Name: 由外显子捕获和大规模平行测序检测体细胞遗传学改变在肿瘤标本 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解如何通过外显子捕获和大规模平行测序技术检测肿瘤标本中的体细胞遗传学改变。该方法利用条形码多重DNA文库和生物素化寡核苷酸探针，实现对279个癌症相关基因的高灵敏度突变检测，为癌症基因组学研究和精准医疗提供重要技术支持。

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感谢阿格尼丝·维亚尔博士以及纪念斯隆-凯特琳癌症中心基因组核心实验室提供的技术支持。本实验方案的开发得到了杰弗里·比恩癌症研究中心和法默家族基金会的支持。

1. DNA 和试剂的准备
注意：本方案描述了24个样本的同时处理与分析（例如 12个肿瘤/正常组织配对），但也可根据需要调整用于更小或更大的样本批次。DNA样本可来源于FFPE组织、新鲜冷冻组织、细胞学标本或血液。通常，来自同一患者的肿瘤组织和正常组织将一并进行分析，以区分体细胞突变与遗传性多态性。本方案自DNA提取完成后即开始。
<ol>
	<li>将每个样本提取的 DNA 分装 50–250 ng（推荐使用 250 ng），用 1× Tris-EDTA（pH 8.0）缓冲液稀释至终体积为 50 µl，分装至独立的 Covaris 圆底管中。</li>
	<li>在 Covaris E220 仪器上对 DNA 进行剪切，设置参数如下：持续 360 秒，占空比为 10，峰值入射功率为 175 PIP，每周期微泡次数为 200。</li>
	<li>将 AMPure XP 磁珠（表 2）置于室温下解冻。所有缓冲液和酶在使用前需在冰上解冻。</li>
</ol>
2. 文库构建 - 末端修复模块
<ol>
	<li>在无菌微量离心管中，按每份样品配制末端修复主混合液：10 µl 10x NEBNext末端修复反应缓冲液（表2）、5 µl NEBNext末端修复酶混合液（表2）、35 µl 无菌无核酸酶水（H2O）。</li>
	<li>将每份剪切后的DNA各50 µl分装至96孔板的不同孔中。向每个反应孔中加入50 µl已配制的末端修复主混合液。在热循环仪中于20 °C孵育30分钟。</li>
</ol>
3. 末端修复后纯化
<ol>
	<li>向每个样本中加入2倍体积（200 µl）的AMPure XP磁珠（表2），使用多通道移液器轻轻吹打混合10次。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将样本置于磁力架上（表2），室温静置15分钟，直至溶液变澄清。</li>
	<li>小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。孔中可能残留少量液体。</li>
	<li>保持样本管置于磁力架上，向每个样本中轻轻加入200 µl新鲜配制的80%乙醇，并在室温下孵育30秒。小心用移液器吸除乙醇。</li>
	<li>重复步骤5，共进行两次乙醇洗涤。确保完全去除所有乙醇。从磁力架上取下样本管，在室温下干燥5分钟。</li>
	<li>用44.5 µl无菌H2O重悬干燥的磁珠。轻轻吹打整个液体10次，充分混匀。确保磁珠不再黏附在孔壁上。</li>
	<li>将重悬的磁珠在室温下孵育2分钟。置于磁力架上5分钟，直至溶液变澄清。</li>
	<li>小心转移42 µl含有样本的澄清上清液至新的孔中。 
	此步骤可安全暂停，样本可在-20 °C保存最多7天。如需继续实验，将冷冻样本置于冰上解冻后再进行后续操作。</li>
</ol>
4. 文库构建 - dA加尾模块
<ol>
	<li>使用无菌微量离心管，按每份样品配制 dA 加尾主混合液：5 µl 10x NEBNext dA 加尾反应缓冲液（表 2），3 µl (3'-5' 外切酶缺陷型) Klenow 片段（表 2）。</li>
	<li>将 8 µl 配制好的 dA 加尾主混合液加入每个含有 42 µl 末端修复 DNA 的孔中。在热循环仪中于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>进行 dA 加尾后纯化：重复步骤 3.1–3.8，使用 2 倍体积（100 µl）的磁珠，但用无菌 H2O 重悬，最终体积为 33.75 µl。 
	本步骤可安全暂停，样品可在 -20 °C 保存最多 7 天。如需继续实验，将冻存样品置于冰上解冻后再进行后续操作。</li>
</ol>
5. 文库构建 - 接头连接模块
<ol>
	<li>在无菌微量离心管中配制连接反应主混合液，每份样品使用以下体积：10 µl 5x NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer（New England Biolabs，表2），5 µl Quick T4 DNA连接酶（表2）。</li>
	<li>向每孔含dA加尾DNA的样品中加入15 µl连接反应主混合液。</li>
	<li>向每孔中加入1.25 µl适当的25 µM NEXTflex条形码接头（表2），每个样品应使用不同的条形码接头。在热循环仪中于20 °C孵育15分钟。</li>
	<li>进行接头连接后的纯化：使用1倍体积（50 µl）磁珠重复步骤3.1–3.8，但用无菌H2O重悬至终体积50 µl。</li>
