Name: 成人下丘脑神经发生局灶性放射性抑制功能审讯 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 了解利用计算机断层扫描引导的三维成像技术对小动物模型进行局灶性放射照射以抑制成人下丘脑神经发生的方法。该技术可精准靶向特定神经前体细胞群，为研究神经发生功能提供重要工具。

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感谢 C. Montojo、J. Reyes 和 M. Armour 提供的技术建议与协助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 F31 NS063550（资助对象：D.A.L.）、Basil O'Connor 新兴学者奖以及 Klingenstein 基金会和 NARSAD 的资助（资助对象：S.B.）支持。S.B. 是医学研究领域的 W.M. Keck 杰出青年学者。

动物使用
获得机构动物护理与使用委员会对标准护理和使用方案的批准。本方案是为5.5-10周龄小鼠的局部照射研究而制定的。&#160;周&#160;老年C57BL/6J小鼠，如先前所述（图2)2。然而，其他年龄段及小型动物物种（大鼠、仓鼠、地松鼠， 等等。也可使用，前提是具备有效的麻醉方案以及能够识别感兴趣区域（ROI）的放射解剖图谱。
1. CT引导放射学平台的校准
针对所使用的每种准直器尺寸和X射线管滤波器类型，预先在放射学平台上进行基于胶片的辐射剂量校准。为了将弧形照射束精准定位至目标区域，使用大多数商用放射治疗平台配备的辐射剂量计划软件49，根据辐射剂量、基于小鼠CT扫描确定的兴趣区域（ROI）深度以及机器人平台的旋转速度，计算所需的照射时间；由于不同放射治疗平台之间的具体操作存在差异，本方案中省略了相关细节。为通过CT成像可视化腹侧下丘脑2（图3），应使用0.4 mm焦点尺寸的X射线管，射线能量设为100 kVp，并采用1 mm铝滤波。针对HPZ的局部照射，应将X射线管设置为225 kVp、13 mA、1 mm焦点尺寸，并配备0.15 mm铜滤波，在0.6 cm组织深度处于4.6分钟的治疗时间内递送10 Gy的辐射剂量。针对不同ROI之间的靶向照射，需重新计算相应的参数。
<ol>
	<li>若研究高脂饮食对正中隆起神经发生的影响（如先前所述2），从Jackson Mouse实验室获取四周龄雌性C57BL6/J小鼠，每笼饲养四只。在五周龄时将食物从普通饲料更换为高脂饮食。让小鼠适应新的饲养环境和食物。在5.5周龄时进行CFIR处理。将实验动物转运至配备放射学平台的手术室，转移过程中尽量减少应激。准备异氟烷气体麻醉舱，随后将一只小鼠放入舱内。同时，为处理后的小鼠准备加热垫（低档设置）。</li>
	<li>当小鼠已进入麻醉状态且对足垫压迫无反应时，将其转移至放射学平台，并放置于机器人载物台的固定床上。将小鼠的口部插入鼻罩麻醉杯中，牙齿置于咬合固定器内（图1D）。将小鼠平放于固定床上，检查其是否持续无反应。若确认无反应，则使用纱布胶带将小鼠固定于床上。在固定过程中，确保头部处于水平平面。可通过拉起双耳并观察是否齐平来判断。当小鼠处于正确位置后，关闭铅防护罩。</li>
	<li>使用实验者所用放射学平台的内置软件获取计算机断层扫描图像，以获得小鼠的三维解剖结构图像。检查小鼠头部是否处于水平平面。若未达到水平，重复步骤1.2–1.3，直至头部调平。</li>
	<li>通过CT图像确定感兴趣区域（ROI）。如图3E所示，以与水平面成45°角的方式计算ROI至颅骨表面的距离。</li>
	<li>使用内置软件，如图4A所示，从上方获取小鼠的X射线图像。随后将小鼠从放射学平台移出，置于加热垫上，并持续监测直至恢复活动能力。</li>
