斑马鱼先天免疫健康的呼吸爆发反应定量检测

本实验的总体目标是利用荧光法定量检测呼吸爆发反应。首先，将斑马鱼胚胎加入96孔板的各孔中。然后加入荧光底物，并使用化学试剂激活呼吸爆发反应。

然后使用荧光计定量相对荧光强度。最终，通过荧光信号来反映呼吸爆发潜能。该方法可用于研究实验干预如何影响整体先天免疫健康状态。

此处我们利用该方法研究斑马鱼胚胎的呼吸爆发，但该方法也可应用于其他系统，如成年斑马鱼、肾细胞以及其他鱼类物种的细胞制备。将胚胎置于深型培养皿中，在28°C的养鱼用水中培养至所需发育阶段。每天移除死亡的胚胎。

小心倒掉旧的卵水，并每天补充新的卵水。在实验当天，用铝箔包裹的1.7毫升微量离心管配制稀释的荧光素工作液。同时配制终浓度为20微克/毫升的PMA工作溶液。

然后按照随附文本中的说明，在15毫升锥形管中分别配制五毫升的每种给药溶液。先将给药溶液置于冰上。开启微孔板读数仪，预热光源以检测荧光。设置程序，详细设定激发波长和发射波长、光学位置灵敏度，并包含一个持续五秒的振荡步骤。

在开始实验前，准备好装有包被胚胎的培养皿等实验用品。包括一个黑色96孔微孔板、P200移液器及吸头、装有含荧光素试剂的冰桶。此外，还需准备多通道P200移液器、两个无菌试剂槽、铝箔和剪刀。

现在剪裁一个移液枪吸头，使其开口足够大，以便胚胎或肾脏能够通过。将P200移液器调至100微升，将一个胚胎连同卵水转移到所需数量的黑色96孔微孔板的孔中。接着，用多通道P200移液器将给药溶液倒入一个无菌的25毫升储液槽中。

向96孔微孔板的一列中加入100微升H 2D CFDA给药溶液，对一半对照组胚胎样品和一半实验处理的胚胎样品重复此操作。将含有PMA的给药溶液倒入一个新的无菌25毫升储液槽中。

然后将此给药溶液分装至96孔微孔板的其余各列中。用铝箔纸覆盖微孔板，并置于摇床上振荡约20秒。在未进行读数时，于28摄氏度、150 RPM条件下孵育微孔板。

加入PMA后读取微孔板。在所需的时间间隔内，每隔几分钟继续进行测量，或者将用铝箔包裹的微孔板在28摄氏度下孵育至预定时间点。随后，从孔中取出胚胎，并根据机构动物护理与使用规程对胚胎实施安乐死。

此外，将微孔板和其他一次性材料丢弃至生物危害废物桶中。确定您希望比较荧光的时间点。用各个PMA诱导对照组的荧光值减去未诱导对照组的平均荧光值。

对实验组在有 PMA 和无 PMA 的条件下重复此操作。然后将这些归一化的荧光值分别存入列中，即对照组加 PMA 组和实验组加 PMA 组。接下来，计算对照组加 PMA 组和实验组加 PMA 组的归一化荧光值的均值和标准差。

使用非配对 t 检验比较标准化荧光值，以确定统计学显著性。随后，绘制对照组加 PMA 组与实验组加 PMA 组的均值，误差线表示相应的标准差，并在图表及图注中标注显著性水平。本实验比较了受精后 48 小时和 72 小时 AB 背景野生型斑马鱼胚胎的呼吸爆发反应。

在PMA诱导组中，于加入PMA后4小时测量原始荧光值。72 HPF群体的原始荧光值较高。如计算所得的平均荧光值所示，已对背景荧光水平的变异进行归一化处理。

本呼吸爆发实验的结果表明，经PMA诱导后，72小时受精龄（HPF）的斑马鱼胚胎能够产生显著更多的活性氧物质，其呼吸爆发反应强度明显高于48 HPF的胚胎。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用荧光法定量评估斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜能。请务必注意，操作PMA粉末时具有极高危险性，因此在称量PMA粉末时应采取预防措施，例如佩戴口罩。