Name: 微孔板的检测，以评估RBL-2H3肥大细胞脱颗粒:三氯生的影响不使用有机溶剂的化学效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: 学习使用荧光微孔板检测法评估三氯生对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的抑制作用。该方法无需有机溶剂，通过检测β-己糖胺酶释放来定量分析脱颗粒水平，为免疫毒理学研究提供高通量筛选工具。

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L.M.W. 和 R.H.K. 受缅因大学生物医学科学与工程研究生院（GSBSE）的支持；R.H.K. 还受到缅因州农业部的支持。 &amp;#38; 森林实验站。额外资金由美国国立普通医学科学研究所（NIH P20-GM103423）和缅因州农业 &amp;#38; 林业实验站（资助编号 ME08004-10，J.A.G.）、缅因大学 ADVANCE 潮涌中心（美国国家科学基金会资助编号 #1008498）以及PhRMA基金会药物学/毒理学研究启动基金（J.A.G.）的支持。我们感谢David Holowka博士和Barbara Baird博士提供抗原和细胞。感谢Hina Hashmi、Alejandro Velez和Andrew Abovian在仪器使用和采购方面提供的帮助。本研究为缅因州农业 &amp;#38; 森林实验站出版物编号 3311

我们没有需要披露的内容。

2004年，Naal et al.1 开发了一种用于高通量检测脱颗粒的肥大细胞生物传感器。这是一种稳健的检测方法，我们已将其改进并应用于本视频中展示的TCS研究。在Naal et al.1 的方法出现之前，肥大细胞脱颗粒通常通过β-己糖胺酶59-61进行评估，但这些早期方法使用荧光计，每次只能读取一个样本。重要的是，Naal et al. 确立了其基于微孔板读数仪的高通量方法与早期单样本荧光计读数方法之间结果的一致性。总之，Naal et al.1 通过将该检测方法适配至高通量微孔板平台，并对操作流程进行了多项优化，显著提高了检测的速度、效能、简便性和可靠性。在此，我们进一步改进了该方法，用于研究多种待测化学品，特别是广泛使用的药物TCS。本视频详细展示了这一非常实用的检测方法的各个步骤。此外，我们还开发了一种无需有机溶剂、直接将TCS溶于水相缓冲液的方法，并展示了一种简单且低成本的TCS浓度验证流程。这些方法将有助于日益发展的三氯生毒理学研究领域。在本讨论中，我们也详细说明了应...

