一种用于小鼠肠神经前体细胞的定量细胞迁移检测方法

本实验的总体目标是定量评估不同生长因子存在条件下肠源性神经前体细胞的迁移潜能。首先分离带有荧光标记神经嵴细胞的小鼠胚胎小肠组织，随后使用振动切片机将小肠切成200微米厚的组织切片，以此实现上述目标。

接下来，将这些切片置于含有生长因子的胶原凝胶上进行孵育。最后一步是剥离切片，以暴露出下方迁移的细胞。最终，通过荧光显微镜观察胶原凝胶内迁移细胞的分布模式。

该方法有助于回答发育生物学中的一个关键问题，例如更深入地理解外周神经系统形成过程中各种信号通路之间的相互作用。在发现阴道栓后的第12天，处死雌鼠并取出子宫，将子宫放入盛有冰的玻璃培养皿中。用冰冷的PBS在解剖显微镜下沿各个蜕膜肿胀部位之间的横向切开子宫，以分离每个胚胎着床位点，并使用精细镊子去除子宫的肌层。

打开卵黄囊和羊膜以暴露胚胎。切断连接胚胎与卵黄囊的血管时需格外小心，因为这些血管与正在发育的肠管相互缠绕。接下来，将闭合的镊子插入暗红色肝脏上方的腹腔内，并使其张开。

这会在腹腔内形成一个横向开口。将打开的镊子向下拉向胚胎的后端，以完全打开腹腔。打开后，抓住肝脏后方的结缔组织，将内脏拉出。

注意不要损伤肠道。在结肠任意位置剪断，以分离肠道与其他胚胎组织。将尾部组织保留，以备后续使用。

小心地从盲肠开始分离结缔组织，然后继续分离肠道，注意不要损伤小肠前端。切除肝脏和胃，如果存在，同时切除肠系膜、肾嵴和生殖嵴。最后，通过切除盲肠、结肠以及残留的结缔组织，分离出小肠。

同前，注意不要划伤肠道。将小肠置于室温的PBS中，嵌入前放置时间应尽可能短。在颈部切断胚胎后，记录尾部体节的数量，以准确确定胚胎发育阶段。

在进行胚胎解剖之前，将1.5克琼脂糖溶于100毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并保持在50摄氏度。通过沿纵向切割一个2毫升微量离心管，切去约四分之一的管壁，制备包埋模具。将熔化的琼脂糖倒入模具中，冷却至仅微温即可。

准备就绪后，用镊子夹住肠道折叠的头端，缓慢地将其穿过琼脂，沿模具长度方向拉动。这有助于在琼脂凝固过程中保持肠道平直；一旦组织开始抵抗移动，即刻松开镊子，并始终注意记录肠道头端的方向。接着，将模具放入冰箱中冷却 2 至 3 分钟，使其完全凝固。

固定后，将琼脂糖块从模具中取出，并修剪两端多余的琼脂糖，切口应与肠管垂直。将琼脂糖块的头端粘附至切片机的金属载片上，并修去四周多余的琼脂糖。接着，将金属载片安装到振动切片机的样品腔中。

如有必要，调整载物台角度，使肠道尽可能保持垂直。在将切片刀下降至缓冲液表面下方几毫米之前，先用预冷的 PBS 覆盖样本。准备就绪后，对近端小肠进行厚度为 200 微米的横切。

确保每个农用切片包含完整的肠段。将新鲜切割的切片轻轻放置在预先准备好的胶原凝胶上。每个孔的中央放置一个切片，以利于神经嵴细胞从茄子中迁移出来，在孵育箱中孵育切片三天。

此后，用镊子轻轻将切片从胶原凝胶上取下，注意不要损伤下方的凝胶。为确保细胞迁移模式不受干扰，在后续的孵育和洗涤步骤中应避免直接接触胶原凝胶。首先，每孔加入500 µL 4% PFA，在室温下固定细胞1小时。

接下来，每孔加入500 µL DPI溶液，替换固定液，室温孵育10分钟。随后在室温下小心吸除DPI溶液，每孔用500 µL PBS洗涤三次，每次5分钟。最后，拍摄各孔中胶原凝胶内嵌的荧光细胞图像。

在此示例中，使用生长因子刺激表达GFP的肠神经嵴细胞的迁移。虚线表示肠组织块的大致尺寸和位置。在将组织块从凝胶中取出之前，发现经处理条件下迁移出肠组织块的表达GFP的细胞数量和扩散范围显著大于未处理条件。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过将肠组织切片孵育在含有生长因子的胶原凝胶上，来评估肠神经前体细胞的迁移潜能。