Name: 细胞物质相互作用研究微细的纳米多孔金模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学习使用模板印刷和光刻技术制备纳米多孔金薄膜微图案，并在其上培养细胞，通过荧光显微镜和扫描电子显微镜结合图像分析定量研究细胞与材料的相互作用。该方法具有高比表面积、生物相容性和微加工兼容性等优势。

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O. Kurtulus 和 D. Dimlioglu 获加利福尼亚大学实验室费用研究计划奖助金 12-LR-237197 资助。P. Daggumati 获加利福尼亚大学戴维斯分校科学与工程研究投资（RISE）奖助金资助。C.A. Chapman 获美国教育部研究生国家急需领域助学金资助。本研究工作得到加州大学实验室费用研究计划、加州大学戴维斯分校 RISE 计划以及加州大学戴维斯分校工程学院启动资金的支持。

1. 纳米多孔金的制备
<ol>
	<li>使用 Piranha 溶液清洗基底
	<ol>
		<li>在结晶皿中将 25 ml 过氧化氢（30%）加入 100 ml 硫酸（96%）中，并在加热板上将混合物加热至 65 °C。注意：液体具有极强腐蚀性，必须小心操作。使用后的溶液不得储存在密封容器中，否则可能发生爆炸。</li>
		<li>使用耐酸镊子将 1 英寸 × 3 英寸的显微镜载玻片放入混合液中，清洗 10 分钟。批量清洗小尺寸盖玻片时使用陶瓷免疫染色槽。在浸入溶液前，先用 10 W 空气等离子体处理小尺寸盖玻片 30 秒。</li>
		<li>在流动的去离子水（DI 水）下，于结晶皿中冲洗清洗后的样品 3 分钟。在无尘纸巾上方用氮气枪吹干样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备模板掩膜（方法 1：用于创建毫米级图案）
	<ol>
		<li>在半硬塑料表面上，使用活检打孔器对 250 μm 厚的硅橡胶片进行打孔，和/或使用手术刀切割出所需区域。在 70% 异丙醇中清洗处理后的橡胶片，并用氮气枪吹干。</li>
		<li>将打孔后的橡胶片放置在无尘洁净室纸巾上，将经 Piranha 溶液清洗的盖玻片对准模板放置，样品面朝向模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图案化剥离型光刻胶（方法 2：用于创建亚毫米级图案）
	<ol>
		<li>将经 Piranha 溶液清洗的显微镜载玻片放置在旋转卡盘上，并用氮气枪吹去表面颗粒物。使用塑料移液管将 1.5 ml 偶联剂（六甲基二硅氮烷）滴加到玻璃载玻片上。通过依次以 500 rpm 旋转 5 秒和 1,500 rpm 旋转 30 秒的方式均匀涂布偶联剂。在加热板上 115 °C 烘烤 7 分钟，随后冷却 5 分钟。</li>
		<li>将 4 ml 光刻胶滴加到玻璃载玻片（3 英寸 × 1 英寸）上。使用与偶联剂相同的旋转程序涂布光刻胶。在加热板上 115 °C 烘烤 1.5 分钟，随后冷却 10 分钟。</li>
		<li>通过透明掩膜，用紫外光（强度：22 mW/cm2）照射涂有光刻胶的载玻片 15 秒。在加热板上 115 °C 烘烤 1.5 分钟，静置 45 分钟。在显影液中溶解曝光区域的光刻胶至少 3.5 分钟。用去离子水彻底冲洗。在光学显微镜下检查显影后的图案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沉积前驱金属以制备 np-Au 薄膜
	<ol>
		<li>将样品装入可独立沉积金、银和铬的溅射设备中。在开始金属沉积前，在 25 mTorr 氩气气氛下以 50 W 功率对样品进行 90 秒的溅射清洗。</li>
		<li>在 10 mTorr 氩气下以 300 W 功率溅射铬 10 分钟。在 10 mTorr 氩气下以 400 W 功率溅射金 90 秒。以银 200 W、金 100 W 的功率共溅射金和银 10 分钟。关闭溅射源时，金源应比银源提前约 10 秒关闭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获得前驱金属微图案
	<ol>
		<li>将涂有光刻胶的样品在约 180 ml 光刻胶剥离液中进行超声处理，共 10 个循环，每个循环包括 20 秒超声和 2 分钟暂停。用去离子水冲洗样品，并用氮气枪吹干。在显微镜下检查金属图案。</li>
		<li>使用两把镊子从未涂光刻胶的样品上剥离橡胶模板，以露出沉积的金属。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去合金前驱金属并通过热处理调控纳米结构
	<ol>
		<li>在 200 ml 玻璃烧杯中加入 170 ml 硝酸（70%），并在加热板上将溶液温度维持在 55 °C。注意：硝酸具有极强腐蚀性，操作时应佩戴适当的防护装备。</li>
		<li>在浸入硝酸前，先用 10 W 空气等离子体处理小尺寸盖玻片 30 秒。使用耐酸镊子将 1 英寸 × 3 英寸的显微镜载玻片放入烧杯中，去合金处理 15 分钟。批量去合金小尺寸盖玻片时使用陶瓷免疫染色槽。</li>
		<li>将去合金后的样品依次在两个盛有新鲜去离子水的烧杯中各浸洗三次。将样品保存在去离子水中，并至少持续一周每天更换新鲜去离子水。使用前在无尘纸巾上方用氮气枪吹干样品。</li>
		<li>将样品装载到快速热处理设备中的洁净硅片上。将温度设定在 200 °C 至 450 °C 之间，升温速率为 10 °C/秒。在氮气氛围下使样品在设定温度下保持 10 分钟。待腔体冷却（&lt;100 °C）后取出样品。或者，也可将样品缓慢放置在加热板上进行热处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>为细胞培养准备np-Au样品
	<ol>
		<li>将np-Au样品放入聚苯乙烯培养皿中，以10 W空气等离子体处理30秒，随后将样品转移至24孔组织培养板中。</li>