	<li>根据冠状面CT图像，计算至少三只小鼠的ROI平均解剖深度，以确定照射剂量。例如，在先前一项研究2中，向腹侧基底下丘脑施加10 Gy照射剂量时，ROI至颅骨的深度（以45°角测量）为0.66 cm（见图3E）。基于此数据，研究人员使用放射学平台安装的剂量规划软件（DPS），计算出实现目标剂量所需的旋转速度和照射时间。</li>
	<li>在通过剂量规划软件确定机器人载物台的处理时长和旋转速度后，使用嵌入水等效塑料模拟小鼠模型中的GAFchromic辐射敏感膜，测量所计算参数的剂量分布。具体操作为：如图4B所示，将三张GAFchromic辐射敏感膜置于四块垂直堆叠的水等效塑料块之间29。</li>
	<li>将含有GAFchromic膜的模拟小鼠模型放置于机器人载物台上，使用新计算的参数运行聚焦照射束。例如，为靶向腹侧基底下丘脑，输入以下参数：0.15 mm Cu滤光片、225 kVp、13 mA、1 mm直径照射束设置、45°机架角、1.3°/秒旋转速度、照射时间4.6分钟，以实现ROI处10 Gy的放射剂量。</li>
	<li>照射完成后，检查膜片上辐射剂量的分布模式和强度。当以360°旋转角度并使用上述参数靶向腹侧基底下丘脑时，可在等中心点上方的膜片上观察到深色环状区域，等中心点膜片上出现小而清晰的斑点，等中心点下方膜片上则呈现较浅的环状区域，这些特征对应于锥形束照射的剂量分布（图4B）。</li>
	<li>将等中心点处的GAFchromic膜图像叠加至用于参数计算的小鼠X射线图像上。等中心点处的照射焦点应与预期的ROI区域重合，如图4C所示。</li>
</ol>
替代方法：如果仍难以定位脑部感兴趣区域，可使用经鞘内注射碘对比剂，以增强CT图像下脑室的可视化效果。为简洁起见，本方案中未包含该操作步骤，但此前已有描述35, 50。碘对比剂可提供额外的脑室解剖标志（图5A）。
2. 确定照射束的准确性
通过直接可视化组织中的辐射束进一步确认CFIR束流的准确性2, 35, 51。为此，进行免疫组织化学染色以检测γH2AX51，该蛋白是一种组蛋白，也是DNA双链断裂的早期标志物。小鼠必须在照射后一小时内进行经心脏灌注并固定。照射后，DNA修复过程迅速启动，ϒH2AX水平显著下降35。
<ol>
	<li>重复步骤 1.1 - 1.3。</li>
	<li>在 CT 上确定目标后，通过机器人控制将小鼠移动，使该目标与辐射递送束对齐。将步骤 1.6 中计算出的参数（旋转速度和达到所需剂量的照射时长）输入剂量规划软件，并开始治疗。治疗时，机架指向与垂直方向成 45° 角，同时小鼠围绕垂直轴旋转。</li>
	<li>照射完成后，对小鼠进行经心灌注。灌注需在照射后一小时内完成52。灌注结束后，将脑组织浸入 4% 多聚甲醛（PFA）/PBS 中，并在 4 °C 下轻轻振荡过夜。</li>
	<li>次日早晨，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除多聚甲醛固定液。随后，在 1×PBS 中的 30% 蔗糖溶液中浸泡，并于 4 °C 下置于摇床上。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻振荡（通常为 12–16 小时），直至脑组织沉入管底。此步骤起到冷冻保护作用。当脑组织完全下沉后，使用带孔勺小心取出，以避免转移过多的 30% 蔗糖/1×PBS 溶液。迅速在干冰上将脑组织包埋于冷冻介质中，用移液器枪头轻轻搅动冷冻介质，并将脑组织在塑料模具中摆放至合适位置。</li>
	<li>待脑组织完全冻结后，将其转移至 -20 °C 冰箱中保存。</li>
	<li>进行免疫组织化学染色当天，将脑组织以 40 μm 厚度进行冠状切片，并用细毛笔漂浮转移至含有 PBS 的 24 孔板中。切片应保持正确的连续顺序，以便通过免疫染色确定照射区域的覆盖范围。</li>
	<li>将 0.01 M 柠檬酸钠溶液在水浴中预热至 80 °C，以准备抗原修复步骤。同时，在柠檬酸钠溶液加热过程中，用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟&#160;。</li>