	<li>再次重复步骤3.1–3.8进行第二次1倍体积（50 µl）纯化，但用无菌H2O重悬至终体积23 µl。 
	本步骤可安全暂停，样品可在-20 °C保存最多7天。如需继续实验，将冻存样品置于冰上解冻后再进行后续操作。</li>
</ol>
6. 文库扩增
<ol>
	<li>在无菌微量离心管中配制KAPA HiFi预混液，每份样品使用以下体积：25 µl 2x KAPA HiFi HS RM（表2），100 µM 引物1和引物2各1 µl（表3）。</li>
	<li>将27 µl预混液加入含有连接产物的各孔中。将移液器设定为50 µl，轻柔地将全部液体上下吹打10次。</li>
	<li>放入热循环仪中进行以下PCR扩增循环：98 °C预变性45秒，随后进行10个循环（98 °C变性15秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸1分钟。</li>
	<li>进行扩增后纯化：使用1倍体积（50 µl）的AMPure XP磁珠，重复步骤3.1–3.8的操作，并用无菌水重悬至终体积30 µl。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用Qubit Broad Range Assay（Life Technologies，表2）测定各文库的浓度。</li>
</ol>
7. Roche Nimblegen SeqCAP EZ 文库杂交、洗涤与扩增
<ol>
	<li>解冻通用和指数寡核苷酸阻断剂（表3），SeqCap EZ文库，以及NimbleGen捕获组分（COT DNA、2倍杂交缓冲液和杂交组分A， 表 2置于冰上。所有寡核苷酸阻断剂均保存为1 mM的工作液。我们的SeqCap EZ文库是一种定制设计的捕获探针混合物，涵盖279个癌症相关基因的全部蛋白编码外显子，但也可使用其他定制或目录设计的产品。</li>
	<li>制备1 mM的索引寡核苷酸阻断剂混合物，该混合物应与文库构建中使用的特定条形码接头序列相对应。取每种阻断剂各1 µl，混匀并涡旋振荡。</li>
	<li>在新的无菌1.5 ml微量离心管中，加入5 µl 1 mg/ml COT DNA、2 µl 1 mM通用阻断剂和2 µl 1 mM索引寡核苷酸阻断剂混合物。</li>
	<li>将24个带条形码的文库混合至一个反应体系中。向捕获混合物中加入总共1–3 µg的混合条形码测序文库（如上制备）。对于24个样本，建议每个样本加入100 ng。在混合肿瘤样本与配对正常样本时，建议增加肿瘤文库的加入量例如 每肿瘤100 ng，每正常组织50 ng，以实现更深度的测序覆盖。</li>
	<li>盖上管盖，并用18-20号或更细的针头在管盖顶部刺出15-20个孔。将扩增后的样本文库/COT DNA/寡核苷酸置于DNA真空浓缩仪中，在高温（60 °C）下进行真空离心浓缩。</li>
	<li>完全干燥后，加入7.5 µl 2x杂交缓冲液和3 µl杂交组分A进行重悬。此时，离心管中总体积为10.5 µl，包含以下组分：5 µg COT DNA、可变量的扩增后样本文库（µg）、1000 pmol通用引物和Index引物、7.5 µl 2x杂交缓冲液、3 µl杂交组分A。</li>
	<li>用一小块实验室胶带封住盖子上的孔洞。将样品涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒。</li>
	<li>将样品在 95 °C 下孵育 10 分钟以变性 DNA，随后在室温下以最大速度离心 10 秒。</li>
	<li>在新的 0.2 ml PCR 条形管中，加入 2.25 µl SeqCap EZ Library 捕获探针和 2.25 µl 无菌无核酸酶水2O 并加入步骤 7.7 的全部内容。轻柔吹打混匀整个体积 10 次。</li>
	<li>在47 °C下于热循环仪中孵育48–96小时。设置并维持热循环仪盖温为57 °C。</li>
	<li>遵循 NimbleGen SeqCap EX Library SR 用户指南 v3.0 第 6 章中的步骤表 2用于洗涤和回收捕获的DNA。</li>
	<li>遵循罗氏NimbleGen方案第7章中关于捕获DNA扩增的步骤，但作如下修改：
	<ul type="disc">
		<li>使用 2x KAPA HiFi 聚合酶（表2）而非Phusion High-Fidelity PCR Master Mix</li>
		<li>使用所列的100 µM 引物1和引物2 表3.</li>
		<li>运行以下PCR程序：98 °C预变性30秒，随后进行11个循环（98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C终延伸5分钟，4 °C保存。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>使用Qubit高灵敏度检测试剂盒定量扩增后捕获的DNA浓度表 2按照制造商的说明进行操作。</li>
	<li>使用 Agilent Bioanalyzer DNA HS 芯片分析捕获的 DNA 质量（表 2按照制造商的说明进行操作。
	<ul type="disc">