		<li>每孔加入500 μl完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基）。置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中保存，直至接种细胞（&lt;1小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的培养、传代与接种
	<ol>
		<li>将目标细胞（本实验中为3T3-NIH成纤维细胞或小鼠星形胶质细胞）在T75培养瓶中用培养基进行培养，当细胞融合度达到70%时进行传代。</li>
		<li>传代时，吸除培养瓶中的培养基，用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，加入2 ml 1×胰蛋白酶/EDTA溶液，孵育至细胞脱落（约5分钟）。加入3 ml新鲜培养基终止消化，以1,200 rpm离心3分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml培养基中。</li>
		<li>吸除孔中旧培养基，将细胞以25,000个细胞/cm2的密度接种到玻璃盖玻片上，终体积为1 ml。前后左右轻轻摇动培养板，确保细胞在样品表面均匀分布。接种后继续培养，并每日观察细胞状态，直至进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞与材料分析
<ol>
	<li>染色细胞以观察细胞骨架和细胞核
	<ol>
		<li>从孔板中移除用过的培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。</li>
		<li>在含 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中配制 300 nM Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽的染色液。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞两次，然后在含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中加入 500 μl 进行透化处理，持续 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞两次，并转移至洁净的孔中。将 50–200 μl 染色液滴加到样品上，避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞，然后用含 3 nM DAPI 的 PBS 进行复染，孵育 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞，再用去离子水短暂浸泡，随后将样品置于载玻片上，加入封片剂，盖上盖玻片，并用透明指甲油封边。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取 np-Au 样品及 np-Au 表面细胞培养物的图像
	<ol>
		<li>使用扫描电子显微镜（SEM），在 10 kV 电子束能量下，采用二次电子探测器，以 50,000 倍放大倍数对 np-Au 表面进行成像。</li>
		<li>使用倒置荧光显微镜，配合合适的滤光片组，在 10 倍放大倍数下，对样品不同区域采集细胞复合图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理图像以确定孔隙和细胞形态
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开图像，如有需要将其拆分为独立通道。将图像转换为 8 位，减去背景，并通过中值滤波进行平滑处理。手动或使用内置阈值算法调整阈值，以突出显示孔隙（空腔）和细胞体/细胞核。</li>
		<li>使用分水岭命令分离重叠的孔隙或细胞。设置颗粒分析参数并执行命令，以提取颗粒数量、平均面积以及颗粒所占百分比。使用 DAPI 染色的细胞图像进行细胞计数，使用鬼笔环肽染色的细胞图像量化细胞覆盖百分比。</li>
		<li>修改提供的宏文件，以实现多幅图像的批量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+materials+for+advanced+energy+conversion+and+storage+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices.</a> Nature Materials. 4, 366-377 (2005).</li>
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<li>Okman, O., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+Nanoporous+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoporous+Gold%3A+From+an+Ancient+Technology+to+a+High-Tech+Material%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69(2012).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Scripta+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li>
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<li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