肥大细胞是富含颗粒的免疫效应细胞，在哮喘、过敏、寄生虫防御及致癌过程中发挥关键的介导作用13-16。它们存在于几乎所有有血管分布的组织中15，在细胞质颗粒中安全储存过敏性和炎症性介质，直至被激活而发生脱颗粒。脱颗粒是指膜包被颗粒的胞吐作用，导致组胺、类胰蛋白酶和白三烯等药理活性介质的释放15。该过程可启动Ⅰ型超敏反应，这在抵御寄生虫感染以及引发过敏、哮喘和致癌反应中具有重要作用15。
肥大细胞和嗜碱性粒细胞表达 FcεRI 受体，即免疫球蛋白 E（IgE）的高亲和力受体17。接触过敏原或抗原会导致多个与 IgE 结合的 FcεRI 受体发生聚集17，这种所谓的“IgE 结合 Fc 受体交联”会启动脱颗粒过程：一系列酪氨酸磷酸化事件、磷脂酶 C 激活、细胞内钙库释放钙离子以及细胞外钙离子内流18。钙离子内流是脱颗粒所必需的，并进一步触发颗粒与细胞膜融合，最终导致颗粒内容物的胞吐15。在实验中，可使用钙离子载体将钙离子直接转运穿过细胞膜19，从而实质上绕过钙内流之前的所有信号转导步骤20，有助于确定毒性物质的作用靶点位于钙信号通路的上游还是下游20。
通过监测细胞上清液中β-己糖胺酶的释放，可快速有效地测量脱颗粒作用，该酶与组胺6一同从颗粒中线性释放，但利用简单的酶-底物反应及微孔板读板仪检测其荧光产物则更易于检测。本方案部分详述的微孔板检测法基于Naal et al.1最初建立的一种可靠方法，该方法通过β-己糖胺酶裂解荧光底物4-甲基伞形酰基-N-乙酰-β-D-葡糖苷酸来定量脱颗粒程度。我们对该检测方法进行了改进，用于评估药物和有毒物质的作用，本文以三氯生为例进行说明。该方法可可靠地定量脱颗粒过程，相较于例如基于流式细胞术的检测方法21，成本更低，且具备良好的高通量筛选潜力，适用于多种抗过敏药物以及免疫毒性或致敏性化学物质的评估。最后这一点尤其重要，呼应了2007年美国国家研究委员会发布的报告《21世纪的毒性测试：愿景与策略》（<a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a>），该报告倡导开发基于细胞培养的高通量毒理学检测方法，以减少对小鼠等传统实验动物的昂贵依赖。Naal et al.1建立并由我们2改进的脱颗粒检测方案采用RBL-2H3细胞系，该细胞系是公认的人类黏膜肥大细胞或嗜碱性粒细胞的同源模型3-5。（RBL-2H3细胞的培养方法详见Hutchinson et al.22）。本检测方法亦可适用于其他贴壁型肥大细胞。
三氯生（TCS）是一种广谱抗菌剂，已在医院、个人护理产品和消费品中使用了30多年23,24。TCS抗菌特性的作用机制是抑制脂肪酸的生物合成，可能是通过抑制烯酰基-酰基载体蛋白还原酶实现的25,26。TCS在全球范围内的多种消费品中被发现，例如沐浴凝胶、护手霜、牙膏、漱口水以及洗手皂，其浓度可达0.3%或10 mM24。TCS的广泛使用已导致在人体27-29以及河流和溪流30中均能检测到其存在水平。Allmyr 等27开展的一项研究表明，TCS及其代谢产物存在于哺乳期母亲的血浆和乳汁中。重要的是，TCS可轻易被皮肤吸收31-37。Queckenberg 等37发现，在12小时内，约70 mM的TCS乳膏中有约10%被人体皮肤吸收，导致皮肤中TCS浓度显著升高，而肥大细胞正位于皮肤中。
