Name: 表皮黑色素和防止晒斑的人性化小鼠模型的诱导药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 了解毛喉素诱导表皮黑色素生成的方法，用于研究UV敏感小鼠的皮肤保护机制。该方法通过药理学手段增强皮肤色素沉着，为预防紫外线损伤提供新策略。

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作者谨此感谢 Malinda Spry 提供的技术支持。我们同时感谢当前及以往的资助机构：美国国家癌症研究所（R01 CA131075，R01 CA131075-02S1）、Wendy Will Case 癌症研究基金、Markey 癌症基金会、儿童奇迹网络以及 Jennifer 和 David Dickens 黑色素瘤研究基金会。

1. 从 Plectranthus barbatus (Coleus forskohlii) 植物粗根提取物制备用于局部给药的福斯科林
<ol>
	<li>小鼠实验方案遵循动物护理和使用的伦理行为准则，并已获得肯塔基大学机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 # 00768M2004）。根提取物以标准皮肤病学基质（70% 乙醇，30% 丙二醇）配制成 40% 质量/体积浓度的溶液。</li>
	<li>称取 200 g 粗 forskolin 根提取物并转移至烧杯中。为配制 500 ml 的 40% (w/v) 溶液，加入大部分但并非全部的溶剂（70% 乙醇，30% 丙二醇），使 200 g 粗 forskolin 根提取物重悬，总体积调至约 450 ml。</li>
	<li>室温下搅拌 1 小时。溶液将具有一定黏度，可能需要手动搅动以“提升”提取物进入溶液，之后磁力搅拌子方可有效发挥作用。</li>
	<li>搅拌 1 小时后，将混合液倒入量筒中，并使用先前用于搅拌浆液的烧杯的冲洗溶剂补足体积至 500 ml（以最大化回收烧杯中残留的 forskolin）。</li>
	<li>将浆液转移至 50 ml 聚丙烯离心管中。使用台式离心机离心（1,500 × g，室温，15 分钟）。此时不溶性物质将较为紧密地沉淀，便于轻松倾出上清液。</li>
	<li>通过 0.22 μm 醋酸纤维素膜滤器过滤溶液，以去除提取物中任何残留的不溶性物质。我们采用专为细胞培养设计的瓶顶式过滤系统，并配合使用滤器配套的预滤器，防止根提取物中的不溶性成分过早堵塞滤膜。在制备大量提取物时，每次过滤约 100 ml，并在每次添加新体积前更换预滤器。</li>
	<li>在室温下储存时，该提取物可保持生物学活性长达一年。</li>
</ol>
2. C57Bl/6 K14-Scf 小鼠外用处理的准备
<ol>
	<li>使用电推剪去除动物背部的毛发。为便于用电推剪（配备0.25 mm外科准备头，Fisher Scientific）剃除背部毛发，可短暂使用吸入式异氟烷对动物进行麻醉。建议仅使用一种麻醉方式（例如氯胺酮/赛拉嗪），以尽量降低麻醉过量的风险。饱和式吸入麻醉舱在通风橱外使用时存在职业暴露风险，且向动物输送的麻醉剂量不明确。理想情况下应使用精密麻醉蒸发器。</li>
	<li>为去除残留的毛茬，需使用化学脱毛剂处理动物。通过腹腔注射给予动物氯胺酮40 mg/kg和赛拉嗪4 mg/kg进行麻醉。</li>
	<li>待动物达到充分麻醉状态（通过夹趾反射判断）后，用戴手套的手指取指尖大小的脱毛膏涂抹于已剃毛的背部皮肤。将脱毛膏在皮肤上揉搓30–60秒，或直至移动脱毛膏时可明显看到毛发脱落。脱毛膏仅需保留最短必要时间以完成脱毛，因长时间接触可导致皮肤化学灼伤、表皮破损，并因表皮完整性丧失而致动物死亡。</li>
	<li>用浸水纱布反复擦拭背部皮肤，直至完全清除脱毛膏。用柔软的纸巾擦干动物，并将其置于温暖、隐蔽的环境中恢复（例如放置于加热垫上的清洁笼具内）。应逐只进行脱毛操作，并在整个过程中密切监测动物状态。</li>
</ol>
3. 局部施用福斯科林或载体对照
<ol>
	<li>每次应单独处理一只动物。将小鼠置于通风橱内一个装有异氟烷饱和滤纸的带盖透明玻璃罐中，罐内放置一个与小鼠体型贴合的尼龙透气滤膜，将小鼠放在滤膜上方，通过吸入异氟烷进行短暂麻醉。暴露小鼠于异氟烷的时间应足够抑制其自主肌肉活动，但仍保持自主呼吸（通常为10-20秒）。若小鼠暴露于异氟烷时间过长，将导致呼吸抑制甚至死亡。因此，宁可倾向于“麻醉较浅”，必要时可短暂重复暴露于异氟烷，而非过度暴露而增加死亡风险。</li>