我们展示了两种不同的技术来对纳米多孔金（np-Au）薄膜进行微图形化，以拓展这些薄膜在微系统和生物研究中的应用。溅射镀金和银是一种制备np-Au图案的通用方法，因为溅射工艺与传统的微加工流程相兼容，且通过分别调节金和银靶材的溅射枪功率以及沉积时间，可方便地控制合金成分和膜层厚度。典型的np-Au薄膜厚度范围为200 nm至2 μm。模板法（方法1， 图 2a) 使用活检打孔器和手术刀可制作毫米级图案，从而避免了光刻的需要。更复杂的图案可通过可编程激光切割机制备。这种柔性的硅胶弹性体掩模可自行粘附于玻璃表面，从而防止金属沉积在掩模下方，提高图案分辨率。然而，更小的特征（&lt;1 mm）通常难以通过此方法制备，因为掩模的厚度会阻碍金属在开口区域的均匀沉积。对于需要更高特征分辨率的应用，可采用光刻图案化方法（方法2， 图 2d）。用于通过光刻技术转移图案的透明掩模可从多家公司获得（例如 输出城市：班顿，俄勒冈州）在所需最小特征尺寸大于约20 μm时，是相较于铬玻璃掩模经济的替代方案。金属沉积到柔性模板上时，有时会因应力分布不均而导致模板从基底上脱落。我们通...

具有纳米尺度特征的材料在提升多种应用方面展现出巨大潜力，包括燃料电池1、传感器2,3和生物医学器件4,5。一种相对较新的材料是纳米多孔金（np-Au），它通过纳米尺度的自组装过程制备而成。np-Au的前驱体是一种金合金，其中最常见的是含银量为60%至80%（原子百分比）。简而言之，其特有的开孔纳米结构是在强酸（例如 70%硝酸）或电化学电位作用下溶解银的过程中，金原子在团簇内重新排列所形成的6-8。np-Au具备多种理想特性，包括高比表面积、优异的导电性、成熟的表面功能化技术以及良好的生物相容性9。尽管近年来关于np-Au的研究迅速增长，但大多数研究集中在其力学性能10,11、催化活性12以及生物分子传感性能13-15。虽然这些理想特性对多种生物医学工具极具价值16,17，但该材料在此领域的应用仍较为有限。其中一个可能的原因是，大多数研究主要使用宏观尺度的样品（例如 薄片、箔片和铸锭），而将np-Au集成到微型系统中的技术仍不完善。事实上，采用np-Au薄膜的常规微加工技术实例极少16-20。随着微型化技术的发展以及对新型生物医学工具的需求日益增长，能够将新材料整合进器件中变得至关重要。这通常要求材料可通过常规微加工技术进行沉积和图形化。此外，通常还需要快速量化细胞-材料相互作用，以评估新材料的生物相容性。本文的目标是展示对np-Au薄膜进行微图形化的基本技术，并通过数字图像处理手段定量分析其纳米结构及细胞-材料相互作用。