	<li>当柠檬酸钠溶液达到 80 °C 后，将脑切片浸入柠檬酸钠缓冲液中，在水浴中 80 °C 孵育 1 小时。</li>
	<li>取出切片，使柠檬酸钠溶液自然冷却至室温，然后用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中封闭脑切片 1 小时。</li>
	<li>在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中，加入 1:700 稀释的小鼠抗磷酸化 H2AX 一抗，4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>次日，用 0.01 M PBS-Triton 洗涤 3 次，每次 15 分钟&#160;。</li>
	<li>在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中，加入 1:500 稀释的与 488 nm 荧光染料偶联的山羊抗小鼠二抗，孵育 2 小时。</li>
	<li>用 0.01 M PBS-Triton 洗涤 3 次，每次 15 分钟&#160;。</li>
	<li>加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色液（1:5,000 稀释于 PBS 中），染色 10 分钟以显示细胞核。随后，用 PBS 洗涤脑切片 5 分钟。</li>
	<li>将切片漂浮于 PBS 中，贴附于带静电的载玻片上。擦去多余 PBS，让载玻片自然干燥。用封片剂封片，并将载玻片置于暗处室温下过夜干燥。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄连续冠状切片图像。ϒH2AX 免疫染色（绿色）显示照射部位。DAPI（蓝色）为细胞核染色（图 5B）。</li>
</ol>
3. 小鼠受试对象的局部照射准备
观察 ϒH2Ax 免疫染色结果。当对辐照束的校准和定位满意后，即可开始实验。此时，处理一只小鼠所需的总时间（从动物准备到完成束流输送）约为 10-15 分钟，适用于 10 Gy 剂量、1 mm 束径的辐照处理。
<ol>
	<li>从杰克逊小鼠实验室订购四周龄的雌性C57BL6/J小鼠。每笼饲养四只小鼠，并在小鼠五周龄时将普通饲料更换为高脂饮食。对小鼠进行耳部打孔，以提供唯一的识别标记。每天监测小鼠的健康状况。注意：不可使用金属标记，因其会在CT成像中导致条纹伪影。</li>
	<li>在放射治疗或假手术处理前一天称量小鼠体重。将小鼠分为两组，分别接受放射治疗或假手术处理，并确保两组间体重无显著差异。在处理当天（小鼠六周龄时），重新称量所有小鼠并记录其质量。轻柔地将两组小鼠转运至放射治疗平台，注意尽量减少应激反应。</li>
	<li>准备异氟烷气体麻醉舱。对两只小鼠进行麻醉，其中一只属于预定的照射组，另一只为假手术对照组。准备设定在低温档位的加热垫，用于术后恢复。</li>
	<li>对接受照射的小鼠执行步骤1.2至1.4。对于假手术组小鼠，在治疗期间将其保留在麻醉舱内。确保麻醉舱靠近CFIR平台，以便将环境辐射的任何影响纳入考虑。在CT上确定目标区域后，通过机器人控制将小鼠移动，使该目标与放射线束对齐。将计算好的参数（旋转速度和治疗时长）输入剂量计划软件中。</li>
	<li>放射治疗完成后，将假手术组和照射组小鼠均放回加热垫上，并持续监测直至其苏醒。</li>
	<li>将假手术组和照射组小鼠均送回动物饲养设施，每天进行监测，每半周称重一次。为确认下丘脑增殖区靶向照射效果，治疗后第三天给予腹腔注射BrdU（50 mg/kg），并在首次BrdU暴露后一个月，通过BrdU与神经元标记物的免疫组织化学共标记检测各组间的神经发生情况（图6）2。</li>
</ol>