	<li>将动物从异氟烷麻醉舱中取出，放置于洁净的吸水实验台垫上。</li>
	<li>使用配有一次性聚丙烯吸头的1,000 μl移液器，吸取400 μl的40%粗制佛司可林提取物（对照组动物则给予70%乙醇与30%丙二醇的溶剂对照）。</li>
	<li>通过将提取物滴在动物背部皮肤上，然后用移液器吸头侧面将液体涂抹至整个背部皮肤，确保完全覆盖。涂抹后无需用纸巾吸除多余液体。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并仔细观察直至其从麻醉状态恢复。</li>
	<li>为避免非色素性cAMP效应干扰紫外线敏感性实验，在紫外线照射前2天应停止所有外用处理（色素效应在最后一次外用处理后仍可持续数天）。</li>
</ol>
4. 通过反射色度法测量皮肤颜色
<ol>
	<li>用吸入式异氟烷短暂麻醉小鼠（见上文）。</li>
	<li>将便携式测头置于色度计附带的标准白色表面上，校准美能达色度计。</li>
	<li>将色度计的便携式测量头紧贴动物的背部皮肤，确保1 cm2的圆形开口完全压在皮肤上。在背部皮肤的不同区域至少进行三次独立测量。</li>
	<li>计算每只动物及每组处理的平均L*值±标准差（SD）。反射式色度测定可在实验的任何时间点进行。</li>
</ol>
5. 通过“最小红斑剂量”（MED）的计算测定紫外线敏感性
<ol>
	<li>使用如上所述经溶剂或佛司可林预处理的动物。通过腹腔注射标准剂量的氯胺酮和赛拉嗪混合物对动物进行麻醉（见上文）。</li>
	<li>为MED测试准备一块防紫外线遮蔽胶带。使用重型打孔器在胶带上打出直径为1 cm2的圆形孔洞（图2A和B）。胶带上的孔洞具有确定的尺寸和对称排列，有助于在照射后识别皮肤变化。在胶带的每个孔洞上方贴上一小块易于剥离的小胶带，可在UV照射期间特定时间点移除，以实现不同UV剂量的施加。</li>
	<li>待动物充分镇静后，将胶带贴于其背部表面。麻醉期间应始终使用眼部润滑剂。</li>
	<li>开启由两支Westinghouse F15T8UV-B灯组成的UV光源，其峰值输出为313 nm，波长范围为280-370 nm。使用配备UVB传感器的紫外光度计测量光源输出，待其达到稳定状态（通常需要几分钟预热时间）。</li>
	<li>根据紫外光度计测得的UV透射率，计算每个目标剂量所需的UV照射时间。例如，本实验所用光源的UVB输出为2.4 mW/cm2。因此，为施加5 kJ/m2的剂量，皮肤需接受208秒（即3分28秒）的UVB照射，计算过程如下： 
	<img alt="能量换算方程；使用千焦、米、瓦特和厘米换算计算秒数的公式。" fo:src="/files/ftp_upload/50670/50670eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50670/50670eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程1"></li>
	<li>将已镇静的动物（背部贴有遮蔽胶带）腹面朝下放置，以确保UV照射均匀。为施加选定的UV剂量，依次移除覆盖在孔洞上的小块遮蔽胶带，使1 cm2的皮肤区域接受相应剂量的辐射。例如，若实验中最高剂量为40 kJ/m2，则动物需在光源下共暴露27分47秒，其中接受40 kJ/m2照射的区域在整个过程中均无胶带覆盖；而接受5 kJ/m2照射的区域，则应在照射剩余208秒时移除其上方胶带。胶带移除的时间应安排得当，使所有处理组的照射终点同时到达。</li>
	<li>UV照射结束后，小心地从背部皮肤上剥离胶带，注意避免因突然或用力过猛的动作损伤皮肤。将动物置于温暖安静的环境中，使其从麻醉中恢复。</li>
	<li>在照射后24-48小时内观察小鼠，检查是否有明确界限的红斑（发红）或水肿（肿胀）区域，这些区域应与接受特定UV剂量照射的解剖位置相对应。以摄影方式记录皮肤变化。</li>
	<li>MED值对应于引起皮肤炎症的最低UV剂量，炎症定义为整个暴露圆形区域出现红斑和/或水肿。需注意，皮肤色素沉着可能会影响MED的判断，但由于UV照射时胶带上孔洞形状明确，红斑和水肿通常仍可准确评估。</li>
</ol>
6. 统计学分析
采用单因素方差分析（one way ANOVA）结合 Bonferroni 事后检验（Graph Pad PRISM）对小鼠各组之间的数据进行分析。p 值 &lt;0.05 被认为具有统计学显著性。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

