基于聚马来酸的纳米生物聚合物用于多重肿瘤标志物靶向：个性化医疗的新机遇？

总体目标是建立一个纳米级平台，为基于个体疾病遗传特征（尤其是癌症）合成个性化药物提供通用方案。首先从多头霉菌（frum polycephalum）中生产并纯化聚马来酸（PMLA），然后在其侧链的羧基上进行化学活化；通过取代活化基团，将小功能基团和连接子MEA连接上去，并通过水解将未使用的活化基团还原为羧基。

接下来，通过间隔子、MEA 和封端上的巯基将抗体和反义分子加入。利用 PDP 与未反应的间隔子反应，以检测铅的组成和功能。纳米药物的结果来源于携带侵袭性人类肿瘤的动物模型，如小鼠。

HER2 阳性乳腺癌可决定治疗的有效性，以及治疗是否不产生不良副作用。与开环聚合等现有合成方法相比，生物生产的最大优势在于，所获得的生物聚合物保持完全的光学纯度，且不被副产物污染。这一系列 PolyPhen 纳米药物可根据特异性靶向作用靶向任意细胞类型，并调控蛋白质表达。

通常，PHE 纳米药物在多种动物模型中对原发性脑癌和乳腺癌的治疗非常有效。我们最初提出该方法旨在阻断胶质母细胞瘤特异性层粘连蛋白异构体的合成，随后证实该方法可靶向抑制 HER2 及三阴性乳腺癌相关蛋白，从而阻止肿瘤生长。该技术的应用还可延伸至利用光学成像和磁共振成像进行癌症诊断。

聚合物纳米药物可为癌症治疗中的药物递送提供重要见解，还可应用于其他病理状况，如传染病、镇痛以及神经系统疾病。从螺旋藻接种培养出初始疟原虫培养物后，接种100毫升基础培养基，并在25°C下培养该培养物。

Thermos 声明，培养箱在避光条件下可产生一定量的重力密集聚集微质粒小体。为避免在10升生物反应器中发生孢子形成，将80克碳酸钙溶解于八升基础培养基中，然后将聚集的微质粒小体转移至安装好的反应容器内，并设定生物反应过程持续75小时。反应条件为25摄氏度，通入过滤空气的流速为每分钟10升，并以分段搅拌器以150转/分钟进行搅拌。

当培养液的 pH 为 4.8 时，停止培养以测定聚马来酸的产量。将培养液冷却至 17 摄氏度，静置使细胞自然沉降，并从反应器中移除培养上清液。将 pH 调节至 7.5。

现在将上清液从底部泵过一个已用 20 毫摩尔 Tris 盐酸盐缓冲液（pH 7.5，5°C）平衡好的 1.5 升 DEAE 纤维素柱。然后用含有 0.3 摩尔氯化钠的洗涤缓冲液自下而上通过三倍柱体积，再在含有 0.7 摩尔氯化钠的条件下洗脱 PMLA。将洗脱出的 PMLA 组分调节至含 0.1 摩尔氯化钙，加入 80% 冰冷乙醇以沉淀 PMLA 钙。接下来使用 Sephadex G-25 和水对 PMLA 钙进行凝胶过滤层析分级。

最后，将每个组分通过避光柱，并立即用液氮冷冻流出的聚苹果酸，冻干后于-20 °C保存。为活化PMLA的羧基，将1毫摩尔PMLA-H的马来单元溶于1毫升无水丙酮中，并将各1毫摩尔的N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺溶于2毫升二甲基甲酰胺中，20 °C搅拌反应3小时后，加入0.05毫摩尔的甲基聚乙二醇胺（溶于1毫升DMF），随后加入0.05毫摩尔三乙胺。

然后以逐滴加入的方式加入 0.4 毫摩尔的亮氨酸乙酯，一小时后通过薄层色谱法检测反应是否完成，若无肼显色反应则表明反应完成。同样，加入 0.1 毫摩尔的二巯基乙胺和 0.5 毫摩尔的三乙胺。通过磷酸盐缓冲盐水进行自发水解，以去除残留的 NHS 酯。

使用PD 10柱进行脱盐，并冻干以获得白色粉末，将此预偶联物干燥保存于-20摄氏度。接下来，在4.5毫升含150毫摩尔氯化钠和100毫摩尔磷酸钠（pH 5.5）的溶液中加入30毫克抗体。用5毫摩尔三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP·HCl）还原二硫键，并通过PD 10柱进行纯化。

