Name: 纳米力学的药物靶标相互作用及耐药性检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学习使用悬臂传感器技术定量检测细菌耐药性，通过测量药物与细菌靶标结合时的机械变化来评估抗菌效果。该方法为药理学研究提供直接测量纳米力学力的新工具，有助于加速新型抗菌药物的开发进程。

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Joseph W. Ndieyira 获得工程与物理科学研究委员会（EPRSC）、纳米技术跨学科研究中心（IRC）、皇家学会（RS）以及Biano咨询公司（BNC）的支持。我们感谢Alejandra Donoso Barrera、Dejian Zhou、Manuel Vögtli、Matthew Batchelor、Matthew A. Cooper、Torsten Strunz、Trevor Rayment 和 Gabriel Aeppli 提供的有益讨论。

1. 悬臂梁的制备
<ol>
	<li>使用聚四氟乙烯镊子将选定数量的悬臂梁芯片（每个悬臂梁尺寸为500 μm长、100 μm宽、0.9 μm厚）浸入新配制的piranha溶液（H₂SO₄:H₂O₂体积比为1:1）中2SO4 和 H2O220 分钟</li>
	<li>大约20分钟后，将悬臂芯片从piranha溶液中取出，用去离子水彻底冲洗，并立即转移至新配制的piranha溶液中。重复步骤1.1&#160;如果芯片上有污点，则需进行上述处理，否则进入下一步。</li>
	<li>在去离子水中彻底清洗后，用纯乙醇冲洗，并将悬臂梁芯片置于75 °C的加热板上烘干，以去除任何残留的水分。使用光学显微镜检查芯片，确认其清洁度。</li>
	<li>将清洗后的悬臂芯片转移至蒸发腔室并抽真空，目标是达到10⁻⁶ Torr的真空度。-7 mbar</li>
	<li>当达到所需的真空压力后，先在每个悬臂阵列的一侧镀上2 nm的钛层作为粘附层，然后再镀上20 nm厚的金层。为确认镀层厚度，需使用置于目标源正上方的石英晶体监控仪进行监测。</li>
	<li>将镀金悬臂梁传感器芯片留在腔室内，在真空条件下冷却1-2小时后再打开。</li>
	<li>将新近蒸镀的芯片转移至充满氩气的真空储存容器中，以防止任何形式的污染。</li>
</ol>
2. 悬臂梁芯片的功能化
<ol>
	<li>首先，根据 250 μm 的悬臂梁间距尺寸，将微毛细管排列在功能化平台上2。</li>
	<li>然后注入 2 mM 的乙醇硫醇溶液，其中含有表面靶分子，即细菌胞壁酸肽（D-Ala 和 D-Lac），以及一种以三乙二醇末端的烷基硫醇（PEG），后者已知可抵抗生物分子吸附16。每根毛细管中应随机分配不同的表面捕获分子，以避免操作者偏倚。</li>
	<li>接下来，将悬臂梁在装有含表面捕获分子硫醇溶液的微毛细管中孵育 20 分钟。确保各表面捕获分子的溶液仅局限于每个独立的悬臂梁传感器上，以避免或最小化交叉污染。若该步骤操作正确，可使新制备的金镀层悬臂梁系统性地转变为化学活性传感器，即在金镀层表面形成自组装单分子层（SAM），使细菌胞壁酸肽靶分子作为受体固定于其上。</li>
</ol>
3. 溶液配制
<ol>
	<li>将0.1 M的单碱和双碱磷酸钠盐溶解于超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）中，并混合至pH值为7.4。</li>
	<li>向缓冲溶液中加入0.002%的PS80，以减少药物分子与玻璃器皿非特异性相互作用引起的聚集效应。</li>