利用一种模拟白皙人皮肤的动物模型，我们发现局部应用富含 forskolin 的粗根提取物可通过刺激皮肤黑色素的生成，显著加深表皮色素沉着。表皮黑化依赖于基底层表皮中干细胞因子（stem cell factor）的表达，这一机制存在于人类皮肤中，但在未经基因改造的小鼠皮肤中并不存在。未经基因改造的小鼠背部皮肤缺乏足够数量的表皮间黑色素细胞，因而无法赋予皮肤色素。只有在持续表达黑色素细胞生长因子（如干细胞因子（kit 配体）或肝细胞生长因子（HGF））的条件下，黑色素细胞才能在整个动物生命周期中保留在表皮基底层50-51。我们所用的模拟白皙人皮肤的动物模型，是将 K14-Scf 转基因导入 C57BL/6 小鼠的 extension 色素变异品系中构建而成。尽管任何年龄的动物均可使用，我们的实验通常采用年轻成年小鼠（4–12 周龄）。由于黑皮质素 1 受体（Mc1r）发生截短突变，导致 cAMP 信号通路丧失，extension 小鼠在毛发和皮肤中（在 K14-Scf 或 HGF-Met 转基因状态下）优先表达褐黑色素（pheom...

黑色素瘤是皮肤癌中最致命的一种，其发病率在过去几十年中在美国显著上升，尤其在皮肤白皙的人群中更为明显。强有力的分子和流行病学证据表明，紫外线辐射是导致该病的主要环境因素2-5。日光暴露和日光浴床使用所导致的紫外线暴露增加，很可能是黑色素瘤发病率上升的主要原因6-7。黑色素瘤风险似乎与晒伤密切相关8，尤其是生命早期发生的晒伤9-10。晒伤风险不仅与紫外线暴露的剂量和强度有关，还受到遗传因素的影响，这些因素调控皮肤对紫外线辐射的反应。皮肤色素沉着是决定紫外线敏感性、晒伤风险以及癌症风险的最重要因素之一。与皮肤较深的人群相比，皮肤较浅者患黑色素瘤的频率大约高出二十倍11-13。
	黑色素是由表皮中的黑素细胞产生的一种色素，是决定皮肤肤色的主要因素。黑色素主要有两种类型：（1）真黑色素，一种深棕色或黑色的色素，能有效吸收紫外线的能量；（2）褐黑色素，一种红黄色或浅黄色的色素，在阻止紫外线光子穿透皮肤方面效果较差。皮肤颜色、对紫外线的敏感性以及黑色素瘤的风险在很大程度上由表皮中真黑色素的含量决定14-15。表皮中的真黑色素越多，能够穿透进入皮肤的紫外线光子就越少。由于先天性真黑色素水平较低，皮肤白皙的个体更容易受到紫外线辐射的急性和慢性损害16-18。	
	皮肤色素沉着、黑色素瘤风险以及紫外线（UV）照射后“晒黑”的能力均与黑素皮质素1受体（Mc1r）的信号传导能力相关。Mc1r是一种在黑素细胞表面表达的Gs偶联七次跨膜受体19-22。当Mc1r与其特异性高亲和力配体α-黑素细胞刺激素（α-MSH）结合时，会激活腺苷酸环化酶，从而产生第二信使cAMP23。皮肤在UV照射后的正常生理反应包括角质形成细胞在表皮中产生α-MSH24-29。我们及其他研究者推测，由角质形成细胞分泌的α-MSH可与表皮黑素细胞上的Mc1r结合，通过激活腺苷酸环化酶，启动下游cAMP第二信使的生成30。cAMP水平调控黑素细胞分化的多个方面，包括细胞存活通路、DNA修复以及色素合成。Mc1r信号通路及cAMP可明确诱导色素合成酶的表达并促进真黑素（eumelanin）的生成。当Mc1r信号功能完整且黑素细胞内cAMP水平较高时，细胞产生真黑素，皮肤随之变黑。然而，若Mc1r信号功能受损，胞质内cAMP水平持续偏低，则转而生成褐黑素（pheomelanin）1。通过提高cAMP水平的药理学试剂可刺激真黑素的合成1,14,31-35。	