临床上已证实三氯生（TCS）可缓解人类过敏性皮肤病7-11，但其缓解过敏性皮肤病的作用机制尚不清楚38。通过本视频中详述的荧光微孔板检测方法，我们近期证明，TCS在低至2 μM的浓度下即可显著抑制肥大细胞功能和脱颗粒，为这些临床数据提供了潜在的解释依据2。除了为上述临床数据提供解释外，Palmer et al.2的研究结果还表明，TCS可能靶向作用于钙离子内流下游的信号分子。鉴于钙信号在多种免疫及其他生物学过程中的重要性，TCS可能对多种必要的生物过程产生不良影响。事实上，Udoji et al.39已证明TCS可抑制人类自然杀伤细胞的杀伤活性，而后者是另一种重要的先天免疫功能。
三氯生（TCS）除了可能作为过敏性皮肤病的治疗辅助剂（或相反地，作为免疫毒性物质）外，还可能是一种内分泌干扰物40-49。因此，一种明确的化学物质溶液配制方法对毒理学家而言具有重要意义。由于TCS是一种小分子疏水性化合物，通常使用有机溶剂以提高其在水中的溶解度。在大多数已开展的TCS毒性研究中，其配制方法涉及在乙醇、丙酮或油类等有机溶剂辅助下将其溶解于水中2,50,51。然而，这些溶剂本身常常具有生物活性，从而可能干扰对受试化合物数据的解释51。事实上，根据Rufli et al.52及其他研究者53的建议，由于化学溶剂可能产生毒性假象， aquatic毒性实验的受试溶液应优先采用物理方法而非化学方法进行配制。我们此前已证实，将TCS溶于0.24%乙醇/水（体积/体积）并超声处理30分钟&#160;会抑制RBL肥大细胞的脱颗粒2。而乙醇浓度高于0.24%时已被证明会抑制肥大细胞脱颗粒54,55，这正是有机溶剂对毒性研究可能产生干扰效应的例证。
在研究中，不仅需要考虑溶剂对所用生物体或细胞的影响，还必须监测溶剂对测试化学品本身的作用。例如，Skaare et al.51 发现，将三氯生（TCS）溶解于聚乙二醇（常见于牙膏和漱口水中）会削弱其在健康女性中的抗菌和抗牙菌斑效果，而将其溶解于油类中则会导致其功能完全丧失。因此，在实验设计中应考虑不同溶剂对毒物和药物（包括TCS）作用的调节能力。在各类产品中使用油类或香料添加剂可能会干扰TCS的作用50,51。
为了消除使用有机溶剂的需要，我们改进了溶解三氯生（TCS2）的方法，完全避免了有机溶剂的使用。在本方案中，我们将三氯生颗粒直接溶于水相缓冲液中，并通过加热（≤50 °C）促进溶解，随后采用紫外-可见光谱法（UV-Vis）验证该三氯生储备液的浓度。这些改进之所以可行，是因为三氯生在水中的溶解度可达40 µM（<a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a>），且研究表明其在加热至50 °C时仍能保持稳定（<a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a>）56,57。此外，三氯生在280 nm处具有强吸收特性58，其摩尔消光系数为4,200 L/mol/cm12，因此非常适合采用紫外-可见光谱法进行定量分析。
本方案提供了一种简单且有效的方法，无需使用有机溶剂即可将TCS颗粒溶解于缓冲液中，具有成本低、浓度验证快速的优点，并描述了一种强大的荧光微孔板检测法，用于监测化学品对肥大细胞脱颗粒的影响。