J.W. 与 Xstrahl 公司存在研究资助和咨询协议。

CT引导的局部照射（CFIR）是一种新颖且完整的系统方法，能够在CT引导下通过机器人控制将辐射场递送至小动物体内的靶区32。CFIR向小动物模型递送高度聚焦射线的能力为连接实验室研究与临床转化提供了新的研究机遇。本文描述了CFIR方法在精确辐射递送中特异性靶向下丘脑神经前体细胞群体的应用。我们在此展示了如何通过X射线胶片以及通过免疫组织化学在脑组织中校准并验证辐射递送的特异性。
此外，我们展示了如何利用该技术在特定脑区抑制神经发生。我们证明，可以靶向腹内侧下丘脑区域，在不改变邻近结构神经发生水平的情况下，特异性抑制正中隆起（median eminence）的神经发生。正中隆起神经发生的抑制伴随着代谢和活动水平的改变，并且在高脂饮食条件下，与假照光处理组相比，辐照组体重增加减少（图6）2。这些数据表明，成年期新生的下丘脑神经元在调节代谢和能量稳态中发挥重要作用。此外，结果提示，即使在成年期，过量的高脂饮食仍可能改变关键的代谢神经环路3。我们的研究结果拓展了目前对成年新生神经元功能的认识...

最近的研究发现表明，成年哺乳动物的大脑具有显著的可塑性。在整个成年期，成年新生神经元会在哺乳动物大脑的特定微环境中持续产生1。这些成年新生神经元的功能是什么？更重要的是，它们是否在生理和行为中发挥作用？传统上，针对这一主题的研究主要集中在侧脑室的室下区和海马体的颗粒下区；然而，最近的研究已揭示了其他脑区（如哺乳动物下丘脑）中也存在神经发生现象2。已有报道指出，在出生后及成年期的下丘脑中均存在神经发生2-10，而这些新生下丘脑神经元的功能仍是当前研究的热点领域。
成年出生神经元的功能表征对整个神经科学领域而言仍是一个重大挑战。由于目前缺乏仅特异性表达于单一神经前体细胞群体的分子标记物，针对特定神经前体细胞群体的选择性抑制仍然受限11。因此，通过基因靶向手段从这些神经前体细胞中选择性清除成年出生的神经元仍十分困难。同样，利用病毒递送方法靶向成年出生神经元也存在潜在的混杂因素，例如可能对局部环境造成损伤和引发炎症反应12。
然而，新的放射学工具正在出现，这些工具能够规避上述混杂因素，并通过在小型动物中进行准确而精确的解剖定位来研究这些问题。电离辐射能够抑制新神经元的生成与分化，从而提供一种非侵入性方法来靶向神经前体细胞群体13-15。最近，我们描述了哺乳动物下丘脑正中隆起（ME）中的一个生发区域，将其命名为下丘脑增殖区（HPZ）2。我们发现，当年轻的成年雌性小鼠摄入高脂饮食（HFD）时，与摄入普通饲料（NC）的对照组小鼠相比，HFD喂养小鼠在该ME区域的神经发生水平显著升高2。为了检验下丘脑ME区域内的成年神经发生是否调控代谢和体重，我们试图干扰这一过程。正中隆起是位于第三脑室底部的一个微小的单侧结构，调节性激素由此释放。为了在不改变该脑区其他生理功能的前提下抑制细胞增殖及随后的神经发生，我们开发了一种非侵入性的局部照射技术，可选择性地抑制下丘脑正中隆起中新生成的成年神经元的产生2。
许多研究团队已采用辐射手段抑制经典脑区中的神经发生14-28。然而，以往的放射学方法通常针对较大区域，或常常无意中同时影响了多个已报道存在神经发生的脑区，从而难以明确将所观察到的行为缺陷归因于特定神经前体细胞群的功能异常。目前，借助结合了computer tomography（计算机断层扫描）引导成像与focal beam irradiation（聚焦束辐射）（CFIR）递送技术的放射学平台，可实现更精准的靶向照射，从而实现精确的解剖定位29-36。该技术可提供直径低至0.5 mm的辐射束，用于靶向特定的神经前体细胞群35。该方法使我们能够精准靶向下丘脑正中隆起（ME），并在小型动物中阻断细胞增殖及神经发生过程。在对这些前体细胞群进行放射处理后，可开展生理学与行为学检测，以揭示成年新生神经元的潜在功能。聚焦照射对本研究尤为重要，因为垂体紧邻下丘脑正中隆起；若照射波及垂体，可能影响其内分泌功能，进而干扰实验结果的解读。
辐射后神经发生受到抑制的生物学基础仍不明确。以往的辐射研究依赖于大范围照射束，得出的结论是神经发生的抑制是通过炎症反应介导的14, 37。因此，尚不清楚高度聚焦的辐射是否也能抑制神经发生，因为这种照射方式并不会引发显著的炎症反应。然而，我们课题组最近对海马体经典神经发生区域的研究表明，采用10 Gy剂量的高度聚焦辐射可在照射后至少4周内抑制神经发生35。