	由于 Mc1r 蛋白是人类黑色素瘤风险的主要调控因子36-46，我们关注 Mc1r 保护黑素细胞免受紫外线诱导癌变的机制。作为研究的基础，我们在纯合 C57BL/6 遗传背景下建立了一种转基因 Mc1r 变异小鼠模型1。在该模型中，干细胞因子（Scf）在表皮基底层持续表达，表皮间毛囊黑素细胞终生保留在皮肤中47，这与非转基因小鼠不同，后者黑素细胞定位于毛囊的真皮层。通过引入K14-Scf转基因，表皮呈现色素沉着，其黑色素色素特征与动物色素品系一致1。在 C57BL/6 遗传背景上具有野生型 Mc1r 信号的K14-Scf小鼠，皮肤呈乌黑色，真黑素含量极高。不出所料，这些动物对紫外线具有高度抗性。相比之下，遗传背景相同的K14-Scf C57BL/6 小鼠若携带突变失活的 Mc1r，则表皮中几乎不含真黑素。相反，这些“扩展型”动物（Mc1re/e）因褐黑素沉积而呈现浅肤色表型（图 1A），对紫外线敏感性显著增加48-49。	
	具有可穿透皮肤的化学特性的药理学化合物已被证明可通过直接调节皮肤表皮黑素细胞中的cAMP水平，在extension（Mc1re/e）K14-Scf动物模型中强效诱导真黑素的生成。该模型中黑素上调的作用机制已有报道，包括腺苷酸环化酶激活1以及磷酸二酯酶4抑制35。本文中，我们展示了在模拟浅肤色、紫外线敏感人群的extension（Mc1re/e）K14-Scf动物模型上，佛司可林的制备及其局部外用方法。我们证明，每日两次给药可促进黑色素生成加速，皮肤变黑是由于表皮中黑素色素的沉积，并且通过“最小红斑剂量”（MED）的测定48，证实所诱导的表皮黑素可防护紫外线引起的晒伤。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>20% 酚妥拉明提取物</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>新泽西州普林斯顿</td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>美国俄亥俄州都柏林</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Anased 注射液</td><td>LA04612</td><td>美国爱荷华州申多阿</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮，USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>美国密苏里州圣约瑟夫</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>美国俄亥俄州索伦</td></tr><tr><td>脱毛膏，Nair</td><td>Church & Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>新泽西州普林斯顿</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>杀菌用 Hg 灯 UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>辐射计光度计</td><td>International Light</td><td>1LT400A</td><td>美国马萨诸塞州皮博迪</td></tr><tr><td>色差计</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>美国新泽西州拉姆齐</td></tr><tr><td>色差计 CR-400 数据处理器</td><td>Konica Minolta</td><td>DR-400</td><td>美国新泽西州拉姆齐</td></tr></tbody></table>

