Name: 谷氨酸和GABA快速微离子导入:一个有用的工具，调查突触整合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习快速微离子导入技术，用于研究神经元树突后信号整合机制。该方法利用谷氨酸和GABA精确操控突触输入，帮助神经科学家深入理解神经递质系统相互作用及神经元输出调控原理。

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感谢Hans Reiner Polder、Martin Fuhrmann和Walker Jackson对稿件的仔细审阅。作者获得的资金支持来自北莱茵-威斯特法伦州研究部（MIWF）（S.R.）、德国联邦教育与研究部项目管理机构（BMBF-Projekträger）DLR神经科学计算领域的美德合作项目（CRCNS；S.R.）、神经退行性疾病卓越中心（COEN；S.R.）以及波恩大学校内资助计划（BONFOR；S.R.）。

1. 系统要求
<ol>
	<li>显微镜系统：良好的树突可视化至关重要。如有条件，应使用双光子激光扫描显微镜系统。在本实验中，我们使用了德国比勒费尔德LaVision Biotec公司的TRIM Scope II系统，或美国威斯康星州麦迪逊Prairie Technologies公司的Ultima IV系统，配备钛宝石超快脉冲激光器（Chameleon Ultra II，Coherent）和高数值孔径物镜（60倍，0.9 NA，Olympus），用于观察通过膜片钳电极将荧光染料灌注至神经元后标记的树突。尽管双光子扫描被认为光损伤较轻，但仍应尽可能降低激光功率（组织处低于8 mW）和驻留时间（低于1 μsec）。</li>
	<li>另一种可能性是将宽场荧光光源（LED 或荧光灯）与图像采集同步触发，以尽可能缩短曝光时间。我们在配备 Dodt 反差红外照明装置（TILLPhotonics，Gräfelfing，德国）的蔡司 Axioskop 2 FS 直立显微镜上，使用了带有集成光源的单色器（TILLPhotonics，Gräfelfing，德国）。在我们的实验中，曝光时间通常为 10 毫秒，最长不超过 30 毫秒。</li>
	<li>使用快速微离子电渗放大器， 例如 一个双通道微电泳系统MVCS-C-02（npi electronic，Tamm，德国），具备快速电容补偿功能。微电泳微电极尖端精细，电阻为25–100 MΩ（关键取决于尖端尺寸和移液管形状），只有在电泳放大器的电容补偿被最优调节时，才能实现快速上升时间。这种快速补偿对于向电泳移液管施加持续时间短、上升迅速（亚毫秒级）的电流脉冲至关重要，从而实现神经递质在小于1 μm的微小区域内的高空间分辨率释放。13离子电渗仪放大器还可从其他多家公司获得，但这些设备尚未在我们的实验室中进行测试。据我们所知，这些设备未配备电容补偿电路。</li>
</ol>
2. 准备溶液
<ol>
	<li>根据实验设计的需要配制人工脑脊液（ACSF）和细胞内液。细胞内液中唯一必需添加的成分为红色或绿色荧光染料。例如 50 至 200 μM Alexa Fluor 488 或 594 肼（Invitrogen），具体浓度取决于光学设备。以下为人工脑脊液（ACSF）的示例蔗糖 用于解剖的溶液（单位：mM）：60 NaCl，100 蔗糖，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，1 CaCl2，5 MgCl2，20 葡萄糖；用于膜片钳实验的正常人工脑脊液（ACSF）溶液（单位：mM）：125 NaCl，3 KCl，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3, 2.6 CaCl2，1.3 MgCl215 葡萄糖</li>
	<li>碳合（95% O₂ + 5% CO₂）2，5% CO2所有细胞外溶液需持续更换。</li>
	<li>配制内液，例如（单位为 mM）：140 K-葡萄糖酸盐、7 KCl、5 HEPES 酸、0.5 MgCl₂2，5 磷酸肌酸，0.16 EGTA；含 50 - 200 μM Alexa 488。</li>
	<li>对于谷氨酸微电泳，配制含150 mM谷氨酸的溶液，并用NaOH调节pH至7.0。加入50–200 μM Alexa Fluor 488或594肼（Invitrogen）以用于可视化。</li>
	<li>配制用于离子电渗的GABA溶液：制备1 M GABA溶液，并用HCl调节pH至5。15在此pH值下，GABA带电荷，方可使用离子电渗法施加。请注意，溶液喷出至细胞外空间时其低pH值可能影响GABA本身的传递 16,17. 