为了研究中位隆起区成年新生神经元的功能，我们采用一种精密放射装置，该装置能够结合CT成像与小直径放射束来抑制中位隆起（ME）的神经发生。通过安装在可旋转360°机架上的X射线管，结合机器人控制的样品载台，在放射治疗过程中实现对动物模型的旋转，从而实施弧形束微照射（图1）。当机架处于水平位置时，使用高分辨率X射线探测器获取图像33。在本研究中，CT图像重建后的各向同性体素尺寸为0.20 mm。机载CT成像可在动物处于治疗位置时精确定位目标区域。目标区域的定位借助随商用放射平台提供的CT导航剂量规划软件完成。通过CT成像确定感兴趣区域（ROI）后，由具有四个自由度（X、Y、Z、θ）的机器人样品载台将动物移至相应的治疗位置。通过调节机架角度与机器人载台角度的组合，可从相对于动物的几乎任意方向进行射线照射，从而实现立体定向弧形治疗29。在本研究及其他所有成像实验中，小鼠均被固定于专用固定装置内，该装置可在限制动物活动的同时输送麻醉气体异氟烷。该固定床具备CT兼容性，并与机器人样品载台相连接34。
我们预计，CFIR 将在多个研究领域带来概念上的进展。尽管我们以放射学手段靶向下丘脑正中隆起作为该技术原理的验证，但原则上，CFIR 可用于靶向任何小型模式生物体内的任意区域。例如在神经科学领域，我们设想该技术可用于评估其他室周器官中可能存在并具有活跃增殖能力的前体细胞群体的功能，如最后区38, 39、穹窿下器官40以及垂体41。长期以来关于成体神经发生功能作用的争议，以及确定其在行为中因果作用的问题，现在也能够得到更深入的探讨。在鸣禽中，该技术可能有助于阐明成体神经发生在维持鸟类鸣叫的强烈且季节性行为中的作用42，而此前这一研究因难以在特定脑区选择性抑制神经发生而受到阻碍。理解这一显著的行为模型，可能为成体神经发生在调控其他性二型行为中的作用提供新的见解。此外，在代谢研究领域，CFIR 可能被用于探索肝细胞增殖及其在代谢和能量平衡中所起作用的相关方面。该技术的引入，有望推动多个研究学科在概念上的进步。
本文展示了CFIR在精确定位局灶性照射束解剖靶区方面的功能。尽管我们最初开发了这种小型动物放射研究平台（SARRP）用于自身研究，但现在市场上已有其他类似的设备，均可实现类似的CT引导局灶照射43, 44。因此，本文所述CFIR方案概括了适用于所有研究平台的通用步骤，而非仅限于SARRP的特定操作。相较于以往抑制神经发生的放射学方法，CFIR的优势在于：该技术可利用三维容积成像进行剂量定位与靶向引导，适形剂量可最大限度减少非靶向脑区的辐射暴露，且高精度的射束几何形状可实现具有陡峭边界锐利度的适形剂量分布。我们阐述了如何利用CT引导成像将辐射剂量靶向特定解剖区域，并进一步说明如何通过γ-H2AX免疫组织化学染色——一种DNA双链断裂标志物35, 45-48——直接在组织中可视化辐射剂量分布。该方法用于选择性照射神经发生微环境，可能对揭示新生成年神经元在生理与疾病中的功能作用具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>SARRP 研究平台</td><td>Xstrahl</td><td>RS225A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm&quot; target=&quot;_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SARRP 照射屏蔽室</td><td>Xstrahl</td><td></td><td>可选，但应使用替代的铅屏蔽以限制辐射暴露</td></tr><tr><td>GAF 示色薄膜</td><td>IPS</td><td>GAFchromic ETB2</td><td></td></tr><tr><td>小鼠体模</td><td>Gammex</td><td>457</td><td>从 Gammex 购买 0.5 cm × 30 cm × 30 cm 的固体水板，并切割至所需尺寸。</td></tr><tr><td>小鼠抗磷酸化组蛋白 H2AX Ser139 抗体</td><td>Millipore, Inc.</td><td>05-636</td><td>克隆株 JBW301</td></tr><tr><td>高脂啮齿类动物饲料</td><td>Research Diets</td><td>D12492i</td><td>60% 的热量来自脂肪，饲料应经过辐照处理</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>0.01 M 柠檬酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>将 1.471 g 柠檬酸钠溶解于 500 ml 去离子水中</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>细胞核复染剂</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>推荐使用 Vectashield 或 Gelvatol</td></tr></tbody></table>