<table><tbody><tr><td>金靶材</td><td>Lesker</td><td>EJTAUXX403A2</td><td>用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体</td></tr><tr><td>铬靶材</td><td>Lesker</td><td>EJTCRXX353A2</td><td>作为粘附层</td></tr><tr><td>银靶材</td><td>Lesker</td><td>EJTAGXX403A2</td><td>用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体</td></tr><tr><td>瓷舟</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>用于处理小样品</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43873</td><td>以70%浓度用于去合金化</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>J.T Baker</td><td>7664-93-9</td><td>以96%浓度用于piranha清洗</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>J.T Baker</td><td>7722-84-1</td><td>以30%浓度用于piranha清洗</td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Ted Pella</td><td>150xx</td><td>提供多种尺寸</td></tr><tr><td>硅橡胶片</td><td>Rogers Corporation</td><td>HT 6240</td><td>提供多种厚度</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td>用作正性光刻胶的附着促进剂</td></tr><tr><td>Microposit MF CD26</td><td>Shipley</td><td>38490</td><td>正性光刻胶显影液</td></tr><tr><td>PRS 3000</td><td>J.T Baker</td><td>JT6403-5</td><td>正性光刻胶剥离剂</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片（12 mm）</td><td>Ted Pella</td><td>26023</td><td>用作金属图案和细胞培养的基底</td></tr><tr><td>载玻片（1 x 3 英寸）</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td>用作金属图案的基底</td></tr><tr><td>聚酰亚胺 Kapton 胶带</td><td>VWR</td><td>82030-950</td><td>用于固定弹性体</td></tr><tr><td>透明光刻掩模</td><td>Output City</td><td></td><td>用于光刻工艺 &lt;a href=&quot;http://www.outputcity.com/&quot; target=&quot;_blank">http://www.outputcity.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>用于活化玻璃表面</td></tr><tr><td>溅射仪</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>LAB18</td><td>用于金属沉积</td></tr></tbody></table>

用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

特征尺寸在几十纳米范围内的纳米结构材料已显著提升了多种技术的性能，包括燃料电池、生物传感器、生物医学器件涂层和药物递送工具。通过纳米尺度自组装过程制备的纳米多孔金（np-Au）是一种相对较新的材料，具有较大的有效比表面积、高电导率和催化活性。这些特性使np-Au成为科学界广泛关注的材料。目前大多数关于np-Au的研究采用宏观尺度样品，主要聚焦于该材料的基本科学性质及其在催化和传感领域的应用。然而，宏观样品限制了np-Au在微型化系统（如生物医学器件）中的潜在应用。为解决这一问题，我们首先介绍了两种在刚性基底上对np-Au薄膜进行微图形化的方法。第一种方法采用手工制作的掩模版来生成毫米尺度的np-Au图案，第二种方法则利用剥离式光刻技术实现亚毫米尺度的图案化。由于np-Au薄膜通过溅射沉积工艺获得，因此与传统的微加工技术兼容，易于集成至微系统中。这些微系统包括可电寻址的生物传感器平台，可充分利用其高有效比表面积、良好电导性以及基于金-硫醇化学的表面生物偶联特性。我们还描述了细胞培养、免疫荧光染色和图像处理技术，用于量化np-Au与哺乳动物细胞之间的相互作用，这是某些生物传感器的重要性能参数。我们预期，本文所展示的技术将有助于np-Au在不同尺度平台中的集成，并推动其在生物传感器、储能系统和催化剂等众多领域的广泛应用。

图1概述了主要的实验步骤，包括制备纳米多孔金（np-Au）图案、细胞培养、纳米结构的量化以及细胞形态的表征。图2a（顶部）所示的弹性体掩模用于制备其下方图像中的np-Au图案。图2b为用于批量处理样品的瓷舟的实物照片。图2c展示了金属沉积图案在去合金化处理前后的颜色变化。去合金化前的银白色外观源于富银合金成分；去合金化后，薄膜呈现出明显的橙棕色色调。图2d展示了通过光刻技术对金属进行图案化所获得的更精细结构。通过热处理np-Au薄膜可获得不同的孔隙形态9，如图3所示。横截面图像（图3）可揭示薄膜在厚度方向上是否均匀去合金化。扫描电镜（SEM）图像可通过分割（阈值处理）转化为二值图像（图3底行），以确定孔隙的尺寸及孔隙所占面积百分比（代码1）。图4展示了一张典型的荧光图像，显示在np...