	避光保存GABA溶液，并经常配制新鲜的GABA储备液，因为存放时间较长的溶液可能会失去活性。</li>
	<li>如果难以观察到GABA能事件，可采用高Cl⁻- 驱动力内灌注液，例如省略KCl，可能有助于观察GABA能事件，以确认GABA离子电泳是否有效；然而，在研究突触整合时，建议采用生理性的驱动力。对于小GABA能事件的一般性检测，可参考如下方案： 图8C 可以提供帮助。</li>
</ol>
3. 拉制并测试离子电渗移液管
<ol>
	<li>通常情况下，制备合适的微电极可能是实现可控神经递质离子电泳最关键的步骤。在细胞培养中使用离子电泳时，可以拉制出非常细的电极，类似于尖锐的微电极10。然而，在急性脑片的膜片钳实验中，这些极细的电极在以一定角度插入组织时容易在脑片表面发生弯曲，从而无法到达更深部的树突。</li>
	<li>因此，应拉制尖端非常小的电极，以确保无神经递质泄漏，同时尖端仍需具备足够的刚性以穿透组织（图2）。例如，可使用150 GB F 8P型玻璃毛细管（Science Products，Hofheim，德国）和水平拉制仪（如DMZ-Universal Puller，Zeitz-Instruments GmbH，Martinsried，德国；或P-97 Puller，Sutter Instrument Company，Novato，CA），通过多步拉制程序获得较小的开口，同时形成短锥度且角度较陡的结构（图2和表2）。</li>
	<li>也可使用石英玻璃毛细管来拉制离子电泳电极10。此类电极据称具有更优的机械性能和更高的可靠性，但需要专用的激光拉制仪。不过，使用常规用于拉制膜片钳电极的玻璃毛细管也能获得良好的效果。</li>
	<li>首次使用前，应在无组织的灌流槽中测试电极的性能和阻抗，以避免谷氨酸泄漏对组织造成损伤。</li>
	<li>正确设置离子电泳放大器。然后将电极填充含神经递质和染料的溶液，并将其置入浴液（ACSF）中。</li>
	<li>补偿电容（图3）。通常，越尖锐的电极其电容越高，高于较钝的电极。</li>
	<li>检查电极阻抗：本实验所用的微离子电泳放大器内置有测量电极阻抗的功能。它可发出短暂的矩形测试脉冲，可通过标准示波器或连接计算机采集软件的A/D板进行监测。根据电极形状和尖端大小，其阻抗应在25–90 MΩ之间。</li>
	<li>使用60X或40X水浸物镜聚焦电极尖端，并切换至荧光成像模式，若条件允许，进行放大观察。若发现荧光染料从电极尖端泄漏，应施加微弱的正向电流（对于谷氨酸）或负向电流（对于GABA，图4）（&lt;0.02 μA）以抑制泄漏。若此方法无法消除泄漏，则更换电极。</li>
	<li>施加较强的阶跃电流或使用手动触发功能，并在荧光图像中观察电极尖端，以确认溶液能否从电极中喷出。如前所述，电流脉冲的极性取决于待喷出分子的电荷性质：喷出谷氨酸需使用负向电流，而喷出GABA则需使用正向电流（图4）。</li>
	<li>若电极内存在阻碍染料和递质喷出的气泡，可通过多次施加高强喷出电流予以清除。</li>
	<li>综上，若未观察到明显泄漏且测试喷出成功，则进行电容补偿并开始实验。</li>
	<li>注意：由于电容补偿是通过反馈电路实现的，若过度补偿，该电路可能出现超调或振荡。因此应轻柔调节电容补偿旋钮。</li>
	<li>根据拉制仪的稳定性，有时需不时调整拉制参数，因为灯丝特性可能发生变化。然而，一旦获得理想的电极参数，该设置可在数天内持续使用。因此，实验结束后应将离子电泳电极保存于密闭容器中，避免尖端受损。</li>
	<li>下次实验时，用神经递质溶液重新填充电极，施加数次强喷出脉冲以清洁尖端，然后检查其性能（例如阻抗）是否发生显著变化。随后进行电容补偿并再次使用该电极。切勿使用同一根电极填充不同的神经递质溶液。</li>
</ol>
4. 准备脑切片
<ol>
	<li>若首次使用微电泳法，务必在建立可靠可用的拉制程序后，再制备脑片。</li>
	<li>麻醉和断头操作应遵循所在机构或当地主管部门的动物护理指南。</li>
	<li>取出脑组织后，立即将其转移至冰冻的含蔗糖人工脑脊液（ACSFsucrose）中（见方案 2.1）。</li>
	<li>将目标脑区切成适当厚度的脑片（例如 300 μm）。</li>
	<li>将脑片在 35 °C 的 ACSFsucrose 中孵育 30 分钟，随后转移至含正常 ACSF 的浸没式储存室中，并在室温下保存。</li>
	<li>在整个制备过程和实验期间，使用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体（碳合气）对脑片周围的 ACSF 进行持续通气。</li>
</ol>
5. 建立全细胞记录
<ol>
	<li>在建立全细胞模式前，应先将离子电泳移液管置于靠近脑片表面的位置，以避免在全细胞模式建立后进行长时间的定位操作。</li>