<table><tbody><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;RBL-2H3 细胞&lt;/p&gt; </td><td>ATCC</td><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;CRL-2256&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;我们所使用的细胞系为馈赠品，但也可从ATCC获取&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;三氯生/Irgasan&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;72779&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 3380-34-5&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;应储存在低湿度环境中&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;胰蛋白酶&lt;/p&gt; </td><td>Gibco</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;25300-054&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 3380-34-5&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;EMEM&lt;/p&gt; </td><td>Lonza</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;12-611F&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;胎牛血清&lt;/p&gt; </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;S11150&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;硫酸庆大霉素&lt;/p&gt; </td><td>龙沙生物科学</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;17-518&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;牛血清白蛋白&lt;/p&gt; </td><td>Calbiochem</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;12659&lt;/p&gt; &lt;p&gt;CAS# 9048-46-8&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;Surfact-Amps X-100（Triton X-100；10% 溶液）&lt;/p&gt; </td><td>Pierce</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;28314&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;CAS# 9002-93-1&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;HEPES&lt;/p&gt; </td><td>J.T Baker</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;4153-01&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 75277-39-3&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;氯化镁&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;BDH0244-500G&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 7791-18-6&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;D-(+)-葡萄糖&lt;/p&gt; </td><td>生物医学</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;152527&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 50-99-7&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;氯化钾晶体&lt;/p&gt; </td><td>J.T Baker</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;3046-01&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 7447-40-7&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;氯化钙二水合物&lt;/p&gt; </td><td>Acros Organics</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;207780010&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;CAS# 10035-04-8&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;甘氨酸&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;G8898&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 56-40-6&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;4-甲基伞形基-N-乙酰-&amp;beta;4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸&lt;/p&gt; </td><td>EMD Biosciences</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;474502-250MG&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS # 37067-30-4&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;用铝箔包裹 &amp;ndash; 对光敏感&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;抗DNP小鼠IgE&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;D8406&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;试剂浓度为 1 mg/ml。分装 25 &amp;micro;l&amp;nbsp;将试剂分装至不同的微量离心管中，并用帕拉膜封口。将分装后的试剂在 -20 &amp;deg;C 未使用的需储存，正在使用的分装 aliquot 储存于 2-8 &amp;deg;C 不超过1个月。&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;DNP-BSA&lt;/p&gt; </td><td>康奈尔大学 David Holowka 博士和 Barbara Baird 博士惠赠</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot; 样式=&quot;无需翻译&quot;&gt;建议：life technologies DNP-BSA 目录号 &lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018&quot;&gt;A23018&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;钙离子载体 A23187&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;C75-22-1mg&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;离子载体由粉末加入 400 &amp;micro;l&amp;nbsp;将新鲜的100% DMSO加入离子载体小瓶中，并保存于-20 &amp;deg;C&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;注意：我们已成功使用超过3个月有效期的离子载体&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;DMSO&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;D2650&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 67-68-5&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;乙酸&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;BDH3094-2&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 64-19-7&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;无水碳酸钠&lt;/p&gt; </td><td>Sigma</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;222321&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 497-19-8&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;氯化钠&lt;/p&gt; </td><td>西格玛</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;71376&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 7647-14-5&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;盐酸&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;BDH3026&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CAS# 7647-01-0&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;参考缓冲液，pH 7&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;BDH5046&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;参考缓冲液，pH 10&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;BDH5072&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;参考缓冲液，pH 4&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;BDH5018&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;pH电极保存液&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;14002-828&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;DU 7500 分光光度计&lt;/p&gt; </td><td>Beckmann</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;不再销售&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;Synergy 2 酶标仪&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;使用 Gen5 微孔板数据采集与分析软件&lt;/p&gt; </td><td>BioTek</td><td>&lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;模块 S&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;血细胞计数板&lt;/p&gt; </td><td>豪斯科学公司</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;3110&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;7 ×&amp;nbsp;7 CER HOT/STIR 120 