现在将IDE PEG IDE溶于2毫升上述缓冲液中，但缓冲液pH值为6.3。加入还原后的抗体，在20摄氏度下搅拌反应1小时。使用AVEVA spin 20（截留分子量30千道尔顿）浓缩至2.5毫升，然后通过Cidex G 75进行纯化。

现在通过凝胶过滤高效液相色谱（SEC HPLC）验证产物。在280纳米处测定其含量，并在其他波长下确认无杂质存在。接下来，将50毫克预偶联物与200 MLEs的抗体偶联PEG IDE在5毫升pH 6.3的缓冲液中混合。

将巯基的浓度调整至2毫摩尔，并在20摄氏度下孵育3小时。为获得98%产率的可溶化产物，使3'端氨基反义寡核苷酸与一倍体积的SPDP反应，通过Sephadex LH-20在甲醇中纯化A-O-N-P-D-P，然后蒸发甲醇，将产物溶于水中，并立即进行冻干。随后，将800纳摩尔活化的aos与抗体PEG预偶联物至MEA-SH中孵育过夜。当二硫键交换反应终止后，加入荧光染料封闭基团，用PDP淬灭过量的巯基，并通过Sephadex G-75进行纯化。

将最终的聚马来酸基纳米药物在-20摄氏度下保存。为在生产过程中测定聚马来酸含量，请按以下步骤操作：向320微升样品中加入160微升10%盐酸羟胺溶液和160微升10%氢氧化钠溶液。反应10至15分钟后，加入160微升5%氯化铁溶液，通过在540纳米处观察深紫色复合物的形成进行检测。接下来，将纳米药物在2摩尔盐酸中于110摄氏度条件下密封水解过夜，采用反相色谱法检测马来酸含量。

使用添加了马来酸标准品的样品。现在用100毫摩尔的二硫苏糖醇裂解纳米药物，并通过定量反相高效液相色谱法，以吗啉反义寡核苷酸标准品为对照，测定吗啉反义寡核苷酸的含量。利用裂解后的纳米药物，使用蛋白质检测试剂盒测定抗体含量，以定量马来酰亚胺PEG的含量。

首先，与硫氰酸铵反应，然后用氯仿萃取，并在510纳米处测定吸光度。使用每孔5微升纳米药物和每孔0.5微克的her2作为包被抗原，通过ELISA检测抗体活性和共配位作用。最后，计算反义寡核苷酸、EG和抗体相对于马来酸的达到百分比。

与药物设计预期的百分比进行比较。这种双模态纳米药物策略利用赫赛汀抑制HER2信号通路，并利用HER2特异性反义寡核苷酸（aON）阻断HER2受体的转录；抗体通过肿瘤血管内皮细胞转铁蛋白受体（TFR）介导转胞吞作用。纳米偶联平台聚马来酸（poly maleic acid）由培养的微浆菌（microplasmo）产生，经纯化后，其羧基被活化，从而促进前偶联支架的合成。

最后是铅纳米偶联物。Eli SA 检测表明，在整个纳米药物合成过程中，活性单克隆抗体均得以保留。当两种抗体组装在同一聚合物平台上后，荧光共聚焦显微镜可追踪该纳米药物的细胞摄取过程。

将零小时和三小时的叠加图像与标记的内体共同进行分析。共定位的皮尔逊相关系数表明，纳米药物从内体释放到细胞质中，并且在细胞质中通过谷胱甘肽依赖性的二硫键断裂，使反义寡核苷酸（ON）从纳米药物上解离。体外实验显示，该先导纳米药物在HER2过表达细胞系中对细胞生长的抑制作用最为显著。

在携带 BT474、HER2 过表达人乳腺癌的小鼠体内实验中，含有赫赛汀的先导纳米药物显示出超过 95% 的生长抑制率。体外 Western blotting 检测显示 HER2 特异性 AON 可抑制 HER2 的合成，并抑制 AKT 的磷酸化，PARP 的裂解则标志着细胞凋亡的发生。药物治疗引起的肿瘤退缩表现为肿瘤体积缩小，组织学检查可见肿瘤细胞减少。

现在，您应该已经充分了解如何利用生物相容性纳米平台实现高效且无副作用的个体化治疗，并获得组分可控、功能活性经过验证的纳米药物。一旦掌握，这些传感器技术可在开发完成后实现高度可重复的操作。该技术利用聚酸类纳米平台靶向递送反义寡核苷酸，为个性化纳米医学领域的研究人员开辟了新途径，使其能够针对通过个体化基因分析所确定的特定分子肿瘤标志物，探索肿瘤治疗策略。从药理学角度来看，活性药物成分和细胞可能具有极高的危险性。

进行此操作时，应始终采取佩戴口罩和手套等预防措施。