	<li>使用低电阻膜片电极（3 - 5 mΩ），用含染料的胞内液填充，并对电极施加正压（30 - 60 mbar）。</li>
	<li>在视觉引导下（红外微分干涉对比或双光子梯度对比成像）进入浴液并接近细胞。</li>
	<li>使用测试脉冲监测移液管电阻（例如 -10 mV，20 毫秒）的电压钳模式下进行。接触组织时，校正偏移电位。</li>
	<li>接近细胞，轻轻将移液管尖端推入细胞，直至清晰可见“凹陷”。立即释放移液管压力，施加40–60 mbar的负压，并将膜电位切换至-65 mV。</li>
	<li>当保持电流达到低于 100 pA 的值时，释放负压。</li>
	<li>在形成吉格封接（电阻）后 &gt;1 GΩ）时，通过短暂而强烈的吸力作用于移液管，或短暂过度补偿电容补偿电路，以击穿细胞膜。</li>
	<li>根据实验设计所需的模式（电压钳或电流钳），进行相应的补偿。</li>
	<li>开始将离子电泳移液管移至最终位置。如果需要更详细地了解如何成功进行膜片钳记录，可参考几份优秀的操作指南18,19.</li>
</ol>
6. 放置离子电渗移液管并产生突触后离子电渗电位
<ol>
	<li>通常，可根据实验需求在特定位置诱发离子电泳事件，例如，在树突棘处进行谷氨酸微离子电泳，在树突干、胞体或轴突始段处进行 GABA 微离子电泳。</li>
	<li>将电极移近细胞至约 1 μm 距离，但不要接触细胞。到达目标位置后，关键是要确保无神经递质泄漏，并正确补偿电极电容。</li>
	<li>若使用充满谷氨酸的离子电泳电极接近细胞时引起可检测到的膜电位去极化，应尽可能调整保持电流，或更换电极。</li>
	<li>施加短暂的负向电流脉冲，从零开始并系统性增加电流（例如，0.1 - 0.4 msec，0.01 - 1 μA 脉冲）。这有助于确定在特定实验设置下，离子电泳电流在何种范围内可诱发所需的反应。</li>
	<li>若未检测到反应，将电极提起数百微米，并施加强的排出电流（&gt;0.1 μA）以清洁尖端。重新调整电容补偿，再次接近细胞并重试。</li>
	<li>若仍无反应，可减小保持电流。调节旋钮时需格外小心，因为此操作可能导致神经递质不受控释放。因此，应持续监测记录，以检测膜电位的相应变化。</li>
	<li>若难以检测 GABA 能事件，可使用产生高 Cl- 驱动力的胞内溶液成分。为此，可降低电极液中的 Cl- 浓度（见方案第 2.6 节）。由于驱动力增强，这将在静息膜电位下产生更大的 GABA 能事件。</li>
	<li>或者，可注入长时程电流阶跃，使膜电位从 -100 mV 变化至 -48 mV（图 8C）。采用此方案可在超极化电位下增大 Cl- 驱动力，从而引起去极化的 GABA 反应。</li>
	<li>也可使用阶跃电流注入方案来测定诱发事件的反转电位，以帮助判断事件的 GABA 能性质。GABA 的泄漏比谷氨酸更难检测。在此情况下，当接近含 GABA 的电极时，持续监测输入电阻可能有所帮助。若输入电阻下降，可增加保持电流或更换电极。</li>
	<li>对于谷氨酸离子电泳的对照实验，我们建议进行 Ca2+ 成像实验，使用 200 μM OGB-1 且电极液中不加 EGTA，以可视化可能由泄漏谷氨酸引起的局部钙离子内流。</li>
	<li>通常，为获得稳定的反应，必须确保电极具有良好的机械稳定性，以避免随时间发生漂移。温度变化可能引起漂移，因此建议至少在测量前半小时开启设备，以避免热漂移。务必使用良好的电极夹持器密封圈，并确保电极尖端固定牢固。夹持器本身可用聚四氟乙烯胶带进一步固定；此外，确保前置放大器或操纵器的电缆无张力，因为这也可能是漂移的来源。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此，我们介绍如何应用快速微离子电泳技术递送神经递质，以研究树突上的突触整合。该技术已成功用于探究不同脑区中的谷氨酸能和GABA能突触传递 体外 和 体内9,20-22微离子电渗法已应用超过60年，但在早期主要仅用于在较慢或中等时间尺度上局部施加神经递质和药物23 或用于向细胞内显微注射物质24.
自从引入配备了针对高阻抗电极的快速电容补偿功能的放大器以来，微离子电渗技术成为研究树突整合的一种特别有用的工具10,11。由于这一改进，现已能够施加短暂的矩形离子电渗电流，从而产生更真实地模拟突触事件时间进程的突触后反应10,25。
在建立微离子电渗技术时，需要应对哪些技术要求和难点？需要使用一种离子电渗放大器，能够补偿精细离子电渗移液管的高电容。如果需要在使用高阻抗微电极的同时实现高速操作，则正确调节电容补偿至关重要。未补偿的杂散电容会由仪器提供的离子电渗电流充电，从而减慢药物施加速度。...