		<li>PCR 产物得率应至少为 100 ng（范围 100–1,000 ng）。</li>
		<li>片段的平均长度应在150-400个碱基对之间。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
8. Illumina Hi-Seq 测序
<ol>
	<li>将扩增后的捕获DNA稀释至2 pM，并将样品加样到Illumina HiSeq 2000流动池的单个通道中。根据制造商的说明进行双端75个碱基对的测序。根据我们的经验，对于包含24个样品的样本池，在279个基因上，单个通道足以实现每个样品500–700倍的唯一序列覆盖度。</li>
	<li>Illumina软件（实时分析）会将高分辨率图像转换为簇强度，进而生成碱基识别和质量评分。使用CASAVA根据条形码信息对数据进行解复用，并为每个样品生成独立的FASTQ文件。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>使用 Cutadapt 工具（<a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a>）从 FASTQ 文件的测序读段 3' 端去除接头序列。最小重叠长度（-O）设为 3，错误率（-e）为 1%。去除接头后，成对读段保留的最小碱基长度为 25。</li>
	<li>使用 Burrows-Wheeler Aligner 工具（BWA）12 将测序读段比对至参考人类基因组 hg19。根据 Genomes Analysis Toolkit（GATK）的标准最佳实践流程（<a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices</a>）13，进行后续处理步骤，包括重复序列标记、局部多序列重比对以及碱基质量评分重校准。当分析来自同一患者的多个样本（例如&#160;配对的肿瘤与正常组织）时，应联合进行局部多序列重比对。这些后续处理步骤的输出结果为每个样本生成一个独立的 BAM 文件，其中包含所有序列、质量及比对信息，并可直接加载至 Integrative Genomics Viewer（IGV）中，用于读段和序列变异的可视化14。</li>
	<li>使用 Picard 工具（<a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a>）计算测序性能指标。关键指标包括比对率、片段大小分布、与 GC 含量相关的覆盖度偏差、靶向捕获特异性、PCR 重复率、文库复杂度以及靶区域平均覆盖度。代表性数值见图 1。使用 GATK 中的 DepthOfCoverage 计算常见多态性位点的等位基因频率，以监测来自无关 DNA 的污染，并确保配对样本来源于同一患者。 
	以下计算分析依赖于配对的肿瘤与正常样本，以检测体细胞遗传变异。对于无配对正常组织的肿瘤样本，也可使用独立的正常对照样本进行分析，但大多数体细胞突变难以与遗传性序列变异明确区分。</li>
	<li>使用体细胞突变检测工具（如 muTect15、SomaticSniper16 或 Strelka17）对每对肿瘤-正常样本调用体细胞单核苷酸变异（SNVs）。我们采用 muTect 并修改过滤标准，允许正常样本中存在低（非零）等位基因计数的变异，只要其在肿瘤样本中的等位基因频率至少高出 5 倍&#160;。在一组正常 DNA 面板中反复出现的变异将被剔除，因其可能为测序或比对过程中的系统性假象。每个通过过滤的 SNV 均需使用 IGV 进行仔细人工审查。</li>
	<li>使用 SomaticIndelDetector13、Dindel18 或 SOAPindel19 等算法对每对肿瘤-正常样本调用体细胞插入缺失变异（indels）。我们采用 SomaticIndelDetector，设定如下标准：等位基因频率至少为 10% 且支持读段数不少于 3 条，或等位基因频率至少为 2% 且支持读段数不少于 10 条。允许正常样本中存在低（非零）等位基因计数的 indel，只要其在肿瘤样本中的等位基因频率至少高出 5 倍&#160;。如同 SNV 分析，出现在正常 DNA 面板中的 indel 将被剔除。每个通过过滤的 indel 均需使用 IGV 进行仔细人工审查。</li>
	<li>根据靶向外显子区域的测序覆盖度推断拷贝数状态。对每个样本，对所有靶向外显子的平均测序覆盖度进行 Loess 归一化处理，回归校正 GC 含量的影响。通过从原始覆盖度值中减去 Loess 拟合值并加上全样本中位覆盖度，获得校正后的覆盖度。计算肿瘤-正常样本对之间所有靶向外显子的归一化覆盖度比值。在缺乏配对正常样本的情况下，或为降低噪声，可使用其他性别匹配、二倍体且无胚系拷贝数变异的正常对照样本。基于覆盖度比值的升高或降低，判断体细胞拷贝数增加或缺失。</li>
	<li>调用涉及癌症相关基因的体细胞重排事件，要求至少一个基因组断点位于靶向区间内或其附近。推荐使用的算法包括 GASV20、Breakdancer21、CREST22 和 dRanger23。可根据不一致读段对中支持读段的相对位置和方向，区分染色体内倒位、缺失和串联重复。所有候选重排事件均应使用 IGV 进行人工审查。我们建议通过 PCR 扩增和 Sanger 测序对预测的重排断点进行实验验证。</li>
</ol>