药理学诱导人源化小鼠模型表皮黑色素生成及其对晒伤的防护作用

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

皮肤颜色深浅、紫外线敏感性以及皮肤癌风险均与黑皮质素1受体（Mc1r）的生理功能相关，该受体是一种位于黑素细胞表面的Gs偶联信号蛋白。Mc1r可激活腺苷酸环化酶并促进cAMP生成，进而上调黑素细胞中黑色素的合成。为了研究Mc1r信号通路保护皮肤免受紫外线损伤的机制，本研究采用了一种基于表皮干细胞因子（Scf）表达的“人源化皮肤”小鼠模型。K14-Scf转基因小鼠可在表皮中保留黑素细胞，因而具备在表皮沉积黑色素的能力。在此动物模型中，野生型Mc1r状态可导致大量真黑色素（eumelanin）沉积，并呈现抗紫外线表型；相反，Mc1r信号功能缺陷的K14-Scf小鼠则表现为红/金发色、皮肤中真黑色素极少，并具有紫外线敏感表型。我们推测，模拟Mc1r信号通路的外用制剂可能增强真黑色素的沉积，研究发现，将毛喉素（forskolin）提取物直接应用于Mc1r功能缺陷的浅肤色小鼠皮肤后，可显著诱导真黑色素生成并提供紫外线防护1。本文描述了制备和使用含毛喉素的天然根部提取物处理K14-Scf浅肤色小鼠的方法，并报告了通过测定最小红斑剂量（MED）来评估紫外线敏感性的实验方法。利用该动物模型，可进一步研究表皮cAMP诱导及皮肤黑素化对紫外线暴露所引发的生理反应的影响。

C57BL/6小鼠在真黑素、褐黑素或无色素背景下产生，并携带K14-Scf转基因，具体方法如前所述（图1A）。肤色较浅的群体延伸（Mc1re/e, 酪氨酸+/+) 小鼠每日两次局部给予溶剂（70% 乙醇，30% 丙二醇）或 40% 粗提物 Coleus forskohlii 根提取物（80 μM 每剂量）连续5天（图2B）。通过肉眼观察和反射式比色法测定局部治疗对表皮色素沉着的影响（图1B）。根部提取物的应用与表皮显著变暗相关 K14-Scf 转基因背景下出现，但在基因匹配的非转基因动物中未出现。我们对这些结果的解释是：表皮间黑素细胞必须存在，才能使药理诱导产生的黑色素沉积于表皮。尽管该根提取物因含有 forskolin 以外的植物化学成分而呈现深色，但皮肤变黑不能单纯归因于药物的染色效应，因为非转基因动物在使用该根提取物后并未表现出皮肤变黑现象图1B）。当以每日两次的方式局部使用 forskolin 时，...

在浅肤色紫外线敏感型人类的小鼠模型中，外用佛司可林可诱导表皮黑色素生成。通过药物调节皮肤中的cAMP水平以及表皮色素加深，能够显著防护紫外线引起的炎症反应（晒伤），该保护作用通过最小红斑剂量（MED）检测法进行测定。