中枢神经系统中的神经元在其细长且分支状的树突过程中接收多种突触输入1。在这些树突过程中，大多数兴奋性输入由谷氨酸能突触介导。这些突触可以以空间分散的方式被激活，导致兴奋性突触后电位（EPSP）的线性整合。当突触在树突上同时且在空间上邻近地被激活时，这些兴奋性输入可发生超线性整合，并产生树突尖峰2-5。
此外，兴奋性输入的整合依赖于输入在树突树上的位置。由于电缆过滤效应，到达远端树突簇区域的信号比近端输入衰减得更为显著6。在海马体中，远端树突簇接收的输入来自与近端树突不同的脑区7。因此，一个引人关注的问题是：不同树突区室如何处理突触输入，以及树突整合是否以不同方式调控这些分层输入对神经元放电的影响。
不仅树突的功能特性、形态特征以及输入的位置和聚集方式会影响兴奋性输入的树突整合，来自GABA能末梢的额外抑制性输入也在很大程度上决定了谷氨酸能突触的效能8,9。这些突触整合的不同方面可通过神经递质微离子电泳技术进行理想研究，该技术可将不同神经递质精确施加于树突特定区域。本文展示了如何成功建立谷氨酸和GABA的微离子电泳，以研究神经元中的信号整合。
在此应用中，使用尖端精细且电阻较高的移液管，内充高浓度的神经递质溶液。这些移液管被放置在细胞外膜附近，即神经递质受体所在的位置。需要对树突分支进行良好的可视化观察，这通常通过灌注荧光染料来实现，染料经由膜片钳移液管导入。随后施加一个极短的（&lt;1 毫秒）电流脉冲（范围为 10 - 100 nA），以推出带电的神经递质分子。通过这些短脉冲并结合有效的电容补偿，可高时空精度地诱发突触后电位或电流，从而精确确定兴奋性输入的位置。谷氨酸微离子电渗法可在特定半径内激活突触，该范围小于 6 μm（如图19所示），但也有可能实现单个突触的分辨率10-12。
Heine, M.，等 研究表明，快速微离子电渗法的空间分辨率甚至可调节至0.5 μm以下的点状区域，小于通常通过双光子解笼谷氨酸所达到的点状区域尺寸13。利用快速微离子电渗法，可轻松使用两个或更多离子电渗移液管，并将其放置于树突树上不同甚至相距较远的位置。通过这种方式，可研究兴奋性事件的整合，包括来自不同通路的兴奋性事件。同时使用填充谷氨酸和GABA的离子电渗移液管也是可行的。借此，可研究GABA能抑制在相对于兴奋性输入不同位置（通路上或通路外抑制）的作用。此外，通过GABA离子电渗法，还可研究靶向特定神经元区域（如远端树突、胞体或轴突）的中间神经元介导的抑制作用14。在培养的神经元中，快速微离子电渗法为深入研究单个突触分布以及神经元突触传递的基本特征提供了机会10,11。
本文详细演示如何建立用于急性脑片的谷氨酸和GABA离子电泳技术，该技术可用于研究兴奋性和抑制性输入在输入位置、输入强度和时间上的突触整合，既可单独研究，也可探究其相互作用。我们将指出该技术的优势与局限性，并介绍如何成功进行故障排除。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>双光子激光扫描显微镜（TRIM Scope II）和Ultima IV，Prairie Technologies，美国威斯康星州麦迪逊</td><td>LaVision Biotec，比勒费尔德，德国</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>双光子激光扫描显微镜 Ultima IV</td><td>美国威斯康星州麦迪逊草原科技公司</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>钛宝石超快脉冲激光器</td><td>Chameleon Ultra II，Coherent</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60倍物镜，数值孔径0.9</td><td>Olympus</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔡司 Axioskop 2 FS 正置显微镜</td><td>TILLPhotonics, Gr&amp;auml;费尔芬，德国</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>单色仪</td><td>TILLPhotonics，Gr&amp;auml;费尔芬，德国</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微离子电渗系统 MVCS-02</td><td>NPI Electronics，德国塔姆</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sutter拉针仪P-97</td><td>Sutter Instrument Company，诺瓦托，加利福尼亚州</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃细丝（150 GB F 8P）</td><td>科学产品公司，德国霍夫海姆</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 肼</td><td>Molecular Probes life technologies</td><td>A-10436</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>分子探针生命科技</td><td>A-10438</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6297</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES-酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8415</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5835</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>默克</td><td>1.09137.1000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>默克</td><td>1.09108.1000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

