通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

本实验的总体目标是通过使用带有条形码的多重DNA文库并结合大规模并行测序，鉴定肿瘤组织细胞中与癌症相关基因的体细胞突变。该目标首先通过将带有条形码的测序接头连接到从保存的肿瘤组织中分离出的DNA片段上来实现。实验的第二步是利用定制的生物素标记寡核苷酸进行杂交，这些寡核苷酸与279个癌基因和肿瘤抑制基因的所有蛋白编码外显子互补。

第三步是对捕获文库中带有条形码的样本池进行大规模并行测序。最后一步是针对279个靶向基因在测序数据中搜索与癌症相关的变异。该流程可检测出序列突变、小片段插入、小片段缺失、拷贝数变异以及特定的结构变异。

因此，与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对常见和罕见突变进行全面的外显子组分析，同时识别其他基因组改变，如拷贝数的缺失和增加，并在异质性样本中实现更高的检测灵敏度。该方法有助于回答癌症基因组学领域的关键问题，例如，不同类型癌症中的关键驱动突变是什么？临床样本中的这些突变是否与患者预后或对靶向治疗的反应相关？该技术的应用前景涉及癌症的诊断与治疗，因为突变可被前瞻性地识别，并用于指导患者选择合适的治疗方案和临床试验。

该方法的可视化演示至关重要，因为洗脱DNA时需谨慎操作以避免污染，而这一纯化步骤较难掌握。准备末端修复主混合液，按适当体积混合，使每份样本含有50 µL。将每份剪切后的DNA各50 µL分装至ID六孔板的不同孔中。

然后向每个反应中加入50 µL制备好的末端修复主混合液，在20 °C下于PCR仪中孵育30分钟，以完成反应纯化。首先，向每个样本中加入200 µL AMPure XP磁珠，使用多通道移液器将全部液体体积轻轻吹打混匀10次。随后将反应板在室温下孵育15分钟。

随后，将培养板转移至磁力架上，室温静置15分钟，使液体澄清。澄清后，小心移除并弃去大部分上清液，注意不要扰动磁珠。孔中可能残留少量液体。

然后向每个样品中轻轻加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇，于室温孵育 30 秒。小心用移液器吸去乙醇，并重复洗涤一次。接着，将酶标板在室温下干燥，直至所有酒精完全挥发。

现在将干燥的磁珠重悬于44.5 µL无菌水中。用移液枪轻柔吹打每个样本10次，最后一次吹打时将液体完全排出。冲洗附着在孔壁上的任何磁珠。

将悬浮于水中的磁珠在室温下孵育两分钟，然后转移至磁力架上静置五分钟，直至孔内液体澄清。最后，轻柔地将每孔中42 µL的澄清上清液转移至新的孔中，上清液即为待测样本。样本可在-20 °C条件下保存长达一周。

首先，在无菌的微量离心管中配制 D 加尾主混合液。将 8 µL 配制好的 DA 加尾主混合液加入至每个含有末端修复 DNA 的孔中。然后将反应板置于热循环仪中，在 37 °C 下孵育 30 分钟，以完成反应的纯化。

采用上一节所述的相同流程，但体积加倍，最后将磁珠重悬于 33.75 微升无菌水中。此时，样品可在 -20 摄氏度下保存最多一周。接下来，为每个反应体系配制 15 微升的连接反应主混合液。

向每个含有 D 尾 DNA 的孔中加入 15 微升连接反应主混合液。接下来，加入 1.25 微升相应的 25 微摩尔浓度的接头引物。

每个样本应分别加入一条独特的条形码接头。接头加载完成后，在20摄氏度下孵育反应板15分钟。随后使用50 µL磁珠进行连接产物纯化，并将样本重悬于50 µL无菌水中。

然后用23微升水再次进行纯化步骤。此时，样品可在-20摄氏度下保存长达一周。下一步是对每个样品进行文库扩增，具体步骤详见文本方案中的冰上解冻、通用和索引寡核苷酸阻断剂、CCAP简易文库以及NimbleGen捕获组分（包括con TNA 2×杂交缓冲液和杂交组分）。

A. 现在配制一毫摩尔的指数寡核苷酸阻断剂混合液，该混合液对应文库构建中使用的特定条形码接头序列。取每种阻断剂各一微升，在新的1.5毫升离心管中混合，涡旋振荡10秒。在另一新的1.5毫升离心管中，配制捕获混合液，包含五微升浓度为一毫克每毫升的conte A、两微升通用阻断剂以及两微升阻断剂混合液。将24个带条形码的文库混合至同一个反应体系中。

向捕获混合物中加入总量为一至三微克的混合条形码文库。使用20号或更细的针头在管盖上戳15至20个小孔，然后将混合物置于DNA真空浓缩仪中，在60摄氏度下抽真空至完全干燥。接着，用杂交缓冲液和杂交组分A重新溶解混合物。用封口膜封住管盖上的小孔，涡旋震荡样品10秒。

然后将混合物在最大速度下离心10秒。接着将混合物短暂置于95摄氏度条件下孵育，以使DNA变性。随后在室温下将混合物于0.2毫升PCR条状管中再次以最大速度离心10秒。向其中加入2.25微升ccap easy library capture探针与等体积的无菌无核酸酶水。

然后将反应混合物转移至离心管中，用移液枪头轻轻吹打全部体积10次。现在将0.2毫升的离心管放入热循环仪中，在47摄氏度下孵育48至96小时。将热循环仪的盖温维持在57摄氏度，以防止蒸发，并在后续数天内稳定反应温度。

采用洗涤和回收捕获DNA的步骤，然后使用改良的Roche NimbleGen方案扩增捕获的DNA，最后通过Qubit高灵敏度检测对扩增后的捕获DNA进行定量。使用279个癌症基因的探针捕获一个包含12对肿瘤-正常样本的24重条形码测序文库，并以双端75 bp进行测序。

在HighSeq 2000流动池的单个通道中，肿瘤和正常文库的测序读段按2:1的比例混合。IGV图像显示了EGFR基因外显子区域测序覆盖的特异性，灰色条带代表唯一的序列读段。右侧的杂合T到G突变在24%的读段中存在，表明其为体细胞L858R氨基酸替换突变。

正常肺组织的所有测序读段均未显示此TTA G突变，某些结直肠癌肿瘤-正常配对样本中观察到PC中的体细胞移码插入或七碱基对的体细胞移码缺失。在TP 53基因中，肿瘤-正常配对样本之间也观察到拷贝数变异。每个数据点代表来自279个目标基因的单个外显子。

拷贝数的增加与减少是通过肿瘤测序覆盖度的升高与降低推断得出的。一旦掌握，若操作得当，该技术在文库制备阶段共享操作的情况下可在6.5小时内完成，而捕获杂交阶段则需要48至96小时。在进行该检测时，文库制备过程中必须格外注意避免污染，因为污染可能干扰数据分析。在完成本操作流程后，还可采用其他方法，如Sanger测序和片段分析，以回答诸如“如何验证可疑的变异？”之类的问题。观看本视频后，您应能充分理解如何制备带条形码的DNA文库，并对这些混合文库进行外显子捕获。