	<li>用新鲜配制的缓冲溶液将药物稀释至所需的不同浓度，以便计算Kd。</li>
	<li>使用0.2 μm滤器过滤 freshly prepared 药物溶液，并在室温下超声处理5分钟，随后用氩气吹扫。</li>
	<li>采用全血清重复上述操作，将药物加入缓冲血清中，轻轻涡旋震荡15分钟，并额外再持续5分钟，以确保完全溶解。</li>
</ol>
4. 表面应力检测
<ol>
	<li>将功能化悬臂梁传感器芯片装入液体流动池室中。</li>
	<li>将激光光斑对准每个传感器的自由端，并通过将液体室加热1 °C来确认对准效果。由于硅和金的热膨胀系数不同，产生双金属效应，全部八个镀金悬臂梁传感器阵列应出现向下的压缩弯曲。</li>
	<li>加热约10分钟后，让悬臂梁再冷却10分钟。</li>
	<li>计算各个悬臂梁传感器在最大弯曲信号处的弯曲变化，若弯曲信号的相对标准偏差≤5%，则认为对准效果理想；否则需重复上述过程。</li>
	<li>随后，测量全部八个悬臂梁的共振频率，以计算其弹簧常数。若同一芯片内各悬臂梁传感器的弹簧常数差异≤1%，则认为该芯片具有均匀的机械性能；否则应更换悬臂梁传感器芯片。</li>
	<li>接下来，通过六通阀使用流体系统（Model Genie Plus）在流动池内实现液体交换，同时使用自动化的LabView软件进行数据采集。</li>
	<li>为监测悬臂梁弯曲数据，采用以下测量方案：i) 注入缓冲液或不含药物的血清作为对照，持续5-30分钟以建立基线；ii) 注入药物溶液30-60分钟；iii) 注入10 mM HCl清洗液10-60分钟，以解离结合的药物复合物；iv) 最后再次注入缓冲液清洗30分钟，以再生表面肽并恢复基线信号。务必确保所有信号均在恒定流速30-180 μl/min&#160;和温度控制柜内固定温度25 °C的条件下采集。</li>
	<li>应采用单个位置敏感探测器，通过串行时间多路光学束方法监测全部八个悬臂梁的绝对弯曲信号。</li>
	<li>为分析每种药物浓度下的弯曲信号，需利用Stoney方程将测得的差分弯曲转换为悬臂梁上下表面之间的差分应力。</li>
</ol>

<ol><li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li>
<li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li>
<li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+of+prostate-specific+antigen+%28PSA%29+using+microcantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li>
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<li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突

这些结果表明，微悬臂阵列传感器具有足够的灵敏度，能够检测并量化药物-靶标结合相互作用的变化，尤其是在万古霉素耐药性中，由于药物结合口袋中单个氢键的缺失所引发的变化。我们展示了对Van达到纳摩尔级别的检测灵敏度，与先前的表面等离子体共振（SPR）研究结果18,19一致，并揭示了该微悬臂方法能够在临床实践中常规应用的相关浓度下，直接检测和量化血液中的药物分子。我们的数据表明，差分表面应力可用乘积形式的方程（1）来描述，即：（i）一个描述特异性药物-靶标结合事件的化学项，以及（ii）一个描述化学反应表面位点之间机械连接性的几何项，这意味着局部化学相互作用与微悬臂的整体机械相互作用是解耦的。