定量细胞迁移检测方法的鼠肠神经前体细胞
September 18th, 2013
我们提出了一个先体外后体内的细胞迁移测定法，允许在各种生长因子的存在下肠道神经嵴细胞迁移的潜在精确定量。
该程序的总体目标是量化在各种生长因子存在下肠道神经祖细胞的迁移潜力。这是通过首先解剖由荧光神经结痂细胞填充的小鼠胚胎小肠来实现的。第二步是使用振动切片机制作 200 微米厚的肠片。
接下来，将这些切片在含有生长因子的胶原蛋白凝胶上孵育。最后一步是剥开切片，露出下面的迁移细胞。最终，荧光显微镜用于显示胶原凝胶内迁移细胞的模式。
这种方法可以帮助回答发育生物学中的一个关键问题，例如更好地了解周围神经系统形成的各种信号通路之间的相互作用。发现阴道塞后 12 天，对雌性小鼠实施安乐死并取出子宫，将子宫放入装满冰块的玻璃培养皿中。冷 PBS 在单个子宫肿胀之间横向切割子宫，以在解剖显微镜下隔离每个胚胎植入部位，使用细镊子去除子宫的肌肉层。
打开内脏卵黄袋和羊膜，露出胚胎。切断血管时要小心，将胚胎连接到卵黄袋上，因为它们与发育中的肠道交织在一起。接下来，将闭合的镊子插入深红色肝脏正上方的腹腔中，让它们打开。
这会在腹腔中形成一个横向开口。将打开的镊子向下拉向胚胎的后端，以完全打开腹部。打开后，抓住肝脏后面的结缔组织，将内脏拉出。
注意不要弄破肠道。在任何位置切开结肠，以将内脏从胚胎的其余部分释放出来。将尾部保留以备后用。
从盲肠中梳理出结缔组织，然后小心地梳理肠道，不要将它们缠绕在小肠的喙端。切掉肝脏和胃以及中胚层、肾瘤和生殖器嵴（如果有）。最后，通过切掉盲肠和结肠以及剩余的结缔组织来隔离小肠。
和以前一样，注意不要划伤肠道。在包埋前，将小肠在室温下尽可能短的时间留在 PBS 中。在颈部切断胚胎后，记录尾体节的数量，以准确确定胚胎发育的阶段。
在进行胚胎解剖之前，将 1.5 克 agros 融化在 100 毫升 PBS 中并保持在 50 摄氏度。通过纵向切割 2 毫升微量离心管以切除约四分之一的管壁来准备包埋模具。将融化的 agros 倒入模具中，让它冷却，直到摸起来只有一点点温暖。
准备好后，用镊子握住折叠的嘴端，然后沿着模具的长度非常缓慢地将其拉过 agros。这有助于保持肠道笔直，而 agro sets一旦开始抵抗移动就会释放组织，并跟踪肠道的喙部方向。接下来，将模具放入冰箱中两到三分钟以完全凝固。
凝固后，从模具中取出 agros 并修剪两端多余的 agros，垂直于肠道进行切割。将 agros 块的喙端粘在切片机的金属台上，并修剪四面八方多余的 aros。接下来，将金属载物台安装在振动切片机上。
如有必要，调整载物台的角度，使肠道尽可能垂直。用冰冷的 PBS 覆盖样品，然后将 microtone 刀片降至缓冲表面以下几毫米处。准备好后，在小肠上做 200 微米的横向切口。
确保每个农产品切片都包含一个完整的肠道切片。将新鲜切下的切片轻轻地沉积在先前准备好的胶原蛋白凝胶上。将一片放在每个孔的中间，以允许神经嵴细胞从茄子中迁移出来，将切片孵育三天。
在此之后，用镊子轻轻地从胶原蛋白凝胶上取下切片，注意不要损坏下面的凝胶。为确保细胞迁移模式不受干扰，在随后的孵育和洗涤步骤中避免直接接触胶原凝胶非常重要。首先，在室温下用每孔 500 μL 4% PFA 固定细胞 1 小时。
接下来，用每孔 500 μL DPI 溶液替换固定剂，并孵育 10 分钟。在室温下，小心地取出 DPI 溶液，并用 500 μL PBS 洗涤每个孔 3 次，每次 5 分钟。最后，拍摄每个孔内嵌入胶原凝胶中的荧光细胞。
在这个例子中，生长因子用于刺激表达 GFP 的肠道神经结痂细胞的迁移。虚线表示解释的大致大小和位置。在将其从凝胶中取出之前，发现在处理条件下与未处理条件下相比，从肠道外膜迁移出的 GFP 表达细胞的数量和扩散显着增加。
观看此视频后，您应该对如何通过在含有生长因子的胶原凝胶上孵育肠道切片来确定肠道神经祖细胞的迁移潜力有很好的了解。
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概述
本研究介绍了一种离体细胞迁移测定法，旨在量化肠神经嵴细胞对各种生长因子的迁移潜力。该方法包括解剖小鼠胚胎小肠并利用荧光显微镜来观察迁移的细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 肠神经嵴细胞在肠神经系统的发育中起着关键作用。
- 了解它们的迁移对于洞察胃肠道疾病至关重要。
- 生长因子可以影响这些细胞在发育过程中的行为。
- 离体测定为研究细胞迁移提供了一个受控环境。
研究目的
- 量化肠神经前体细胞的迁移潜力。
- 评估各种生长因子对细胞迁移的影响。
- 为未来的肠神经嵴细胞研究开发可靠的测定法。
所用方法
- 解剖含有荧光神经嵴细胞的小鼠胚胎小肠。
- 使用振动显微切片机制备200微米厚的切片。
- 在胶原凝胶上孵育组织切片，并添加生长因子。
- 使用荧光显微镜来观察和分析迁移的细胞。
主要结果
- 成功量化了细胞迁移模式对生长因子的响应。
- 观察到组织切片下方的迁移细胞。
- 证明了测定法在研究肠神经嵴细胞行为中的有效性。
- 洞察了特定生长因子在细胞迁移中的作用。
结论
- 离体测定法为研究肠神经嵴细胞迁移提供了宝贵的工具。
- 生长因子显著影响这些细胞的迁移潜力。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索胃肠道疾病的治疗靶点。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative cell migration assays for murine enteric neural progenitors enable precise evaluation of growth factor effects on neural crest cell motility, a critical parameter in early discovery and target validation for neurodevelopmental and gastrointestinal research. This ex vivo platform provides robust, reproducible data to inform mechanistic de-risking and support predictive confidence in pathway modulation strategies. The assay's quantitative outputs facilitate risk-adjusted portfolio decisions at the intersection of developmental biology and translational neuroscience.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of growth factor signaling pathways influencing neural crest cell migration.