功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法

下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

成年新生神经元的功能表征仍是一个重大挑战。通过侵入性病毒递送或转基因动物手段抑制成年神经发生的传统方法存在潜在的混杂因素，使得对这些研究结果的解释变得困难。然而，新兴的放射学工具使得研究者能够非侵入性地通过精确的解剖定位，探究特定成年新生神经元群体的功能。局部电离辐射可抑制新神经元的生成与分化，并可靶向特定的神经前体细胞区域。为了阐明下丘脑成年神经发生在调控生理过程中的潜在功能作用，我们开发了一种非侵入性局部照射技术，用于选择性抑制下丘脑正中隆起区域成年新生神经元的生成。本文描述了一种方法 C计算机断层扫描引导的 f局部 ir辐射（CFIR）递送，以实现对小型动物的精确定位和准确解剖靶向。CFIR采用三维容积成像引导技术进行辐射剂量的定位与靶向，可最大限度减少非靶向脑区的辐射暴露，并实现具有锐利束流边界的适形剂量分布。本方案不仅可用于探究成年新生神经元的功能，同时也为放射生物学、肿瘤生物学和免疫学领域的研究问题提供了新的途径。这些放射学工具将有助于推动从实验室基础研究到临床应用的转化。

评估 CT 引导下的靶向性与准确性
系统的机械校准对于确保来自不同角度的射束均能相交于单一点至关重要。校准采用一种半自动的基于成像的方法完成，其端到端的对准精度已测得为0.2 mm29。该精度极为关键，因为下丘脑正中隆起结构的体积较小2。为验证此校准效果，我们使用嵌入水等效塑料模拟小鼠模型中的GAFchromic辐射敏感胶片测量了剂量分布35（图4B）。简言之，首先对小鼠受试体进行CT扫描，并确定腹侧基底部下丘脑靶区位置。随后计算辐射递送和旋转速度，并安装适当的准直器和滤片，以确保递送10 Gy的辐射剂量。接着，将设计为水等效塑料结构并嵌入GAFchromic辐射敏感胶片的模拟小鼠模型替代真实小鼠受试体，用于测量不同焦平面处的剂量分布。图4B展示了在模拟小鼠平台上使用1 mm直径射束进行弧形照射时，利用GAFchromic胶片获得的端到端测试结果。机架相对于模拟小鼠模型设置为45°角，同时机器人样本台围绕垂直轴旋转，从而生成一个辐射“弧”或锥形。半高全宽（...