其中化学项由经典的朗缪尔吸附等温方程给出，而几何项则揭示了药物-靶标诱导表面应力变化的渗流机制。检测到微悬臂差分弯曲所需的临界阈值pc ~10%（图5），表明当相对较大比例的表面被抗生素分子占据时，表面应力才会发生集体转导。当p≥pc时，化学转化表面位点之间的机械连接逐步建立，纳米力学网络节点间的短程排斥相互作用（如空间位阻效应）导致整个微悬臂向下弯曲程度逐渐增加。我们推测，所提出的纳米力学渗流模型可能在真实细菌中糖肽类抗生素的作用机制中发挥重要作用。这些发现突显了微悬臂技术在研究抗生素作用机制方面的高灵敏度，代表了一种新颖的研究工具，有助于从纳米尺度深入理解抗生素的作用机理，从而推动强效药物的发现，以应对超级细菌感染带来的挑战。为了使微悬臂系统能够实现可重复且高灵敏度的测量，我们在实验方案中针对一系列关键环节进行了优化，特别是微流控池中的样品加载步骤及标准操作流程，以实现定量的纳米力学检测。
悬臂技术相对于现有方法的重要性
总之，我们指出，尽管该技术在25年多以前就已提出，但由于缺乏对医学相关靶标的细致且重复的测量，尚未进入临床应用。本文展示了利用纳米机械悬臂研究抗生素对细菌细胞壁靶标产生的机械影响以及检测抗菌耐药性的相关实验流程。传统的药物筛选方法通常需要对报告分子进行荧光或放射性标记，以检测分析物与其靶标之间的结合，常结合竞争性结合实验、酶促结合实验或蛋白检测进行20。生物分子的标记不仅耗时且昂贵，而且标记物还可能通过阻断结合位点干扰分子相互作用，导致假阴性结果。此外，荧光化合物通常具有疏水性，可能导致非特异性背景结合并产生假阳性。由于这些局限性，人们日益关注新型无标记技术，这类技术几乎可对任何分子复合物进行筛选，且所需检测方法开发工作极少。目前最成熟的无标记表面技术是表面等离子体共振（SPR）和石英晶体微天平（QCM）。与SPR测量介电常数不同，无标记悬臂技术可检测配体-受体相互作用所产生的表面应变，从而直接测量配体与表面受体特异性结合时产生的纳米级机械力。这类传感器的独特之处在于，其灵敏度并不依赖于分析物结合引起的质量变化所导致的介电性质改变（如SPR和QCM），而是依赖于微小的平面内表面应力变化，使该技术特别适用于在临床相关抗生素浓度（3–27 μM）下研究药物分子的纳米力学特性17。悬臂技术还特别适用于在生理条件下（包括复杂环境）检测小分子（如DNA片段和药物），而这正是制药工业的主要基础，因此该技术将在药物发现中发挥互补作用。悬臂技术已成功应用于基因组学3,5、气体传感21、蛋白质组学22和药物研究1等领域。此外，悬臂采用低成本硅基技术制造，且因其与微加工工艺兼容，可实现微型化，从而提高灵敏度，并可并行集成至大型传感器阵列，用于多药物化合物筛选和高通量、信息丰富的检测分析。仪器设备与实验设计的进一步改进将实现实时分析多种相互作用，有助于推动新一代超级药物的研发，以应对多重耐药性感染带来的挑战。
方案中的关键步骤
建立可靠的测量方案对于该技术的应用至关重要。为了获得令人满意的定量药物-靶标测量结果，并确定在缓冲液或血清中可检测到的最低抗生素浓度，本研究针对方案中的关键步骤进行了优化。首要任务是调节和优化表面捕获化学体系，以提高悬臂梁检测的特异性和灵敏度。不可否认，表面应力转导是一种集体效应，需要表面有相对较大比例被覆盖，才能在化学反应区域之间建立连通性。我们发现，通过调节底层表面肽的密度，存在一个临界阈值，即当肽密度达到约p ≥10%时，表面应力随肽密度增加而显著变化；低于该阈值则无明显应力响应（图5）。实验设计时必须考察悬臂梁上应力分布的均匀性，以确保获得最大信号偏转，实现高灵敏度测量。