斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

本实验的总体目标是对斑马鱼胚胎进行解剖和封片，以实现脊髓在显微镜下的最佳观察效果。首先通过显微解剖去除卵黄囊，第二步是清除卵黄残留物，并用移液器将胚胎转移至载玻片上。

接下来，用 Kim 擦纸小心去除多余的液体，然后加入封片剂。最后一步是用胚胎操作针将胚胎在载玻片上排列整齐，随后加盖盖玻片。最终通过荧光或明场显微镜观察，以显示有丝分裂后细胞体的分布以及正在发育的轴突的走向。

该方法有助于解答神经生物学领域的一些关键问题，例如，哪些机制负责图式形成、分化以及轴突导向。尽管该方法可为神经系统发育的多个方面提供深入见解，但它也可应用于其他组织，如正在发育的肌肉组织。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为在实验开始前需要在显微镜下进行解剖操作。

通过将移液器吸头粘接到废弃的移液管上，再将钓鱼线粘接到移液器吸头上来制作胚胎拨针。开始胚胎解剖时，将最多30个受精后24小时的斑马鱼胚胎放入盛有PBS的35毫米培养皿中。

在解剖显微镜下，用一对镊子固定胚胎的头部，同时用昆虫针将橡木移开。然后使用胚胎拨针将胚胎转移到培养皿中卵黄碎片较少的区域。接着，用玻璃巴斯德吸管吸取胚胎，尽量减少液体的吸入量。

然后用移液器轻柔地将最多21个胚胎转移至载玻片上。使用实验室擦拭纸小心吸去多余液体，注意避免触碰胚胎，随后向胚胎中加入一滴封片介质。接着，用胚胎拨针将胚胎侧向排列成两到三行。

现在，在盖玻片的每个角落涂抹少量凡士林。将盖玻片翻转，使涂有凡士林的一面朝下，然后将其覆盖在胚胎上方。凡士林的作用是防止因过度压紧而对胚胎造成损伤。

如有必要，使用20至100微升范围的移液器，轻轻敲击盖玻片的每个角落，直至封片剂接触到盖玻片。在盖玻片旁边添加更多的封片剂，并让其通过毛细作用渗入盖玻片下方。然后，使用实验室擦拭纸彻底清洁盖玻片周围区域。

切勿对盖玻片施加压力，因为这可能会损伤胚胎。当清洁彻底后，该区域应保持干燥，且无凡士林或封片介质残留。最后使用指甲油封闭盖玻片边缘。封片后，可观察到数个位于卵黄囊延伸区域上方的 HEMI 节段。

该图显示了斑马鱼胚胎脊髓腹侧的 NK X 6.1 表达情况。在受精后 24 小时，NK X 6.1 mRNA 大致分布在脊髓的腹侧半区。在前体细胞区域中，由于位于脊髓内侧的底板存在，前体细胞与有丝分裂后的细胞可被区分开来。

使用微分干涉差（DIC）光学观察。单个细胞清晰可辨，表达细胞与非表达细胞之间具有明确的边界。前体细胞的细胞周期退出伴随着基因表达的变化。

该图像显示了robo三在有丝分裂后神经元中的表达。robo受体家族是一类轴突导向受体，其表达可用于对有丝分裂后神经元进行准确定量。请注意，在这一更偏外侧的焦平面上，腹侧中缝和前体细胞区域并不明显。

采用共聚焦显微镜对 znp 进行免疫荧光成像，如图中侧向固定的胚胎所示，该方法可标记运动轴突。运动神经元在受精后24小时从脊髓腹侧发出，支配周围正在发育的肌肉组织。若操作熟练，正确实施该技术可在30分钟内完成。

在进行该操作时，重要的是要牢记通过精细的显微解剖来保持组织的完整性。观看本视频后，您应能够充分理解如何运用显微解剖技术去除斑马鱼胚胎的卵黄，以便进行封片和显微观察。