解剖和斑马鱼的胚胎横向安装:脊髓发展分析
February 28th, 2014
发育过程，如增殖，图案，分化和轴突导向可以很容易地模拟在斑马鱼的脊髓。在这篇文章中，我们描述了一个安装程序，斑马鱼的胚胎，从而优化了这些事件的可视化。
该程序的总体目标是解剖和安装斑马鱼胚胎，以实现脊髓的最佳显微镜可视化。这是通过首先解剖和取出橡木球来完成的。第二步是去除橡木碎片并将胚胎移液到载玻片上。
接下来，用 Kim 湿巾小心地去除多余的液体，然后添加封固剂。最后一步是用胚胎扑克将胚胎定位在载玻片上，然后应用盖玻片。最终，荧光或明场显微镜用于显示有丝分裂后细胞体的分布和发育轴突的轨迹。
这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，例如负责模式化、分化和轴突导向的机制是什么。虽然这种方法可以提供对神经系统发育的许多方面的见解，但它也可以应用于其他组织，例如发育中的肌肉。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在开始实验之前需要在显微镜下进行解剖。
通过将移液器吸头粘到过去的移液器上，然后将钓鱼线粘到移液器吸头上来制作胚胎扑克。要开始胚胎解剖，最多放置 30 个斑马鱼胚胎。受精后 24 小时放入装满 PBS 的 35 毫米培养皿中。
在解剖显微镜下，用一对镊子固定胚胎的头部，同时用昆虫针将橡树拉开。然后使用胚胎扑克将胚胎移动到培养皿中没有大量蛋黄碎片的部分。接下来，将胚胎吸入玻璃牧场移液器中，吸出尽可能少的液体。
然后轻轻地将多达 21 个胚胎移液到载玻片上。使用实验室湿巾小心吸走多余的液体，同时避免接触胚胎，然后在胚胎中加入一滴封固剂。接下来，使用胚胎扑克将胚胎的侧面定向成两到三行。
现在，在盖玻片的每个角落添加少许凡士林。转动盖玻片，使带有凡士林的一面朝下，然后将盖玻片放在胚胎的顶部。凡士林的作用是防止过度压缩对胚胎造成损害。
如有必要，使用 20 至 100 微升范围内的移液器轻轻敲击盖玻片的每个角落，直到封固介质接触到盖玻片。在盖玻片旁边添加更多封固剂，并让添加的介质从盖玻片下方芯吸。现在，使用实验室湿巾彻底清洁盖玻片周围。
不要对盖玻片施加压力，因为如果正确清洁，该区域干燥且没有凡士林或安装介质，这可能会损坏胚胎。最后用指甲油密封盖玻片的边缘。安装斑马鱼胚胎后，可以看到橡木囊延伸部分上方的几个 HEMI 片段。
该图显示了 NK X 6.1 在斑马鱼胚胎腹侧脊髓中的表达。NK X 6.1 mRNA 在受精后 24 小时大致分布在脊髓的腹侧半部。在祖细胞结构域内，由于存在位于脊髓内侧的底板，祖细胞与有丝分裂后细胞是不同的。
使用 DIC 光学元件查看。单个细胞清晰可区分，表达细胞和不表达细胞之间的明确界限很明显。祖细胞周期退出伴随着基因表达的变化。
该图显示了 robo three 在有丝分裂后神经元中的表达。robo 受体家族是轴突引导受体，其表达允许准确计数有丝分裂后神经元。请注意，底板和祖先区在这个更横向的焦平面中并不明显。
共聚焦显微镜用于对 znp one 免疫荧光成像，它标记运动轴突，如该侧向安装的胚胎所示。受精后 24 小时，运动神经元从腹侧离开脊髓，以支配周围发育中的肌肉组织。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 分钟内完成。
在尝试此程序时，重要的是要记住通过仔细的显微解剖来保持组织的完整性。看完这个视频，你应该对如何使用显微解剖技术去除斑马鱼胚胎的卵黄进行封片和显微镜观察有一个很好的了解。
概述
本文介绍了一种详细的程序，用于剥离和安装斑马鱼胚胎，以优化脊髓发育的可视化。该方法增强了对轴突引导和分化等关键神经生物学过程的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经生物学
- 发育生物学
- 显微技术
背景
- 斑马鱼胚胎对于模拟发育过程非常有价值。
- 理解脊髓发育对于神经生物学研究至关重要。
- 显微可视化技术对于研究细胞动力学至关重要。
- 解剖和安装技术需要精确以保持组织完整性。
研究目的
- 提供一种可靠的斑马鱼胚胎安装方法。
- 促进有丝分裂后细胞体和轴突轨迹的可视化。
- 增强对神经发育机制的理解。
使用的方法
- 显微解剖斑马鱼胚胎以去除卵黄。
- 用适当的介质将胚胎安装在载玻片上。
- 使用胚胎托盘在安装过程中进行定位。
- 使用荧光和明场显微镜进行可视化。
主要结果
- 成功可视化脊髓中的NKX6.1表达。
- 清晰区分祖细胞和有丝分裂后细胞。
- 通过robo3表达分析展示轴突引导。
- 使用共聚焦显微镜有效成像运动轴突。
结论
- 所描述的方法允许高效和有效的胚胎安装。
- 它提供了对脊髓发育和神经生物学的洞察。
- 掌握这种技术可以显著提高研究成果。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-fidelity visualization of zebrafish spinal cord development, supporting mechanistic studies of axon guidance and neuronal differentiation. By removing optical barriers such as yolk and somite tissue, it enhances reproducibility in neurobiological target validation workflows. The approach provides a scalable, standardized platform for phenotypic screening in early discovery, reducing biological noise in mechanistic de-risking efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to spinal cord patterning and axon guidance mechanisms.
- Operational Value: Preserves three-dimensional tissue architecture for consistent dorso-ventral and anterior-posterior analysis.
- Predictive Value: Supports functional target validation by visualizing post-mitotic cell bodies and axonal trajectories in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of protein expression (e.g., NKX6.1, ROBO3) for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of large numbers of synchronized embryos for high-content screening applications.
- Assay Readiness: Enables reliable compound evaluation through preserved somite tissue and clear microscopic visualization of neurodevelopmental processes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing a disease-relevant system for neurodevelopmental mechanism analysis.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in pathway elucidation through direct visualization of progenitor and post-mitotic populations.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling consistent, reproducible imaging of axon guidance and differentiation markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and biological de-risking prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of neurodevelopmental targets through direct tissue visualization.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility via standardized embryo mounting and orientation protocols.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence and bright field readouts that allow comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Provides continuity from discovery to preclinical work by preserving tissue integrity for longitudinal neurodevelopmental tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurobiological screening across multiple targets and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal cord development studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of zebrafish-based neurobiological assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on reproducible, high-resolution phenotypic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and microscopy to preserve tissue integrity during yolk removal.
- Dependent on precision instrumentation including dissecting microscopes, embryo pokers, and controlled pipetting tools.
- Necessitates cross-team standardization of mounting medium, orientation protocols, and imaging parameters.
- Adaptation considerations include model system variability in yolk size and tissue thickness across developmental stages.
- Practical limitations include the learning curve associated with microdissection under microscopy, particularly for novice users.