皮肤颜色、紫外线敏感性及皮肤癌风险均与黑皮质素1受体（melanocortin 1 receptor）的生理功能相关，该受体为一种Gs偶联信号转导受体……

以下实验的总体目标是通过测定经四种皮肤预处理的浅色皮肤小鼠的最小红斑剂量，来评估其对紫外线的敏感性。首先，通过剪毛和消融处理准备小鼠背部待照射的皮肤区域，随后将佛司可林外用制剂涂抹于背部皮肤。然后，将小鼠暴露于不同剂量的紫外线照射下，以确定四种介导型瓜类成分对紫外线诱导炎症的影响。实验结果表明，外用forline可显著增强皮肤色素沉着，且通过药物手段提高黑色素水平的动物表现出对紫外线的抵抗能力，这一点通过最小红斑剂量（MED）测定得以确认。这些为概念验证性研究，证明了即使个体因一种关键黑色素细胞基因——黑皮质素1受体（MC1R）的功能缺陷而无法自然晒黑，仍可通过药理学手段诱导其产生晒黑反应。在人类群体中，MC1R功能缺失与紫外线敏感性、易晒伤倾向以及无法晒黑相关，并在后期生活中使黑色素瘤风险最高增加至四倍。我们选择斯库林（scullin）作为本研究的药物，因为它能够绕过有缺陷的黑皮质素受体信号通路，欺骗黑素细胞使其误认为存在正常的MC1R信号通路，从而大量产生黑色素。这些黑色素沉积于皮肤中，可保护动物免受紫外线辐射的伤害。尽管我们知道这种方法可为皮肤功能及其潜在机制提供重要见解。它也可能在癌症预防中具有重要意义。由于我们已知紫外线辐射是绝大多数皮肤癌的主要致癌因素，加强皮肤防护措施可有效防止紫外线损伤。在进行腹腔注射时，针头置入后、注射内容物前，务必回抽确认，以确保针头未刺入血管、肠道或膀胱。腹腔注射应从右侧进行，以避开脾脏。在制备佛手柑提取物并用异氟烷对小鼠进行短暂麻醉后。根据文本方案，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪为动物追加麻醉剂。进行足趾夹捏以确认麻醉效果。使用配备0.25毫米外科准备头的电动剪刀剪除背部毛发。使用脱毛膏去除毛发残留。为避免灼伤或损伤皮肤，立即用浸水的纱布垫轻轻擦拭背部皮肤，直至完全清除脱毛膏。用柔软的纸巾将动物体表擦干，然后将其放入清洁的笼子中，并置于加热垫上使其恢复。通常，应短暂麻醉小鼠，以便在通风橱内通过吸入异氟烷的方式促进佛司可林或对照溶液的局部给药。开始时，将浸有异氟烷的纸巾放入一个洁净的透明玻璃罐中，并使罐内充满异氟烷。然后，在玻璃罐口覆盖一层定制的、透气的尼龙滤膜。将小鼠置于滤膜上方，使其吸入麻醉气体，持续时间以足以抑制其自主肌肉运动为宜，同时将已镇静的小鼠放置在洁净的吸水实验台垫上。进行趾部夹捏后，将400微升粗制福林提取物通过滴加到动物背部皮肤上的方式转移至其背部。然后使用移液 tip 的侧面将提取物均匀涂抹至暴露的背部皮肤整个表面。将小鼠放回笼中，并仔细观察直至其从麻醉中恢复，以防止出现非色素沉着。环磷酸腺苷（cAMP）效应会干扰紫外线敏感性实验。在紫外线照射前两天停止所有局部治疗，以进行反射色度测定。通过异氟烷吸入对小鼠进行短暂麻醉后。将便携式测量头放置在设备附带的标准白色表面上，以校准色度计。将便携式测量头紧贴动物背部皮肤，确保一平方厘米的圆形测光孔完全压紧在皮肤上。在背部皮肤的不同区域至少进行三次独立测量。计算每只动物及每个处理组的平均 L 值及其标准差。为确定最小红斑剂量（MED），每只动物将接受不同剂量的紫外线照射。首先，使用重型打孔器在遮光胶带上打出面积为 1 平方厘米的圆形孔洞，将胶带覆盖在每个照射区域上。在胶带上。贴上一小块但易于拆卸的胶带，以便移除。进行紫外照射时，将胶带贴在麻醉小鼠的背侧表面。如果动物的眼睛已睁开，应涂抹人工泪液，以防止因干燥和紫外线暴露造成损伤。打开由两个峰值输出为313纳米、波长范围为280至370纳米的UVB灯组成的紫外光源。在使用配备UVB传感器的紫外光度计验证输出之前，先让羔羊适应稳定的紫外输出；根据紫外光度计测得的紫外透射率，计算每个目标剂量所需的紫外照射时间。例如，您的灯管紫外线B输出量为每平方厘米2.4毫瓦。