使用自动化三维追踪系统记录成年斑马鱼个体及鱼群行为

本实验的总体目标是研究斑马鱼或其他水生动物的三维运动模式，并分析其运动学、空间及社会行为特征。该方法可用于检测由基因突变或化学及环境因素引起的异常行为。该目标首先通过系统校准实现，同时校正由折射引起的显著图像畸变。

第二步是从至少两个不同角度同时以相对较高的时间分辨率记录视频帧。接下来，软件会重建鱼类的运动轨迹。通过应用先进的算法来减少噪声的影响，并在发生遮挡或聚集时推断鱼类的位置。

最后一步是分析数据，并对速度加速度、转向角、观察容器中的水平和垂直分布、个体间距离以及其他感兴趣的参数进行统计分析。最终，高速校准的三维追踪技术可用于研究突变型斑马鱼的行为缺陷，以及药物对多种行为系统的影响。在药物发现方面，该系统的一个优势在于能够研究鱼类在三维空间中的行为。

这一点非常重要，因为鱼类在自然状态下会在三个维度中移动，当同时记录多条鱼的行为时，二维记录在研究群体空间构型时可能会产生严重误导。该系统的另一个优势在于能够校正光线折射效应，若不进行校正，可能会导致显著的测量误差。在当前配置下，盛放斑马鱼的观察容器被放置在观察室中。

该装置还包含一个摄像头、一面悬挂在容器上方约45度角的镜子以及LED灯条。在开始录制前，需对系统进行校准，以确定容器壁和水面的位置，以及录制画面的缩放系数，同时需校正光线从水进入空气时因折射所产生的误差。校准完成后，应使用模拟鱼进行一次测试运行。

如果镜片或摄像头的位置偏移，或出现追踪问题时，应进行重新校准。开始记录前，将装水至标记线处的观察容器放入观察室中，容器的脚应插入对准孔内。

将容器摆放至其半透明或不透明的壁面朝向摄像头观察方向的远端和右侧。接着，打开隔间内的灯光，然后将鱼放入容器中并关闭窗帘。打开记录模块，容器的正面和顶面图像将显示在屏幕上。

最初获取的图像可能并不理想，因此可能需要进行一些调整，以获得斑马鱼与背景之间足够的对比度。要调整图像，请选择相机控制，然后在打开的常规设置窗口中，取消选中此处所示的复选框，再调整快门速度和增益，使图像不会过曝。接下来，在相机控制窗口的左侧，选择白平衡颜色，在新弹出的窗口中取消选中“自动”选项，并调节红色和蓝色数值，以在正面和顶视图中均获得最佳的颜色对比度。

完成调整后，可能需要进行多次调整。从记录模块的主菜单中选择数据位置，以创建或选择一个文件夹。每次记录应拥有其独立的文件夹，该文件夹应为实验文件夹的子文件夹。

现在按下开始录制，并输入以分钟为单位的录制时长整数，然后按确定，实验录制会话将开始。录制完成后，将校准文件夹中的动物容器数据和对应数据子文件夹复制并粘贴到录制过程中先前创建的文件夹中。要开始路径重建，请打开软件的轨迹模块，然后按数据位置以选择使用录制模块创建的文件夹。

接下来，先按下系统设置按钮以打开参数窗口，调整顶部和底部视图的颜色阈值，建议起始值为1000。然后，选择顶部和底部视图的尺寸阈值。

对于中等大小的斑马鱼，建议的初始尺寸为10；对于较大的鱼使用20，较小的鱼则使用5。这些阈值越高，软件检测到噪声的可能性就越低。然而，若数值过高，则可能无法检测到鱼体。

在实验的后续阶段，可能需要重新调整这些阈值。对于上限尺寸阈值，通常设置为3000即可。而对于特定长度，保持预设值220不变。

鱼的数量是指观察箱中鱼的数量。最大点数是指总帧数，记录或记住此数值，然后按“确定”。接着选择“获取背景”。

下一个窗口将提示填写“从”和“至”两个字段。加载背景后，使用鼠标调整三个红色方框，这些方框标示了软件用于寻找鱼类的区域。将左侧的方框调至最小。

由于侧视图仅用于校准，现在请按下“开始生成轨迹”按钮，路径重建将随即启动。理想情况下，标签应放置在鱼的图像上；如果标签经常放置错误，请打开信息窗口。在此我们看到一个理想情况，即仅能看到鱼的轮廓。

若噪声过多，请在主菜单中按停止，然后选择新的颜色和尺寸阈值。同时，检查红色框是否可略微缩小。例如，在顶部，为排除水流产生的噪声，请观察3D屏幕上的轨迹。

通过鼠标右键点击，研究人员可以选择对三维构型进行旋转或平移。要开始数据处理，请打开数据处理模块，在工具栏上选择项目，然后从下拉菜单中选择新建并输入实验名称。接下来，选择编辑项目。

然后添加到项目，接着创建新组，并填写实验组名称。现在在右侧窗口中选择该实验组。注意工具栏将发生变化。

选择编辑组，然后添加到组，再添加新测量。这将打开一个浏览器窗口。接着，打开录制期间创建的文件夹，并选择其子文件夹“trajectories”，然后选择平滑化点文件。

在本示例中，A 组加载了六个文件，B 组加载了四个文件。开始分析时，选择右侧窗口中经过点平滑处理的文件，然后从下拉菜单中选择数据处理和单值终点。

例如，选择持续时间冻结。此时将弹出一个窗口，用于通过速度阈值和持续时间阈值来设定冻结参数，以帮助您熟悉该程序。也可以尝试其他示例，如移动距离深度分布，该功能可用于确定深度层级的数量和爆发频率。

选择该选项后，系统将在此上下文中使用默认阈值对约 200 个端点进行批量处理。默认值表示已设置分隔符。例如，当前深度分布按三个深度层级进行计算，角分布按四个区段进行计算。

生成参数后，将打开一个新窗口，提示输入要创建的文件的保存位置和文件名。这些数据将以 CSV 格式保存，并可导入其他软件中。此处，图 A 显示了对照组的一个典型示例图像。

斑马鱼，而图B显示了在上午记录时段内用MK 801处理的斑马鱼的典型示例帧。请注意，对照组斑马鱼靠近底部且彼此靠近；相比之下，经MK 801处理的斑马鱼则靠近顶部，并彼此相距较远地游动。

此处展示了对照组斑马鱼和经10微摩尔MK 801处理的斑马鱼在上午和下午两个时段的两条代表性运动轨迹。图中显示了对照组和经10微摩尔MK 801处理的斑马鱼在这两个时段的平均社会距离，此处还展示了两组个体间平均距离随时间变化的时间线。

在图A中，我们看到斑马鱼在上午时段于10个相等水深层次中的分布情况，而在图B中则是下午时段的分布情况。此处展示了实验组在四个径向区域中的时间分布。插图显示了这些区域从中心到外围的位置，此处我们还看到实验组在四个象限中的时间分布。

插图显示了象限的位置。双线表示白色墙壁，单线表示透明墙壁。摄像头位于插图左侧，靠近第一和第四象限。

黑色星号表示上午组间的比较，灰色星号表示下午组间的比较。最后，此处展示了斑马鱼在上午和下午各时段移动距离的 X、Y、Z 分量。数据以均值和标准误表示。

使用该系统时，请记住，数据质量完全取决于记录效果，因此务必确保系统经过良好校准，并且相机设置处于最佳状态。其余操作较为简单，只需熟悉各个步骤即可。