成年哺乳动物新生神经元的功能仍是当前研究的活跃领域。电离辐射可抑制新神经元的生成。利用计算机断层扫描引导的局部照射（CFIR），现可通过三维解剖定位特定的神经前体细胞群，来评估成年神经发生的生物学功能。

成年新生神经元的功能表征仍是一个重大挑战。通过侵入性病毒手段抑制成年神经发生的各种方法……

本实验的总体目标是描述一种先进的放射学技术，该技术可实现对小型动物模型进行靶向照射，并以解剖学特异性的分辨率抑制细胞增殖。该技术首先采用计算机断层扫描引导的三维容积成像，精确定位目标区域；实验的第二步是计算放射治疗对目标区域的剂量递送方案及照射持续时间。第三步是进行基于胶片的辐射剂量校准。最后一步是通过直接可视化组织中的辐射束来确定辐射束的准确性。最终，这些研究的结果可以通过治疗后的生理学和行为学分析，揭示特定增殖性神经前体细胞群体的潜在功能作用。与现有抑制神经发生的方法（例如全脑大范围照射）相比，该技术的主要优势在于采用直径小至0.5毫米的辐射束来靶向特定的神经干细胞群。这使得研究者能够明确地将行为学或生理学缺陷与特定神经干细胞群的功能相关联。该方法的可视化演示至关重要，因为辐射束的设置步骤在初期较难掌握，涉及使用硬件和软件进行体位定位及剂量控制的多个环节。准备一个异氟烷气体麻醉舱，然后将一只小鼠放入舱内。同时，将加热垫调至低温档，用于治疗后动物护理。当小鼠对足垫压迫不再有反应时，将其转移至放射学平台，并放置在机器人载物台的固定床上。将小鼠的口部放入鼻罩式麻醉杯中，门齿卡入咬合固定器内。将小鼠平放在固定板上。若小鼠仍无反应，用纱布胶带将其固定。通过轻拉耳朵使头部与水平面保持齐平。当小鼠处于正确位置后，关闭铅制防护罩。现在使用放射学平台的内置软件获取计算机断层扫描图像，以获得小鼠三维解剖结构的扫描结果。检查头部是否与水平面平行。如果未达到，继续调整小鼠头部位置，直至满足要求。现在从CT图像中确定感兴趣区域（ROI），以通过CT成像观察腹侧基底下丘脑。按照所列步骤操作X射线管。使用与水平面成45度角的方法，计算从感兴趣区域（ROI）到颅骨表面的距离。使用设备自带软件，从上方拍摄小鼠的X光图像。然后将小鼠从放射成像平台上移除。将其放置在加热垫上，并持续监测直至动物恢复活动。根据冠状位CT图像，计算至少三只小鼠的平均ROI解剖深度，以确定给药剂量。例如，在之前一项研究中，向腹侧基底丘脑给予10 Gy的I辐射，从颅骨以45度角测量的ROI深度为0.66厘米。一旦确定该数值，使用剂量规划软件计算出针对目标区域（ROI）所需剂量的适当旋转角度、速度和照射时间。接着测量所计算参数的剂量分布。将三片GAF染色放射敏感薄膜嵌入等效水塑料仿体小鼠中。将它们置于四块垂直堆叠的水等效塑料模块之间。将模拟小鼠放置在机器人载物台上，并使用新计算的参数运行焦点照射光束。在此示例中，对腹侧基底下丘脑进行10 Gy剂量的辐射。照射后，通过胶片检查360度旋转角度下靶向腹侧基底下丘脑锥形束的剂量分布模式和强度。辐射在ISO中心上方的胶片上产生一个暗环，在ISO中心处的胶片上形成一个微小而清晰的斑点，并在下方的胶片上形成一个较亮的环。现在将ISO中心的GA FCH铬酸胶片叠加在X射线上。照射焦点在ISO中心处应与后续所需的ROI区域重叠。可通过可视化双链DNA断裂的标记物来评估照射束在组织中的准确性。在确认照射束的校准和靶向满意后，继续进行实验。本示例中，五周龄的C57BL/6J雌性小鼠在处理前接受一周的高脂饮食。治疗前一天，对小鼠进行称重，并分为两个体重无显著差异的队列。治疗当天，重新称量小鼠体重，然后将两只小鼠轻轻转移至放射学平台，其中一只属于实验组，另一只为对照组，并对其进行麻醉。同时将加热垫调至低档，用于术后保温。按照先前所述方法准备小鼠以接受照射。在治疗过程中，将假手术小鼠置于靠近CFIR平台的麻醉舱内，以纳入环境辐射可能产生的影响。在CT上确定靶点后，通过机器人控制将小鼠移动到位，使靶点与射束对齐。然后输入计算好的剂量设定并进行辐射照射。照射结束后，将两只小鼠置于加热垫上，并监测直至其苏醒。所有小鼠完成照射后，需每天观察其状态，并每周称重两次。治疗后三天，为确认照射效果，于一个月后给予腹腔注射BRDU。通过BRDU及神经元标记物鉴定细胞中的神经发生。使用GAF铬酸盐测量剂量分布。嵌入模拟小鼠体内的辐射敏感膜。辐射锥形束的半高全宽为2.31毫米。焦点处的光束展示了来自不同方向光束的精确对准。该影像可叠加在真实小鼠受试者的X光片上，以显示射束的位置和精确度。若仅依靠解剖标志无法准确定位目标区域，可注射鞘内碘造影剂以增强定位效果。在A-C-F-I-R放射学平台上获取的CT扫描图像中，可清晰观察到侧脑室和第三脑室，从而进一步确认CT引导下对下丘脑区域的靶向定位。通过检测双链DNA断裂后γH2AX的染色情况，可观察到光束在组织中的定位，结果显示靶向精确，光束边缘极为清晰。采用类似立体定向的弧形照射方式，即从垂直方向倾斜45度角进行弧形照射，可有效靶向腹侧基底下丘脑，同时避免对其他神经发生 niche 区域的照射。通过给予成年小鼠高脂饮食，研究了辐照对神经发生的影响。与假手术处理的对照组相比，神经发生大约被抑制了85%。而在辐照部位邻近的结构中，辐照动物与假手术对照组之间无统计学上的显著差异。治疗前食用高脂饮食的辐照小鼠，其治疗后的体重增加低于假手术处理组。相比之下，食用普通饲料的对照组小鼠，其神经发生水平显著低于食用高脂饮食的小鼠，但在假手术组与辐照组之间体重无显著差异。此外，辐照后高脂饮食小鼠的体重增长减少伴随着代谢和活动水平的变化，一旦掌握。如果操作得当，每只小鼠的该技术操作时间大约为15分钟。但请务必注意，接触辐射可能具有极高危险性，在进行本实验操作前及操作过程中，必须采取适当的防护措施，例如使用铅屏蔽装置、辐射检测仪，并接受规范的辐射安全使用培训。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成人下丘脑神经发生局灶性放射性抑制功能审讯