V&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;组合加热板/磁力搅拌器&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;97042-634&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;离心&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;5430&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;组织培养水浴箱&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;型号# 89032-206&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;组织培养生物安全柜&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;SafeGARD（TC罩）&lt;/p&gt; </td><td>The Baker Company</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;型号# SG403A-HE&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;组织培养孵育箱&lt;/p&gt; </td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;型号 3598&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;Pipetman&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;量程：P2-P1000&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;平衡&lt;/p&gt; </td><td>Mettler Toledo</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;型号# AG204&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;pH计&lt;/p&gt; </td><td>Symphony/VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;型号# SB70P&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;Pipet-Aid&lt;/p&gt; </td><td>Drummond Scientific</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;4-000-100&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;Combitip 分配器&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;4981 000.019&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;配方：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;乙酸盐缓冲液，pH 4.4&lt;/p&gt; </td><td>配制 0.12 M 乙酸，并用 10 N NaOH 滴定至 pH 4.4。该溶液为将 5.3 ml 冰乙酸加入 1 L MilliQ 水中制得：(1 L)×(0.12 mol/L)×(60 g/mol)×(ml/1.37 g) = 5.3 ml，因冰乙酸密度为 1.37 g/ml</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;无菌过滤至已灭菌的玻璃瓶中&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;底物（4-MU）&lt;/p&gt; </td><td>Sigma M-2133，250 mg，C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;否&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;，分子量 379.4，CAS (37067-30-4)，储存于 -20&amp;deg;C 储备液：0.12 M DMSO 溶液（1 ml DMSO 中含 46 mg），升温至 37 &amp;deg;C，涡旋，将样品置于温水浴超声仪中进行10分钟超声处理，再次涡旋</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;每次实验均需在乙酸盐缓冲液中新鲜配制底物溶液（100倍稀释），终浓度为1.2 mM。&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;甘氨酸碳酸盐缓冲液，pH 10&lt;/p&gt; </td><td>26.7 g 甘氨酸，47.1 g 无水碳酸钠，加去离子水至 1 L，调节 pH 至 10</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;无菌过滤后转入已灭菌的玻璃瓶&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;Tyrodes 溶液（2 L），pH 7.4&lt;/p&gt; </td><td>135 mM NaCl：15.78 g（或 270 ml 的 1 M 溶液） 
5 mM KCl：10 ml 的 1 M 储存液 
1.8 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.5 M 原液 7.20 ml 配制 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;：0.5 M 储液 4.00 ml 5.6 mM 葡萄糖：2.02 g（11.2 ml 的 1 M 溶液） 20 mM HEPES：1 M 储液 40 ml 使用浓盐酸将 pH 从约 9.7 调至 7.4</td><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;无菌过滤后转入已灭菌的玻璃瓶&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;RBL 细胞培养基&lt;/p&gt; </td><td>解冻胎牛血清（FBS，储存于 -20 &amp;deg;C约 4 小时 37 &amp;deg;C 水浴，遵循标准无菌操作技术，取出含L-谷氨酰胺的最低必需培养基（MEM）1升（含Earle's）&amp;rsquo;s 盐溶液）倒出部分 MEM，保留 800 ml MEM，加入 200 ml 预热的 FBS。用无菌移液管向 1 L 培养基中加入 1 ml 硫酸庆大霉素抗生素。仅使用经过高压灭菌并标记为仅用于细胞培养的培养基瓶。</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;无菌滤器（0.2 mm）过滤至已灭菌玻璃瓶中&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;使用的塑料材料：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;200 &amp;micro;l&amp;nbsp;带刻度的一次性无菌移液器吸头，置于96孔架中&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;53509-009&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚丙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;1,000 &amp;micro;l&amp;nbsp;带高回收率的无菌气溶胶吸头&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;89003-420&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;10 &amp;micro;l&amp;nbsp;微孔尖端 低吸附 无菌&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;14217-704&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚丙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;用于高离心力的一次性/锥形微量离心管&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;20170-038&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚丙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;一次性/带刻度/锥形/无菌 50 ml&amp;nbsp;带螺口盖的离心管&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;21008-178&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚丙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;一次性/带刻度/锥形/无菌 15 ml&amp;nbsp;带螺口盖的离心管&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;21008-103&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;聚丙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 细胞培养处理 T-25 培养瓶，带滤膜瓶盖&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio-One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;690175&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 细胞培养处理 T-75 培养瓶，带滤膜瓶盖&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;658175&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 10 ml&amp;nbsp;纸/塑料包裹的血清学移液管&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio One</td><td>&lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;607180&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 2 ml&amp;nbsp;纸/塑料包装血清学移液管&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;710180&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 5 ml&amp;nbsp;纸/塑料包裹的血清学移液管&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;606180&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR 25 ml&amp;nbsp;纸/塑料包裹的血清学移液管&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio-One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;760180&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;1 cm 比色皿&lt;/p&gt; </td><td>N/A</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;N/A&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;CELLSTAR，96孔微孔板，经组织培养处理，黑色，带盖&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;96孔板&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio One</td><td>&lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;655086&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚苯乙烯&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;Combitips&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td>&lt;p align=&quot;居中&quot;&gt;022266501&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚丙烯/&lt;/p&gt; &lt;p align=&quot;中心&quot;&gt;聚乙烯&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