快速微离子导入谷氨酸和gaba：研究突触整合的有用工具

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

神经科学的一个基本研究兴趣是理解兴奋性和抑制性输入如何在结构极为复杂的树突树上进行整合，最终导致神经元在轴突处产生动作电位输出。目前，特定突触输入的各种空间和时间参数对神经元输出的影响正在被深入研究，例如 树突输入的随距离衰减效应、空间上分离的输入之间的位置依赖性相互作用、GABA能抑制对兴奋性整合的影响、线性与非线性整合模式，以及更多其他机制。
通过快速微离子电泳递送谷氨酸和GABA，可以精确研究谷氨酸能兴奋与GABA能抑制在空间和时间上的整合特性。关键技术要求是使用可触发的荧光灯、发光二极管（LED）或双光子扫描显微镜，以在不造成组织显著光损伤的情况下观察树突分支。此外，拥有一个能够对高阻抗微电极进行快速电容补偿的微离子电泳放大器也极为重要。另一个关键点是在实验过程中微电极不得非特异性地释放任何神经递质。
一旦建立，该技术将提供可靠且可重复的信号，具有高神经递质特异性和位置特异性。与谷氨酸和GABA解笼技术相比，快速离子电渗法允许同时使用这两种递质，且可在远离彼此的位置施加，不受视野范围的限制。与轴突的局灶性电刺激相比，该方法也具有优势：通过微离子电渗法，输入位点的位置是明确已知的，并且可以确保仅释放感兴趣的神经递质。然而需要注意的是，微离子电渗法仅激活突触后成分，无法解析神经递质释放的突触前特性。本文中，我们演示如何在脑片实验中建立微离子电渗法。

确定离子电泳空间扩散范围的一种简单方法是，在保持谷氨酸释放量恒定的同时，逐步将离子电泳移液管从树突回撤。我们发现，微离子电泳刺激的空间范围直径约为 12 μm（图 1 显示半径）。离子电泳在组织中的可应用深度取决于移液管的刚性。然而，本实验所用的脑片实验所需离子电泳移液管（图 2）并不限制穿刺深度；真正限制因素是光学系统以及脑片深层分辨率的下降。为获得高质量的记录，关键在于移液管中不能有递质泄漏。对于谷氨酸而言，若在移液管尖端接近树突时出现突然的去极化，或记录基线突然变得不稳定，则可判断存在泄漏（图 5）。在建立稳定记录后，该技术可在树突树的任意位置诱发特定幅度的兴奋性突触后电位（EPSP）、树突尖峰或动作电位（图 6）。通过快速微离子电泳施加谷氨酸，可研究 EPSP 的特性、其传播与叠加效应，甚至可在不同且相距较远的位置同时进行研究（图 7）。可通过将另一根离子电泳移液管填充高浓度 GABA 溶液（见：方案第 2 节）并施加正向喷射电流，单独或同时诱发 GABA 能事...