该视频展示了一种免疫荧光染色方法，用于检测成年海马体中的神经发生。首先，对小鼠脑切片进行处理，使用针对神经前体细胞中与神经发生相关的标志蛋白的一抗孵育。接着，用带有荧光染料标记的二抗进行标记。然后在共聚焦显微镜下观察脑切片，根据不同的标志蛋白组合表达模式，区分各种前体细胞亚型。...

一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内...

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。...

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

本文描述了调控和分析NF-κB依赖性成年海马神经发生的实验方法。提供了一种详细的实验方案，用于检测小鼠认知功能的齿状回依赖性行为学测试（称为“空间模式分离-巴恩斯迷宫”）。该技术也有助于在其他实验条件下开展相关研究。...

NF-κB依赖性成体神经发生的调控与分析方法

深部脑刺激（DBS）手术治疗作用背后的机制仍需进一步研究。本文所述方法介绍了一种实验性方法，通过分析可能促进DBS术后神经发生的候选基因的基因表达谱，来探讨DBS所触发的细胞事件。...

丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马区基因表达变化的分析

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos...

一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

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可调节角度的立体定向方法用于多种神经科学技术

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

本文介绍了一种在体外培养中生长特定下丘脑细胞亚型的实验方案。这些细胞可根据适当且独特的膜表面标志物进行筛选，并可用于多种实验应用，包括免疫荧光、电生理学以及生物化学检测。...

分离特定下丘脑神经元用于激素、代谢和电生理调控研究

了解利用计算机断层扫描引导的三维成像技术对小动物模型进行局灶性放射照射以抑制成人下丘脑神经发生的方法。该技术可精准靶向特定神经前体细胞群，为研究神经发生功能提供重要工具。

功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析

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