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<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li>
<li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings%3A+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+%28FFPE%29+tumor+tissues%2C+input+amount+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).</li>
</ol>

Berger 博士已从癌症诊断公司 Foundation Medicine 获得咨询费和研究资助。

我们的IMPACT检测具有高比对率、高靶向率、高靶标覆盖度以及高灵敏度，可有效检测突变、插入缺失（indels）和拷贝数变异。我们已证实，即使在DNA输入量较低的情况下，IMPACT检测仍可对新鲜冷冻样本和存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行DNA测序。通过对关键癌症相关基因的外显子进行靶向测序，可实现这些最重要基因外显子的极深测序覆盖，从而最大限度地提高对低频突变的检出能力。条形码标记与多重测序技术的应用，可实现更高通量、更低的单样本成本以及更少的DNA输入量需求。
靶向测序方法的一个优势在于，可以优化捕获探针，使得所有外显子在突变检测中均被均匀且充分地覆盖。如表1所示，我们的设计涵盖了279个基因中的4,535个外显子。经过对设计方案的多次迭代优化，典型的测序实验中，覆盖深度低于整个样本中位覆盖深度20%的外显子比例不超过2%。因此，对于测序深度达到500x的肿瘤样本（如图1所示的保守估计），&#62;98%的外显子将被&#62;100x的深度覆盖，从而确保对低频突变具有高灵敏度。这种覆盖均匀性在很大...

