更强的固定剂（如甲醛）处理时，其形态可能会发生扭曲。这在这些图像中表现为红色显示的肌肉出现波浪状外观。使用较硬固定剂相关的另一个常见问题是特定组织的固定不均或渗透不均。这一点在此处可见，其中红色显示的肌肉仅在蠕虫的部分区域被染色。此处，其他染色的存在（包括显示为蓝色的 DNA）表明至少部分虫体存在。通过练习，可以轻松识别出这种部分染色的模式，从而确定染色的整体分布情况，即使单个线虫的染色不均匀。本文展示了在任何固定条件下使用冷冻裂解法时常见的问题。最常见的问题是由于两张载玻片之间的相对运动导致样品扭曲。在压缩过程中，染色组织的形态表明，虫体在咽部后方稍远处发生扭曲。该图像还显示了由于抗体黏附于载玻片上的多聚赖氨酸涂层而引起的背景染色问题。通过使用共聚焦显微镜可以避免这一问题。需要注意的是，即使经过练习，仍会有许多单个线虫丢失或出现此处所示的一些问题。一旦掌握，样品的制备和固定可在一小时内完成，染色则可在一天内完成。通过此操作步骤，可采用多种固定方法，以优化针对特定抗体和组织的染色效果。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

抗体在染色<em&gt; C。线虫</em&gt;使用“冻结开裂”

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突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

本视频介绍了冻裂法，这是一种通过破坏秀丽隐杆线虫（C.

线虫冻裂法：一种暴露线虫内部组织以进行染色的方法

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使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

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空间与时间上对 C. elegans 生殖系中活性 ERK 的分析

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。...

TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。...

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫...

利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。...

自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

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超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

了解冷冻开裂技术用于秀丽隐杆线虫抗体染色的方法。该技术减少化学处理，有效暴露内部组织，便于蛋白质定位研究，适用于神经科学和细胞生物学实验。

在 C. Elegans 中使用"冷冻裂解"进行抗体染色

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