- Supports functional validation of candidate targets involved in enteric nervous system development.
- Provides mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to pathway modulation.
- Facilitates predictive confidence in selecting targets for further preclinical evaluation.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo system for quantitative assessment of cell migration.
- Delivers reproducible, fluorescence-based readouts suitable for comparative analysis.
- Supports assay standardization for downstream compound or biologic screening.
- Enables reliable evaluation of growth factor or inhibitor effects on neural progenitor motility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for gastrointestinal and neurodevelopmental disorders.
- Provides continuity from discovery-stage pathway interrogation to preclinical validation of candidate interventions.
- Supports translational biomarker development by linking cellular migration phenotypes to pathway activity.
- Informs risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting neural crest cell migration.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative migration assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational research on enteric nervous system development.
- Discovery Biology: Quantifies neural progenitor migration in response to defined growth factors, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Provides standardized, reproducible outputs for comparative evaluation of candidate modulators.
- Analytics: Enables quantitative measurement of migration distance and cell number, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects ex vivo migration phenotypes to disease-relevant endpoints in gastrointestinal and neurodevelopmental models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform adaptable to diverse growth factors, inhibitors, and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural crest cell migration studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay workflows for cross-functional teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurodevelopmental and gastrointestinal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further preclinical development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, tissue slicing, and fluorescence microscopy.
- Demands access to vibrating microtomes, collagen gel preparation, and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and quantitative analysis protocols.
- Adaptable to various growth factors and genetic models, but limited to ex vivo conditions.
- Dependent on availability of transgenic mouse lines with fluorescently labeled neural crest cells.