我们报道了通过掩模版印刷和光刻技术对纳米多孔金薄膜进行微图形化的方法，以及在微加工图案上培养细胞的技术。此外，我们还描述了利用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术对材料及培养细胞的形态进行表征的图像分析方法。

具有数十纳米尺度特征结构的纳米材料已提升了多种技术的性能，包括燃料电池、生物传感器、……

本实验的总体目标是制备纳米多孔金微米级图案，并验证其与细胞培养的兼容性。首先通过制备模板或光刻掩膜实现这一目标；第二步是通过掩膜共溅射金和银，以形成纳米多孔金的前驱合金图案。接下来，将金银合金图案在硝酸中进行脱合金处理，以生成纳米多孔金涂层。最后一步是在纳米多孔金的微图案上培养细胞并进行免疫荧光染色，最终结合图像分析，利用荧光显微镜和扫描电子显微镜对细胞与材料的相互作用进行定量分析。与其他制备纳米结构涂层的方法（如碳纳米管）相比，该技术的主要优势在于，纳米多孔金具有与微加工工艺兼容、有效比表面积高、可通过基于分子的化学方法简便地进行功能化修饰、良好的电导性以及优异的生物相容性。该方法可解答材料科学与生物工程领域中的关键问题，例如材料纳米结构对电学、力学、生物学及化学性能的影响。尽管该方法能够揭示纳米结构对细胞形态的作用，还可应用于其他系统，如生物传感器、药物递送系统以及能量存储平台的开发。开始此操作前，使用食人鱼溶液清洗尺寸为一英寸乘三英寸的显微镜载玻片和小型盖玻片。将小型盖玻片放入瓷制免疫染色舟中，并将染色舟连同显微镜载玻片一起浸入食人鱼溶液中。有关清洗步骤的详细信息，请参见文本方案。清洗完成后，将样品转移至结晶皿中，并用去离子水冲洗三分钟。将样品置于无尘布上，并用氮气枪吹干，以形成毫米级图案。使用活检打孔器对250微米厚的硅胶弹性体片进行打孔。将处理后的弹性体片浸入70%异丙醇中清洗，随后用氮气枪吹干。然后将打孔片放在无绒布上，将清洁过的盖玻片对准模板，使样品面朝向模板。将带有盖玻片的模板转移至载片上，以形成亚毫米级图案。将一块清洁的显微镜载玻片置于旋转卡盘上，并用氮气枪吹去任何微粒。将1.5毫升六甲基二硅烷滴加到玻璃载玻片上。使用塑料移液管，通过依次以500转/分钟旋转5秒和1500转/分钟旋转30秒的方式均匀铺展六甲基二硅烷。完成后，将载玻片置于加热板上，在115°C下烘烤7分钟，然后冷却5分钟。接下来，将四毫升正性光刻胶滴加到玻璃载片上。通过以先前所述条件旋转载片来均匀涂布光刻胶。将载玻片置于 115 摄氏度的加热板上烘烤 1.5 分钟，在紫外光照射并烘烤后将其取出。通过将载玻片浸入正性光刻胶显影液中，溶解曝光区域的光刻胶。至少显影3.5分钟。完成后，用去离子水彻底冲洗载玻片，并在光学显微镜下检查显影后的图形。接着，将样品装入可独立溅射沉积金、银和铬的溅射仪中。在开始金属沉积前，先在50瓦功率、25毫托的氩气处理气氛下清洗样品90秒，随后在10毫托的氩气溅射铬条件下以300瓦功率溅射10分钟。然后以400瓦功率溅射金90秒，接着共溅射金和银10分钟，其中银的功率为200瓦，金的功率为100瓦。关闭溅射源时，先关闭金溅射源，约10秒后再关闭银溅射源。从溅射机中取出样品后，将样品放入约 180 毫升的正性光刻胶剥离液中，进行 10 次超声处理，每次超声 22 秒，两次循环之间暂停 2 分钟。完成后，用去离子水冲洗样品，并用氮气枪吹干。在显微镜下检查金属图案。然后使用两把镊子从未涂覆光刻胶的样品上剥离弹性体掩模，以显露出沉积的金属。在将小盖玻片浸入硝酸之前，先用10瓦的空气等离子体处理30秒。将显微镜载玻片浸入盛有70%硝酸的烧杯中，在55摄氏度下处理15分钟以进行去合金化。去合金化完成后，依次将样品浸入盛有去离子水的烧杯中清洗，每次3次，每次更换去离子水。