本文中，我们介绍了一种快速微离子电渗技术，用于以高空间和时间精度研究突触后信号的整合。

快速微离子导入谷氨酸和GABA：研究突触整合的有用工具

神经科学的一个基本研究兴趣是理解兴奋性和抑制性输入在神经元极其复杂的结构上的整合过程。

本实验的总体目标是理解输入信号在神经元树突树这一极为复杂的结构中的整合过程，该过程最终导致轴突处产生动作电位形式的神经元输出。该目标的实现首先需要制备合适的离子电泳微电极。第二步是对离子电泳微电极进行测试，并正确补偿其电容。接下来，建立全细胞记录模式。最后一步是接近树突，并在记录细胞中诱发突触后电位。最终，快速微离子电泳技术可用于研究多个输入信号的整合过程，这些信号也可来源于不同的神经递质系统。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如抑制性和兴奋性输入如何整合，以及在何种条件下发生整合，从而产生神经元输出。首先，拉制尖端非常细小的移液管，用于精确控制神经递质的离子电泳。使用水平或垂直的拉针仪，通过多次拉制步骤可获得细小的尖端。然而，尖端仍需具有足够的刚性以刺入组织。接下来，在无组织的灌流槽中设置离子电渗放大器，以检测移液管的性能。用含有神经递质和染料的溶液填充移液管，然后将其放入人工脑脊液（A CSF）中。随后使用放大器补偿电容。通常，在正确补偿电容后，尖锐的移液管比钝的移液管具有更高的电容。使用微离子电渗放大器的内置功能检查移液管的电阻。移液管的电阻应在25至90兆欧之间。随后，使用60倍或40倍水浸物镜聚焦于移液管尖端，然后切换至荧光成像。如果荧光染料D从移液管尖端泄漏，对于谷氨酸采用较小的正向保持电流，而对于GABA则采用负向保持电流。如果仍无法消除泄漏，请更换移液管。接下来，向移液管施加一个较强的阶跃电流，或使用手动触发功能。监测移液管尖端的荧光图像，观察溶液是否能够被推出。若无明显泄漏，且测试喷出成功，则检查电容补偿，并开始实验。通常，可以根据实验需求在特定位置诱发离子电泳事件。例如，在树突棘处进行谷氨酸微电泳，或在树突干、胞体或轴突起始段进行γ-氨基丁酸（GABA）微电泳。建立全细胞记录构型后，将离子电泳微电极尖端置于距离目标树突或其他感兴趣区约一微米的位置。确保无神经递质泄漏，并正确补偿移液管和电容。若使用充满谷氨酸的离子电渗移液管接近细胞时引起可检测到的膜去极化，则可能存在谷氨酸从移液管泄漏。尝试调整保留电流或更换离子电渗移液管。接下来，从零开始对用于谷氨酸电流的离子电渗移液管施加短暂的负脉冲，并系统地增加电流。这有助于确定在特定实验条件下，离子电渗电流能够引发理想反应的范围。如果未检测到可识别的反应，将离子电渗移液管上提数百微米，并施加大于0.1 µA的强电流以清洁尖端。然后调整电容补偿。再次接近细胞并重试。如果仍然没有反应，尝试降低保持电流。然而，在降低保持电流时需格外小心，因为这可能导致神经递质的不受控释放。因此，必须持续监测记录结果，以检测膜电位的相应变化。若谷氨酸从移液管中泄漏，则应弃用该移液管，不得用于GABA微离子电泳。用新的移液管吸取GABA溶液。更换移液管中的递质时，确保推出电流的正确极性至关重要。对于GABA的推出，

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谷氨酸和GABA快速微离子导入：一个有用​​的工具，调查突触整合

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本视频展示了在小鼠脑切片中评估单个皮质-纹状体突触的谷氨酸释放与清除过程。通过电刺激促进突触处谷氨酸的释放。释放的谷氨酸会改变传感器蛋白的荧光信号，该荧光随时间逐渐衰减，从而反映谷氨酸的释放效率与清除能力。...

分析小鼠脑片中单个神经元突触的谷氨酸释放与清除

在本视频中，将一个涂有谷氨酸氧化酶的多电极阵列（MEA）植入麻醉小鼠的脑组织中。将谷氨酸溶液注入细胞外空间，MEA...

体内实时谷氨酸监测：基于酶包被微电极阵列的技术

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我们描述了一种结合局灶性紫外光诱导激活神经活性化合物、全细胞膜片钳技术以及多光子成像的方法，用于在小鼠脑急性组织切片的海马神经元树突和树突棘中检测细胞内钠离子瞬变。...

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用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。...

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