因此，要给予每平方米5千焦耳的剂量，皮肤需要接受208秒的紫外线B辐射，计算方法如上所示。接下来，将麻醉后的动物腹侧朝下放置，以确保紫外线均匀照射，从而依次给予选定的辐射剂量。在适当的时间移除覆盖孔洞的小块胶带。例如，如果最大剂量为 40 千焦每平方米，则小鼠需在灯下照射 27 分钟 47 秒，此剂量对应的孔洞从开始即暴露；而对于 5 千焦每平方米的条件，则应在照射还剩 208 秒时移除胶带。紫外线照射后剩余时间内，小心移除胶带，将动物置于温暖、安静的环境中，使其从麻醉状态恢复，然后再放回笼中。最小红斑剂量（MED）值是指引起皮肤整个暴露区域出现红斑和/或水肿等炎症反应的最低紫外线剂量。在紫外线照射区域，观察小鼠24至48小时，以检测是否存在明确的红斑或水肿区域。有时残留的初次毛茬会掩盖皮肤潜在的红斑或水肿，从而干扰最小红斑剂量（MED）检测结果的判读；用70%乙醇润湿皮肤可显著提高皮肤状况的可判读性。以摄影方式记录所有皮肤表现，然后将小鼠送回动物饲养设施。在本实验中，C56黑六小鼠是在含K14干细胞因子转基因的阳极或阳极遗传背景下培育而成，该转基因可使小鼠在表皮中保留黑素细胞，从而沉积黑色素。在本图所示的表皮中，对皮肤白皙的转基因小鼠群体进行为期五天的局部处理，每日两次涂抹溶剂或40%粗制colus fors coly根提取物。通过肉眼观察和反射色成像技术，评估局部处理对表皮色素沉着的影响。在K14 SCF转基因背景下，应用该根部提取物可显著增强表皮变暗；但在遗传背景匹配的非转基因动物中则无此效果，表明必须存在表皮间毛囊黑素细胞，药理诱导的黑色素才能得以沉积。在表皮中，尽管根提取物因含有除葫芦素四醇以外的植物化学物质而呈现深色，但皮肤变黑不能仅仅归因于药物的染色效应。由于非转基因动物在每日两次局部涂抹该根提取物后并未出现皮肤变黑现象（如此处所示），而 forskolin 的黑色素效应在短短两天内即可观察到。尽管最大程度的皮肤变黑需经过更长时间才能显现，这一点在本图中通过福尔马森染色及背部皮肤切片的黑色素染色结果得以证实。黑色素的增加程度具有剂量依赖性：接受每日一次、连续15天给药或每日两次、持续5天给药的动物，其皮肤变黑的程度相似。此外，在两种处理组中，四次给药均未产生明显的毒性效应。因此，我们得出结论：5天加速处理方案在促进背部皮肤黑色素生成方面，与标准的每日一次处理方案同样有效且安全。该图显示，通过 MED 检测发现，外用 forline 诱导表皮 mein 可产生显著的紫外线防护作用，而每日两次、连续五天使用溶媒处理的 K 14 SCF 扩展小鼠，其平均 MED 为 5.0 ± 0.0 千焦耳/平方米。经局部外用 four galin 治疗的各组小鼠，其平均 MED 超过 30.0 ± 0.0 千焦耳/平方米。事实上，30.0 千焦耳/平方米的剂量尚不足以引发红斑。在本实验中，采用标准 force Glen 给药方案，经处理的 K 14 SCF 扩展小鼠平均 MED 为 50.0 ± 7.1 千焦耳/平方米。重要的是，四嗪 Kline 预处理并未影响因缺乏 K14 SCF 介导的表皮黑素细胞或因酪氨酸酶缺乏而无法产生黑色素的动物的最小红斑剂量（MED）。由于在紫外线照射前两天已停止使用四嗪 Kline，且在紫外线照射后也未继续使用，因此我们得出结论：非色素性 CAMP 效应并未在 MED 结果中发挥作用。相反，数据表明，在该模型中，表皮黑色素是四嗪 Kline 诱导紫外线防护的作用机制。掌握该技术后，即可对皮肤色素沉着反应和紫外线敏感性进行简便且可重复的评估。在动物模型中应用福兰德（forland）方法每天仅需数分钟，实验的大部分时间实际上用于紫外线辐射和最小红斑剂量（MED）检测。在实施该操作时，重要的是要记住，皮肤会逐渐通过药理学机制恢复至其基础肤色。黑色素的诱导与晒黑反应非常相似，即只要存在刺激，皮肤就会保持 darker 状态；但当刺激去除后，这种晒黑会随着接下来数周内皮肤的代谢而逐渐消退。