将样品置于无尘布上，并使用氮气枪吹干。将加热板的温度调节至150至300摄氏度之间。然后缓慢将样品放置到加热表面，以尽量减少温度的突然变化。五分钟后，将样品从加热板上取下冷却。将纳米多孔金样品放入聚苯乙烯培养皿中，并以10瓦的空气等离子体处理30秒。然后将样品转移至24孔组织培养板中。向每个孔中加入 500 微升完全培养基。将培养板置于 37 摄氏度、5% CO2 的湿化培养箱中，直至接种细胞。在 T75 培养瓶中用培养基维持培养小鼠星形胶质细胞。当细胞融合度达到70%时，首先移除旧的培养基，并用PBS洗涤细胞，然后进行传代。有关传代条件的详细信息，请参见文本方案。从培养箱中取出培养板后，吸除废弃的培养基，并将细胞接种到玻璃表面。以每平方厘米25,000个细胞的密度接种盖玻片，终体积为1毫升。轻轻摇动培养板，确保细胞在样品表面均匀分布，待细胞准备好进行分析后，将培养板放入培养箱中。移除孔中的旧培养基，并用PBS洗涤两次。将细胞在 PBS 中含 4% 多聚甲醛固定后，用 PBS 洗涤两次，再在 500 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中透化处理 5 分钟。重复用 PBS 洗涤两次，将细胞转移至新的孔板中。每样本加入 80 微升染色液，用铝箔包裹后避光孵育 20 分钟。再次用 PBS 洗涤后，用含有三纳摩尔 DPI 的 PBS 对细胞进行五分钟后染。再用 PBS 洗涤细胞一次，将细胞浸入二并置于载玻片上。用封片剂覆盖盖玻片，并用透明指甲油封边后成像。使用扫描电子显微镜，在10千伏电子能量下以50,000倍放大倍率观察纳米多孔金表面。随后，使用倒置荧光显微镜配合相应的滤光镜组，在10倍放大倍率下对样品不同位置进行复合细胞图像采集。在ImageJ中打开图像，将图像拆分为各个独立的通道。将它们转换为八位。减去背景，并通过中值滤波进行平滑处理。然后手动调整阈值，以突出显示孔隙、细胞体和细胞核。使用分水岭命令分离合并的孔隙或细胞。设置颗粒分析参数并执行命令，以提取颗粒数量、平均面积和颗粒覆盖百分比。最后，修改包含的宏文件，对多幅图像进行批量分析。此处展示了沉积金属图案在脱合金前后颜色的变化。银白色外观是由于合金化后富含银的合金成分所致，而薄膜则呈现出明显的橙棕色色调。此处展示的是通过光刻技术产生的金属微细结构。通过热处理多孔金薄膜，可获得不同的孔洞形貌。横截面图像可揭示薄膜在厚度方向上是否发生均匀的脱合金化。扫描电子显微镜图像可分割为二值图像，以确定孔洞的尺寸和面积占比。生成该结果的代码可从 JoVE 网站页面下载。此处展示的是在纳米多孔金表面培养的贴壁小鼠星形胶质细胞的代表性荧光图像。该图像的各个通道可被分离和分割，以生成用于分析细胞与材料相互作用的二值图像。分割后的细胞骨架图像可用于定量细胞面积和表面覆盖率。尽管分割后的细胞核图像可用于细胞计数，但生成这些结果的代码可从 JoVE 网站下载。此处展示的是纳米多孔金结构制备过程中失败情况的可视化总结，包括 PO 薄膜附着不良、缺乏孔隙率以及过度热处理。按照本实验方案，还可采用其他方法进行森林显微镜下的电化学表征、细胞裂解和 PCR，以进一步探究纳米结构对细胞黏附和基因表达的影响等问题。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何制备纳米孔金图案，并通过显微镜图像的数字图像分析来定量表征其与细胞的相互作用。结果。请务必注意，使用硝酸、硫酸和过氧化氢具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取预防措施，包括穿戴个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