在关键癌基因和肿瘤抑制基因中识别&#34;驱动&#34;性肿瘤遗传事件，在多种癌症的诊断与治疗中发挥着至关重要的作用1。近年来，大规模研究利用大规模并行的&#34;下一代&#34;测序技术，已成功识别出许多与癌症相关的基因2。然而，这些测序平台通常需要从新鲜冷冻组织中提取大量DNA，从而在利用保存组织（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本）进行DNA突变的表征与分析时构成了主要限制。改进对FFPE肿瘤样本中&#34;可干预&#34;基因组信息进行高效且可靠表征的技术，将有助于对以往存档的样本进行回顾性分析，并进一步推动癌症管理向个体化方向发展。
传统上，分子诊断实验室依赖耗时且通量较低的方法（如Sanger测序和实时PCR）进行DNA突变谱分析。近年来，已开发出更高通量的方法，利用多重PCR或质谱基因分型技术来研究关键癌症基因中的复发性体细胞突变3-5。然而，这些方法存在局限性，仅能检测预先设定的&#34;热点&#34;突变，因此不适合检测肿瘤抑制基因中的失活突变。大规模并行测序相比这些策略具有多项优势，包括能够检测整个外显子区域中的常见和罕见突变，能够揭示其他类型的基因组改变（如拷贝数增加和缺失），以及在异质性样本中具有更高的检测灵敏度6, 7。全基因组测序是突变发现最全面的方法，但其相对昂贵，且在数据分析和存储方面需要较大的计算资源。
在临床应用中，由于只有基因组的一小部分可能具有临床意义，测序技术的两项特定创新已产生变革性影响。首先，通过基于杂交的外显子捕获技术，可以分离出与关键癌症相关基因对应的DNA，用于靶向突变谱分析8, 。其次，通过连接分子条形码（i.e. 长度为6-8个核苷酸的DNA序列），可在一次测序运行中混合数百个样本，从而充分利用大规模并行测序仪器持续增长的测序能力10。当这两项技术结合使用时，能够以更低的成本、更高的通量对肿瘤进行谱型分析，并减少计算资源需求11。此外，通过将测序覆盖度重新分配至特定应用中最关键的基因，可实现更高的测序深度，从而提高对低等位基因频率事件的检测灵敏度。
本文介绍了我们的IMPACT检测方法（可操作性癌症靶点综合突变谱分析），该方法利用条形码标记的文库池，通过定制寡核苷酸杂交介导的外显子捕获，富集279个关键癌症相关基因的所有蛋白编码外显子及部分内含子（表1）。该策略可检测这279个基因中的突变、插入缺失（indels）、拷贝数变异以及特定的结构重排。本方法适用于从新鲜冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、细针穿刺抽吸样本以及其他细胞学标本中提取的DNA。

<table><tbody><tr><td>NEBNext末端修复模块</td><td>New England Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext dA加尾模块</td><td>New England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext快速连接模块</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEXTflex无PCR条形码 &amp;ndash; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiFi文库扩增试剂盒</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>COT人源DNA，荧光级</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ杂交与洗涤试剂盒</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ文库捕获探针</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA宽范围（BR）检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNA HS试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96孔磁力架</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

检测和研究关键致癌突变的努力已被证明有助于为癌症患者提供适当的治疗。高通量、大规模并行的“下一代”测序技术的发展促进了众多此类突变的发现。为了提高该技术在临床和转化研究中的实用性，测序平台必须具备高通量、低成本的特点，并能够兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，这些样本可能仅能提取出少量降解或受损的DNA。本文描述了条形码标记和多重DNA文库的制备，随后通过杂交捕获靶向外显子，以在新鲜冷冻和FFPE肿瘤组织中利用大规模并行测序检测与癌症相关的突变。该方法可识别序列突变、拷贝数变异以及涉及所有靶向基因的选择性结构重排。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而对检测低频突变具有高灵敏度。

使用针对279个癌症基因全部蛋白编码外显子的探针，对一个包含24个带条形码的序列文库（12对肿瘤-正常样本）的样本池进行捕获，并在HiSeq 2000流动池的单个通道中以2 × 75 bp的双端读长进行测序。肿瘤与正常文库以2:1的比例混合。冷冻肿瘤DNA样本池的样本性能指标如图1所示，包括比对率、片段大小分布、靶向捕获特异性以及靶区域平均覆盖深度。示例性的体细胞突变、插入、缺失和拷贝数变异如图2-4所示。
<img alt="DNA测序分析图表：簇密度、目标覆盖度、插入片段大小、捕获特异性。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50710/50710fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 测序性能指标的代表性图示。a...