一种用于评估化学物质对rbl-2h3肥大细胞脱颗粒影响的微孔板检测法：无需使用有机溶剂的三氯生效应研究

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

肥大细胞在过敏性疾病和抗寄生虫免疫防御中发挥重要作用。一旦被激活（例如 由过敏原激活后，肥大细胞会发生脱颗粒，这一过程导致过敏介质的胞吐。药物和毒物对肥大细胞脱颗粒的调节可能对人类健康产生有益或有害的影响。利用大鼠嗜碱性白血病肥大细胞（RBL-2H3）已对肥大细胞功能进行了深入研究，该细胞系被广泛用作人黏膜肥大细胞的模型3-5. 颗粒成分及过敏介质 &#946;β-己糖胺酶，该物质从肥大细胞释放时与组胺呈线性同步释放6可通过与荧光底物反应，从而在微孔板检测中产生可测量的荧光强度，该方法易于操作且结果可靠，适用于高通量研究。1. 最初由 Naal 等人发表 等人1我们已将该脱颗粒检测法改进用于药物和毒物的筛选，并在此展示其应用。
三氯生是一种广谱抗菌剂，存在于许多消费品中，已被发现可作为人类过敏性皮肤病的治疗辅助手段7-11，尽管其作用机制尚不明确。本文中，我们展示了一种用于评估三氯生对肥大细胞脱颗粒影响的检测方法。我们近期已证实，三氯生对肥大细胞功能具有显著影响2。为避免使用有机溶剂，三氯生通过加热和搅拌直接溶解于水相缓冲液中，并通过紫外-可见分光光度法（使用 ε280 = 4,200 L/M/cm）确认其最终浓度12。本方案可适用于多种化学物质，用于评估其对肥大细胞脱颗粒的影响，进而更广泛地评估其致敏潜力。

在 50 °C 下加热 90 分钟后，三氯生（TCS）的紫外-可见吸收光谱在约 260 至 300 nm 范围内呈现出一条强而平滑的曲线，峰值位于 280 nm，如图 1所示。因此，紫外-可见分光光度法是一种可用于计算浓度的重要工具，因为在 280 nm 处已发表的摩尔吸光系数为 4,200 L/mol/cm12。我们发现，在完成 50 °C 加热后，整个脱颗粒实验期间，TCS 不会从溶液中析出（数据未显示）。
采用此加热方法将TCS直接溶解于水相缓冲液后，我们利用基于荧光的检测方法（该方法经Naal et al.1优化）考察了TCS对肥大细胞脱颗粒的影响。该检测通过测定荧光底物产物的信号，记录肥大细胞在孵育1小时后释放的β-己糖胺酶水平。无论由DNP-BSA抗原（图2）还是钙离子载体A23187（图3）刺激诱导脱颗粒，均可明显观察到TCS对β-己糖胺酶释放（即脱颗粒）产生显著的剂量依赖性抑制作用。
图2 代表了经IgE致敏的RBL细胞的...

肥大细胞脱颗粒，即过敏介质的释放，在过敏、哮喘和抗寄生虫免疫防御中具有重要作用。本文展示了评估药物和有毒物质对脱颗粒影响的技术方法1，该方法最近被用于揭示抗菌剂三氯生对脱颗粒的强效抑制作用2。

一种用于评估化学物质对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒影响的微孔板检测法：无需使用有机溶剂的三氯生效应研究

肥大细胞在过敏性疾病和抗寄生虫免疫防御中发挥重要作用。一旦被激活（例如通过过敏原），它们会发生脱颗粒，这一过程导致过敏介质的胞吐。药物和毒物对肥大细胞脱颗粒的调节可能对人类健康产生有益或不良的影响。肥大细胞的功能已通过大鼠嗜碱性白血病肥大细胞（RBL-2H3）得到深入解析，该细胞是广泛接受的人类黏膜肥大细胞模型3-5。肥大细胞颗粒成分及过敏介质β-己糖胺酶可被方便且可靠地检测，该酶与组胺线性同步从肥大细胞释放6，通过与荧光原性底物反应，在微孔板检测中产生可测量的荧光强度，适用于高通量研究1。该脱颗粒检测法最初由Naal等人1发表，我们已将其改进用于药物和毒物的筛选，并在此展示其应用。三氯生是一种广谱抗菌剂，存在于多种消费品中，已被发现可辅助治疗人类过敏性皮肤病7-11，但其作用机制尚不明确。本文中，我们展示了一种检测三氯生对肥大细胞脱颗粒影响的实验方法。我们近期研究表明，三氯生对肥大细胞功能具有显著影响2。为避免使用有机溶剂，三氯生通过加热和搅拌直接溶解于水相缓冲液中，并通过紫外-可见分光光度法（使用ε280 = 4,200 L/M/cm）确认其浓度12。该方案可与多种化学物质联用，以测定其对肥大细胞脱颗粒的影响，进而评估其致敏潜力。