细胞物质相互作用研究微细的纳米多孔金模式

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

以下实验方案详细介绍了利用金属薄膜中的双纳米孔实现介电纳米颗粒的低功率光镊捕获。...

纳米颗粒的光镊捕获

本视频展示了利用局域表面等离子体共振成像技术检测单个细胞分泌的蛋白质。通过微流控装置和带有肽段的等离子体纳米结构芯片，在共振角度下反射光强度的变化可反映出与单个细胞分泌蛋白之间的相互作用。...

基于局域表面等离子体共振成像的单细胞蛋白分泌检测

本方案描述了一种与微加工工艺兼容的在SiO2表面进行细胞图案化的技术。通过光刻法将预设的聚对二甲苯-C（parylene-C）图案印制在SiO2晶圆上。在孵育血清（或其他激活溶液）后，细胞特异性地黏附于下方的聚对二甲苯-C区域，并沿其轮廓生长，而在SiO2区域则被排斥。...

在光刻定义的聚对二甲苯-C：SiO 上进行细胞图案化2 底物

细胞间通讯对于调控细胞内外多种生理活动至关重要。本文介绍了一种用于测量单个细胞分泌物时空特性的实验方案。为实现这一目标，采用了一种多学科交叉的方法，将无标记纳米等离子体传感技术与活细胞成像相结合。...

一种用于单细胞分泌物时空成像的无标记技术

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。...

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

我们演示了利用胶体光刻技术制备周期性金纳米杯阵列的方法，并讨论了纳米等离激元薄膜的重要性。...

利用胶体光刻技术制备周期性金纳米杯阵列

本文介绍了一种基于探针阵列迭代对准的广域扫描探针纳米光刻技术方案，以及利用光刻图案进行细胞表面相互作用研究的方法。...

大面积扫描探针纳米光刻技术通过自动对准实现及其在细胞培养研究用基底制备中的应用

本文介绍了一种通过热纳米压印技术制备梯度纳米图案化培养板，并筛选人内皮祖细胞对这些纳米结构响应的方法。利用所述技术，可制备出能够通过物理刺激调控细胞行为的支架材料。...

利用热纳米压印技术制备梯度纳米图案及人内皮集落形成细胞响应的筛选

本方案详细介绍了一种新型纳米制造技术，该技术基于 capped...

通过封端去润湿法在大面积基底上可控且可定制地制备金纳米颗粒

通过结合电化学和化学去合金化方法，可制备具有分级结构和双峰孔径分布的多孔纳米金。合金成分可被实时监测。 通过...

一种制备纳米多孔金分级结构的通用技术

学习使用模板印刷和光刻技术制备纳米多孔金薄膜微图案，并在其上培养细胞，通过荧光显微镜和扫描电子显微镜结合图像分析定量研究细胞与材料的相互作用。该方法具有高比表面积、生物相容性和微加工兼容性等优势。

用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

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