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医学

表皮黑色素和防止晒斑的人性化小鼠模型的诱导药物

在本视频中，将来源于人类的黑色素瘤细胞皮下植入免疫缺陷小鼠的 flank 区域。PDX 模型可实现对黑色素瘤细胞的临床前研究，更好地重现 in vivo...

患者来源的异种移植模型构建：一种生成黑色素瘤小鼠模型的技术

本视频介绍了通过外用化学物质诱导两阶段皮肤癌变以研究肿瘤起始过程的实验方法。第一步是在小鼠模型皮肤上涂抹一种致突变剂DMBA，通过引起干细胞突变来启动肿瘤形成；随后使用促生长剂TPA处理，以加速皮肤乳头状瘤的形成。...

化学诱导的两阶段皮肤癌变模型：一种体内小鼠皮肤癌实验模型

本视频介绍了一种在人源化小鼠模型（即模拟人类皮肤的小鼠模型）中测量紫外线敏感性的方法。我们通过该方法确定能够引起皮肤红斑或水肿的紫外线最小红斑剂量（MED）。该方法有助于评估用于降低紫外线敏感性药物的有效性。...

最小红斑剂量检测：一种用于测量小鼠模型中紫外线敏感性的方法

我们描述了三种在体外评估化学物质脱色素活性的实验方法：1）细胞酪氨酸酶活性的定量，2）黑色素含量的定量，以及3）通过细胞黑色素染色和图像分析来测定黑色素。...

体外黑色素减少活性的定量分析

以下实验方案描述了一种利用基因工程小鼠模型，在小鼠背部皮肤中实现黑色素细胞肿瘤发生时空控制的方法。本方案详细说明了肉眼可见及显微镜下的皮肤黑色素瘤起始过程。...

由突变黑色素细胞干细胞启动小鼠黑色素瘤的空间与时间控制

两阶段皮肤致癌过程由两种外用化学物质诱导。致突变剂7,12-二甲基苯并[a]蒽可导致表皮细胞发生突变，而持续应用促生长剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯则可加速皮肤乳头瘤的形成。...

使用二甲基苯并[a]蒽和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（DMBA-TPA）建立化学诱导皮肤癌变模型

本实验方案的目的是在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），从而进一步促进组织中的生理反应。...

通过可切换的原卟啉IX依赖性原位活性氧生成刺激小鼠皮肤干细胞微环境及组织再生

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。...

小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

该方案描述了紫外线B辐射对小鼠全身及局部皮肤效应的研究。...

研究小鼠对紫外B辐射的长期暴露

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。...

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

采用tBHP诱导HNM细胞早衰的标准化方案，以及分析关键衰老标志物（包括生长停滞、SA-β-半乳糖苷酶活性和SASP因子）的标准化检测方法。...

一种使用叔丁基过氧化氢诱导原代人黑素细胞产生应激诱导性早衰的标准化方案

了解毛喉素诱导表皮黑色素生成的方法，用于研究UV敏感小鼠的皮肤保护机制。该方法通过药理学手段增强皮肤色素沉着，为预防紫外线损伤提供新策略。

药理学诱导人源化小鼠模型表皮黑色素生成及其对晒伤的防护作用

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