用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

本实验的总体目标是制备纳米多孔金微米级图案，并验证其与细胞培养的相容性。首先通过制备模板或光刻掩模来实现这一目标；第二步是通过掩模共溅射金和银，以形成纳米多孔金的前驱合金图案。

接下来，将金银合金图案在硝酸中进行脱合金处理，以生成纳米多孔金涂层。最后一步是在纳米多孔金的微图案上培养细胞并进行免疫染色，最终结合图像分析，利用荧光显微镜和扫描电子显微镜对细胞与材料的相互作用进行定量分析。与碳纳米管等其他制备纳米结构涂层的方法相比，该技术的主要优势在于，纳米多孔金具有与微加工工艺兼容、有效比表面积高、易于通过基于晶片的化学方法进行功能化修饰、良好的电导率以及优异的生物相容性。

该方法可解答材料科学和生物工程领域的一些关键问题，例如材料纳米结构对电学、力学、生物学和化学性能的影响。尽管该方法能够揭示纳米结构对细胞形态的影响，还可应用于其他系统，如生物传感器、药物递送系统以及能量存储平台的开发。

开始此操作前，使用食人鱼溶液清洗1英寸×3英寸的显微镜载玻片和小型盖玻片：将小型盖玻片放入瓷制免疫染色槽中，并将染色槽连同显微镜载玻片一起浸入食人鱼溶液中。有关清洗步骤的详细信息，请参见文本方案。清洗完成后，将样品转移至结晶皿中，并用去离子水冲洗三分钟。

将样品置于无尘布上，使用氮气枪吹干，以形成毫米级图案。使用活检打孔器对250微米厚的硅胶弹性体片进行打孔。将处理后的弹性体片浸入70%异丙醇中清洗，随后用氮气枪吹干。

然后将冲孔片放在无尘布上，将清洁后的盖玻片对准模板，样品面朝向模板。将带有盖玻片的模板转移至载片上，以形成亚毫米级的图案。将一块清洁的显微镜载玻片置于旋转夹具上，并用氮气枪吹去任何微粒污染物。

将1.5毫升六甲基二硅烷移液至载玻片上。使用塑料移液管，通过依次以500转/分钟旋转5秒和1500转/分钟旋转30秒的方式均匀涂布六甲基二硅烷。完成后，将载玻片置于115摄氏度的加热板上烘烤7分钟，随后静置冷却5分钟。

接下来，将四毫升正性光刻胶滴加到玻璃载片上。通过以先前所述条件旋转载片来均匀涂布光刻胶。

将载玻片置于 115 摄氏度的加热板上烘烤 1.5 分钟，并在紫外光照射及烘烤后将其取出。通过将载玻片浸入正性光刻胶显影液中，溶解曝光后的光刻胶。

抗蚀剂显影至少 3.5 分钟。显影结束后，用去离子水彻底冲洗载玻片，并在光学显微镜下检查显影后的图形。接着，将样品装入可独立溅射沉积金、银和铬的溅射仪中。

在开始金属沉积前，先在25毫托的氩气处理气氛下以50瓦功率清洗样品90秒，随后在10毫托的氩气溅射环境中以300瓦功率溅射铬10分钟。然后以400瓦功率溅射金90秒，接着以银200瓦、金100瓦的功率共溅射金和银10分钟。关闭溅射源时，先关闭金溅射源，约10秒后再关闭银溅射源。

从溅射机中取出样品后，将样品放入约180毫升的正性光刻胶剥离液中，进行10次超声处理，每次超声22秒，两次超声之间间隔2分钟。

实验结束后，用去离子水冲洗样品，并用氮气枪吹干。在显微镜下检查金属图案。然后使用两把镊子从未涂覆光刻胶的样品上剥离弹性体掩模，以显露出沉积的金属。

在将小盖玻片浸入硝酸之前，先用10瓦的空气等离子体处理30秒。将显微镜载玻片浸入盛有70%硝酸的烧杯中，在55摄氏度下脱合金15分钟。脱合金完成后，依次将样品浸入盛有去离子水的烧杯中，每次冲洗三次。