以下实验的总体目标是利用荧光微孔板检测法评估化学品对肥大细胞脱颗粒的影响。本方案中，在不使用有机溶剂的情况下，展示了抗菌剂三氯生对肥大细胞脱颗粒的抑制作用。具体方法为：首先将肥大细胞接种至96孔板中，使其过夜贴壁，并通过加热将三氯生直接溶解于水相溶液中，从而避免使用有机溶剂。然后使用紫外-可见分光光度法快速测定三氯生溶液的浓度。第二步，在存在或不存在三氯生的条件下，用IgE/抗原或钙离子载体刺激细胞，从而引起肥大细胞脱颗粒标志物β-己糖胺酶释放到上清液中。通过β-己糖胺酶底物检测上清液中β-己糖胺酶的释放量，其荧光产物在微孔板读数仪中进行定量。 为测定三氯生或其他测试化学品对肥大细胞脱颗粒的影响，采用基于荧光的微孔板法检测结果，显示三氯生可抑制大鼠嗜碱性白血病肥大细胞中由抗原或钙离子载体激活的脱颗粒过程。该技术相较于早期方法的主要优势在于，它是一种经济、快速且高度敏感的替代方法，具有适用于高通量筛选的潜力。此外，三氯生无需使用有机溶剂而直接溶解于水溶液中，可避免多种有机溶剂对肥大细胞功能造成的混杂效应。该三氯生浓度测定技术还具有紫外-可见分光光度法快速、低成本的优势。该显微镜分析（MA）可用于研究三氯生对肥大细胞脱颗粒的影响，而此微孔板分析（SA）也可应用于多种潜在抗过敏药物候选物及待测化学品的筛选，以评估其免疫毒性或内分泌干扰效应。本实验方案采用大鼠嗜碱性白血病肥大细胞系（RBL-2H3），该细胞系是公认的人类黏膜肥大细胞或嗜碱性粒细胞的模型。RBL细胞按照标准操作在T25培养瓶中培养，并经胰蛋白酶消化后进行细胞计数。用 RBL 培养基制备细胞密度为 0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液，用于接种细胞；每孔加入 100 µL 细胞悬液至平底黑色 96 孔板中。随后根据板模板表操作，以避免系统误差，并随机分配细胞加入各孔。每加入三孔为一组，组间需充分但轻柔地混匀细胞悬液，以确保接种过程中细胞保持悬浮状态。将所有细胞转移至96孔板后，盖上板盖，于37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。进行脱颗粒实验当天，准备三氯生（Triclosan）或TCS：称取0.0022克TCS颗粒，转移至含有250毫升Tyrode缓冲液和搅拌子的锥形瓶中，并标记为TCS缓冲液。为确保所有TCS均转移至锥形瓶中，可使用已量取的250毫升缓冲液中的10毫升进行冲洗。用 Ty Roads 缓冲液冲洗掉船体上的污物。将此缓冲液倒回 TCS 缓冲液烧瓶中。将 TCS 缓冲液烧瓶置于组合加热磁力搅拌器上，并调节至适宜的较高速度进行搅拌。同时，将一个仅装有250毫升Tyrode缓冲液而不含TCS的对照缓冲液锥形瓶放置于第二个组合式加热磁力搅拌器上，并以相似速度进行搅拌。在持续搅拌的同时，将含TCS的缓冲液和对照缓冲液加热至50摄氏度。当温度达到50摄氏度时，设置计时器为90分钟。90 分钟结

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科研

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Immunology and Infection

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一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

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一种改进的趋化性检测方法用于快速鉴定根系分泌物中的根际细菌趋化物

学习使用荧光微孔板检测法评估三氯生对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的抑制作用。该方法无需有机溶剂，通过检测β-己糖胺酶释放来定量分析脱颗粒水平，为免疫毒理学研究提供高通量筛选工具。

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