使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

以下实验的总体目标是生成大量尺寸均一且可控的肿瘤类球体。首先，通过制备微孔板使细胞聚集并形成类球体；其次，收获所需细胞类型的培养物，获得细胞悬液，从而决定类球体的大小和组成。

随后将细胞悬液离心至微孔中，并进行孵育以使类固醇形成。孵育后，生成的类固醇高度均一，可直接在形成的微孔中收集或继续培养。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可同时制备大量均一的聚集体。

初次使用该方法的研究人员可能会发现其燃料体积非常小。必须确保细胞悬液均匀分布在平板上，并且中央离心机中的摆动板架能够自由活动，从而使受力方向垂直于表面。首先，通过向每个孔中加入 0.5 毫升含表面活性剂的冲洗液，制备无菌的 agro well 400 板。

使用表面活性剂可确保细胞不与微孔表面发生相互作用。为避免在微孔中产生气泡，应从一侧加入液体，使其沿表面扩散，而不是垂直滴加到表面。向微孔中加入溶液后，需重新盖上盖子。

离心前确保转子已正确平衡，将板在2000 × g 条件下离心两分钟。使用低倍倒置显微镜检查，确认微孔中的气泡已被去除。将板盖上盖子，在室温下孵育至少30分钟，或在4°C下过夜孵育。使用前，用移液装置吸去孔中的洗涤液，并立即用无菌水或PBS洗涤板。

编码后切勿让培养板干燥。细胞制备的具体步骤将根据所研究的特定细胞类型而有所不同。然而，我们已观察到该条件适用于多种细胞，包括本文讨论的细胞系，以及人胚胎干细胞、人诱导性多能干细胞、成纤维细胞、假定的原始内胚层细胞和基质细胞。制备细胞时，从一个 T75 培养瓶的 HT29 细胞开始。

从培养瓶中吸除培养基，加入3 mL胰蛋白酶。在37°C条件下孵育5分钟。加入3 mL培养基以终止胰蛋白酶消化。

将剩余液体转移至一个15毫升离心管中。然后从15毫升管中取一份等分试样用于细胞计数。在离心过程中，以200 × g离心5分钟。

计数细胞。接着，吸除胰蛋白酶培养基混合物，并更换为新鲜的生长培养基，培养基体积根据前文文本方案中计算所需的细胞密度确定，此步骤可选。

将细胞悬液通过滤网以去除任何团块。类球体可在多种培养基配方中生成，但初始试验应使用细胞原本培养所用的培养基。为了区分由转入三维培养系统引起的效应与由培养基成分改变引起的效应，首先向每个孔中加入0.4毫升生长培养基，于2000 × g离心2分钟。使用低倍倒置显微镜检查，确认微孔中的气泡已被去除。

接下来，将0.4毫升所需密度的细胞悬液加入微孔中。然后用移液器轻轻吹打混匀，注意不要在微孔中引入气泡，确保细胞在孔内均匀分布。以获得一致的类固醇产物。

将培养板在200 × g条件下离心5分钟。离心时，培养板必须在内部以及与另一侧培养板之间保持平衡，以使重量均匀分布在板架的两侧。这可确保培养板在离心过程中自动保持水平，避免产生对流，从而防止细胞在微孔中分布不均。

使用倒置显微镜确认细胞已聚集在微孔中，并且在37摄氏度下过夜培养前，细胞在孔内分布均匀。使用倒置显微镜观察类球体形成的进程。某些细胞系将在24小时内形成致密的类球体。

其他样本可能需要更长时间。此处展示了 HT 29 细胞从细胞簇发展为聚集体的过程。该实验操作中最困难的部分是在不破坏结构的前提下将类球体取出。从微孔中提取类球体时，需用移液器非常轻柔地反复吹打，使类球体从微孔中脱离。

然后倾斜培养板，吸除含有类固醇的培养基混合物。对于较大体积的类固醇，应使用宽口移液吸头，以避免破坏类固醇结构。从微孔中回收类固醇后，用移液器轻轻吹打，将其转移至悬浮培养体系中。

或者，可通过更换培养基在培养过程中维持严重型玫瑰（severe rose）的生长。培养时间取决于初始尺寸和生长速率，这决定了它们长满微孔所需的时间。在不丢失类固醇的情况下，需定期更换培养基以维持其生长。

吸取孔板边缘的培养基。使用巴氏吸管，缓慢将管尖下移至开始从弯月面吸取液体，并随着液面下降而跟随弯月面移动。然后在同一位置沿孔壁加入新鲜培养基。

加入新鲜培养基时，记得轻柔地按压移液器，并使枪头紧贴孔壁，以避免扰动微孔中的 PHE。可能会有少量类固醇损失。然而，如果每次吸出和更换培养基的位置保持一致，则损失量将维持在较低水平。

与大量细胞相比，来自不同解剖来源的多种肿瘤细胞系的类固醇可轻松提取至悬浮液中。本方法可实现稳定的尺寸控制，此处通过高度均一的类固醇群体加以证明，每种条件下均由 700 或 1,500 个细胞形成。

HT 29 结肠癌细胞和 TE 六食管癌细胞会形成边界清晰、紧密堆积的类球体，表现出明显的细胞系间行为差异。相反，LinCaP 前列腺癌细胞则形成结构较松散、边界不规则的类球体。结构更紧密的聚集体内部作用力更强，即使仍在其形成的微孔中，也会坍塌为更对称的形态。

然而，线帽聚集体，特别是较大尺寸的聚集体，明显保留了微孔的方形参数几何形状。一旦掌握，该过程可在约一小时内完成，此外还需加上细胞贴附并形成液体所需的孵育时间。在进行此操作时，重要的是要记住，在加入细胞之前，务必确保气泡未进入微孔中。