将样品置于无尘布上，并使用氮气枪吹干。将加热板的温度调节至150至300摄氏度之间。然后缓慢将样品放置到加热表面，以尽量减少温度的突然变化。

五分钟后，将样品从加热板上取下冷却。将纳米多孔金样品放入聚苯乙烯培养皿中，并以10瓦的空气等离子体处理30秒。然后将样品转移至24孔组织培养板中。

向每个孔中加入 500 µL 完全培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中，直至接种细胞。在 T75 培养瓶中用培养基培养小鼠星形胶质细胞。

当细胞达到 70% 汇合度时，先移除旧的培养基，并用 PBS 洗涤细胞，然后进行传代。有关传代条件的详细信息，请参见文字版实验方案。从培养箱中取出培养板后，吸除孔中的废弃培养基，并将细胞接种到玻璃表面。

以每平方厘米25,000个细胞的密度接种盖玻片，终体积为1毫升。轻轻振荡培养板，确保细胞在样品表面均匀分布，待细胞准备好进行分析时，将培养板放入培养箱中。吸除孔中的废弃培养基，并用PBS洗涤两次。

将细胞在 PBS 中含 4% 多聚甲醛固定后，用 PBS 洗涤两次，再在 500 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中透化处理 5 分钟。重复用 PBS 洗涤两次，将细胞转移至洁净的孔中。每样本加入 80 微升染色液，用铝箔包裹避光孵育 20 分钟。

再次用 PBS 洗涤后，用含有 3 nM DPI 的 PBS 对细胞进行 5 分钟的复染。再用 PBS 洗涤细胞一次，将细胞浸入二甲苯，然后将细胞置于玻片上。用封片剂覆盖盖玻片，并用透明指甲油封边。

使用扫描电子显微镜，在10千伏电子能量下以50,000倍放大倍数，对纳米多孔金表面进行观察。随后，使用倒置荧光显微镜，在10倍放大倍数下结合适当的滤光立方体，对样品不同位置的复合细胞图像进行采集。在ImageJ中打开图像，将图像拆分为各个独立的通道。

将它们转换为八位。减去背景，并通过中值滤波进行平滑处理。然后手动调整阈值，以突出显示孔隙、细胞体和细胞核。

使用分水岭命令分离合并的孔隙或细胞。设置颗粒分析参数，并执行命令以提取颗粒数量、颗粒平均面积和颗粒覆盖百分比。最后，修改包含的宏文件，以对多幅图像进行批量分析。

此处展示了金属沉积图案在去合金化前后颜色的变化。银白色外观是由于合金化后富含银的合金成分所致。薄膜则呈现出明显的橙棕色色调。

此处展示的是通过光刻技术产生的精细结构。金属的图案化。通过热处理纳米多孔金薄膜，可获得不同的孔洞形貌。

横截面图像可以揭示薄膜在厚度方向上是否发生了均匀的脱合金化。扫描电子显微镜图像可分割为二值图像，以确定孔隙的尺寸和面积占比。生成该结果的代码可从 JoVE 网站页面下载。

图中显示了在纳米多孔金表面培养的贴壁小鼠星形胶质细胞的代表性荧光图像。该图像的各个通道可被分离和分割，以生成用于分析细胞与材料相互作用的二值图像。分割后的细胞骨架图像可用于定量细胞面积和表面覆盖率。

尽管分割后的细胞核图像可用于细胞计数，但生成这些结果的代码可从 JoVE 网站下载。此处展示的是纳米多孔金结构制备过程中常见失败情况的可视化总结，包括聚氧乙烯（PO）薄膜附着力差、缺乏孔隙结构以及过度热处理等问题。

按照此实验步骤，还可结合森林显微镜下的电化学表征、细胞裂解和PCR等方法，进一步探究纳米结构对细胞黏附和基因表达的影响等其他科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备纳米孔金图案，并通过显微镜图像的数字分析定量评估其与细胞的相互作用。结果。请注意，操作硝酸、硫酸和过氧化氢具有极高的危险性，进行该实验时必须采取充分的预防措施，包括穿戴个人防护装备。