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。

检测和研究关键致癌突变的努力已被证明有助于为癌症患者提供适当的治疗。

本实验的总体目标是通过使用带有条形码的多重DNA文库并结合大规模并行测序，鉴定肿瘤组织细胞中与癌症相关基因的体细胞突变。该目标首先通过将带有条形码的测序接头连接到从保存的肿瘤组织中分离出的DNA片段上来实现。实验的第二步是利用定制的生物素标记寡核苷酸进行杂交，这些寡核苷酸与279个癌基因和肿瘤抑制基因的所有蛋白编码外显子互补。第三步是对捕获文库中带有条形码的样本池进行大规模并行测序。最后一步是针对279个靶向基因在测序数据中搜索与癌症相关的变异。该流程可检测出序列突变、小片段插入、小片段缺失、拷贝数变异以及特定的结构变异。因此，与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对常见和罕见突变进行全面的外显子组分析，同时识别其他基因组改变，如拷贝数的缺失和增加，并在异质性样本中实现更高的检测灵敏度。该方法有助于回答癌症基因组学领域的关键问题，例如，不同类型癌症中的关键驱动突变是什么？临床样本中的这些突变是否与患者预后或对靶向治疗的反应相关？该技术的应用前景涉及癌症的诊断与治疗，因为突变可被前瞻性地识别，并用于指导患者选择合适的治疗方案和临床试验。该方法的可视化演示至关重要，因为洗脱DNA时需谨慎操作以避免污染，而这一纯化步骤较难掌握。准备末端修复主混合液，按适当体积混合，使每份样本含有50 µL。将每份剪切后的DNA各50 µL分装至ID六孔板的不同孔中。然后向每个反应中加入50 µL制备好的末端修复主混合液，在20 °C下于PCR仪中孵育30分钟，以完成反应纯化。首先，向每个样本中加入200 µL AMPure XP磁珠，使用多通道移液器将全部液体体积轻轻吹打混匀10次。随后将反应板在室温下孵育15分钟。随后，将培养板转移至磁力架上，室温静置15分钟，使液体澄清。澄清后，小心移除并弃去大部分上清液，注意不要扰动磁珠。孔中可能残留少量液体。然后向每个样品中轻轻加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇，于室温孵育 30 秒。小心用移液器吸去乙醇，并重复洗涤一次。接着，将酶标板在室温下干燥，直至所有酒精完全挥发。现在将干燥的磁珠重悬于44.5 µL无菌水中。用移液枪轻柔吹打每个样本10次，最后一次吹打时将液体完全排出。冲洗附着在孔壁上的任何磁珠。将悬浮于水中的磁珠在室温下孵育两分钟，然后转移至磁力架上静置五分钟，直至孔内液体澄清。最后，轻柔地将每孔中42 µL的澄清上清液转移至新的孔中，上清液即为待测样本。样本可在-20 °C条件下保存长达一周。首先，在无菌的微量离心管中配制 D 加尾主混合液。将 8 µL 配制好的 DA 加尾主混合液加入至每个含有末端修复 DNA 的孔中。然后将反应板置于热循环仪中，在 37 °C 下孵育 30 分钟，以完成反应的纯化。采用上一节所述的相同流程，但体积加倍，最后将磁珠重悬于 33.75 微升无菌水中。此时，样品可在 -20 摄氏度下保存最多一周。接下来，为每个反应体系配制 15 微升的连接反应主混合液。向每个含有 D 尾 DNA 的孔中加入 15 微升连接反应主混合液。接下来，加入 1.25 微升相应的 25 微摩尔浓度的接头引物。每个样本应分别加入一条独特的条形码接头。接头加载完成后，在20摄氏度下孵育反应板15分钟。随后使用50 µL磁珠进行连接产物纯化，并将样本重悬于50 µL无菌水中。然后用23微升水再次进行纯化步骤。此时，样品可在-20摄氏度下保存长达一周。下一步是对每个样品进行文库扩增，具体步骤详见文本方案中的冰上解冻、通用和索引寡核苷酸阻断剂、CCAP简易文库以及NimbleGen捕获组分（包括con TNA 2×杂交缓冲液和杂交组分）。A. 现在配制一毫摩尔的指数寡核苷酸阻断剂混合液，该混合液对应文库构建中使用的特定条形码接头序列。取每种阻断剂各一微升，在新的1.5毫升离心管中混合，涡旋振荡10秒。在另一新的1.5毫升离心管中，配制捕获混合液，包含五微升浓度为一毫克每毫升的conte A、两微升通用阻断剂以及两微升阻断剂混合液。将24个带条形码的文库混合至同一个反应体系中。向捕获混合物中加入总量为一至三微克的混合条形码文库。使用20号或更细的针头在管盖上戳15至20个小孔，然后将混合物置于DNA真空浓缩仪中，在60摄氏度下抽真空至完全干燥。接着，用杂交缓冲液和杂交组分A重新溶解混合物。用封口膜封住管盖上的小孔，涡旋震荡样品10秒。然后将混合物在最大速度下离心10秒。接着将混合物短暂置于95摄氏度条件下孵育，以使DNA变性。随后在室温下将混合物于0.2毫升PCR条状管中再次以最大速度离心10秒。向其中加入2.25微升ccap easy library capture探针与等体积的无菌无核酸酶水。然后将反应混合物转移至离心管中，用移液枪头轻轻吹打全部体积10次。现在将0.2毫升的离心管放入热循环仪中，在47摄氏度下孵育48至96小时。将热循环仪的盖温维持在57摄氏度，以防止蒸发，并在后续数天内稳定反应温度。采用洗涤和回收捕获DNA的步骤，然后使用改良的Roche NimbleGen方案扩增捕获的DNA，最后通过Qubit高灵敏度检测对扩增后的捕获DNA进行定量。使用279个癌症基因的探针捕获一个包含12对肿瘤-正常样本的24重条形码测序文库，并以双端75 bp进行测序。在HighSeq 2000流动池的单个通道中，肿瘤和正常文库的测序读段按2:1的比例混合。IGV图像显示了EGFR基因外显子区域测序覆盖的特异性，灰色条带代表唯一的序列读段。右侧的杂合T到G突变在24%的读段中存在，表明其为体细胞L858R氨基酸替换突变。正常肺组织的所有测序读段均未显示此TTA G突变，某些结直肠癌肿瘤-正常配对样本中观察到PC中的体细胞移码插入或七碱基对的体细胞移码缺失。在TP 53基因中，肿瘤-正常配对样本之间也观察到拷贝数变异。每个数据点代表来自279个目标基因的单个外显子。拷贝数的增加与减少是通过肿瘤测序覆盖度的升高与降低推断得出的。一旦掌握，若操作得当，该技术在文库制备阶段共享操作的情况下可在6.5小时内完成，而捕获杂交阶段则需要48至96小时。在进行该检测时，文库制备过程中必须格外注意避免污染，因为污染可能干扰数据分析。在完成本操作流程后，还可采用其他方法，如Sanger测序和片段分析，以回答诸如“如何验证可疑的变异？”之类的问题。观看本视频后，您应能充分理解如何制备带条形码的DNA文库，并对这些混合文库进行外显子捕获。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

由外显子捕获和大规模平行测序检测体细胞遗传学改变在肿瘤标本

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel...

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。...

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

本文详细介绍了使用基于锚定多重聚合酶链式反应的文库制备试剂盒，随后进行高通量测序，以检测临床实体瘤样本中的致癌基因融合。文中描述了湿实验操作和数据分析的各个步骤。...

使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）治疗管理中需检测的分子生物标志物日益增多，推动了快速且可靠的分子检测方法的发展。本文介绍了一种采用超快速下一代测序（NGS）技术对NS-NSCLC患者进行基因组变异评估的工作流程。...

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。...

福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。...

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

了解如何通过外显子捕获和大规模平行测序技术检测肿瘤标本中的体细胞遗传学改变。该方法利用条形码多重DNA文库和生物素化寡核苷酸探针，实现对279个癌症相关基因的高灵敏度突变检测，为癌症基因组学研究和精准医疗提供重要技术支持。

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

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