此外，还需建立高效的表面再生方案，从而支持多次循环测量，降低每次检测的成本。在使用硫醇化疏水末端构建受体表面时，受体分子的取向及其分子间距至关重要，这有助于分子间通过范德华相互作用实现致密的自组装排列，从而最大限度减少非特异性结合。同时，捕获分子应包含聚乙二醇（PEG）连接臂，使传感基质部分具有亲水性，防止分析物溶液中的分子直接与未包被的金表面发生反应。PEG连接分子还应起到间隔作用，降低空间位阻，从而使溶液中的分析物能够特异性地与表面受体结合，引发可测量的表面应力变化。悬臂梁阵列传感器必须至少包含一个原位参考测量通道，所显示的实时信号为差分偏转值，即通过从传感悬臂梁的绝对偏转中减去参考悬臂梁的偏转获得。因此，参考悬臂梁对于校正非特异性相互作用（如温度变化、折射率变化或悬臂梁非功能化底面的相互作用）至关重要。优化流速（约30–150 μl/min）是方案中的关键步骤，因为它可确保液体高效交换以及溶液物质充分稳定的质量传递。液体池的设计应具备最优体积（5–80 μl），以支持高流速，实现完全的液体置换，克服质量传递限制。在进行动力学测量时，流速尤为关键23。大体积液体腔室需要不可控的高流速，导致样品用量大幅增加，从而不必要地提高检测成本。此前，我们曾采用重力驱动流动将不同样品注入测量液室。重力流的优势在于无需机械部件，因此不会向系统引入额外噪声。然而，其显著缺点是仅在相对较高的流速（约200 μl/min）下才能稳定工作。显然，较低的流速（≤1 μl/min）虽可减少单位时间内的样品消耗，但会使反应速度显著减慢，因而需要更长的接触时间。此外，重力流的流速变异性较大，因其依赖于进样口与出样口之间的液面高度差，而该高度差会随着实验过程中样品溶液的消耗而逐渐减小。为避免重力流带来的问题，应使用注射泵。注射泵的优势在于可在长时间内维持恒定流速，使实验在更可控的环境中进行。
本实验方案的局限性
使用悬臂梁传感器获得可重复且特异性生物检测的主要挑战在于确保每次检测中受体层的性质在生物化学上均具有&#34;活性&#34;并保持均匀。实验成功的关键在于采用标准化的清洗和固定化方案，对传感器芯片进行仔细的预处理，并利用连接分子化学技术使受体分子以活性构象定向排列。在我们目前的实验设置中，使用小型玻璃毛细管对悬臂梁阵列进行功能化，这种方法可能存在一些缺点，并在某些情况下带来问题。这些玻璃毛细管两端开放，因此样品溶剂容易蒸发。例如，如果功能化步骤的温度未能精确控制，特别是在使用乙醇等挥发性溶剂时，蒸发速率在不同时间点可能会显著变化。此外，由于感测液体必须依次加入毛细管中，不同悬臂梁之间的孵育时间也可能出现轻微差异。毛细管功能化的另一个限制因素是无法确保悬臂梁每次插入毛细管的方式完全一致。另外，有时为了防止交叉污染（因为液体样品可能流到芯片本体上），必须将悬臂梁从毛细管中略微抽出。我们可以通过采用喷墨点样仪作为替代的表面涂覆方法来解决这些问题。虽然喷墨点样可实现对样品涂覆的精确控制，并具备扩展至大规模阵列的潜力，但最常见的缺点是沉积在悬臂梁上的微小液滴可能在数秒内蒸发，因而需要受控的湿度环境。因此，孵育时间难以灵活调节，而这对某些应用可能是必要的。样品体积、孵育时间与蒸发速率等因素之间的微妙相互作用会直接影响悬臂梁暴露于功能化样品的程度，因此必须谨慎优化悬臂梁检测中的表面化学条件，因为受体分子密度的任何微小变化都会对悬臂梁的响应产生显著影响。
实验设计的修改（即 替代性技术或材料）
为克服悬臂梁技术未来发展过程中获得可重复涂覆工艺的主要难题，需要采用不同的策略，利用集成于微流控通道中的悬臂梁。其构想是设计特殊的悬臂梁芯片，使每个悬臂梁置于独立的通道内，以实现在线检测 原位 针对通道进行单独寻址的功能化流程。这些实验设计的改进可使包被过程在受控且封闭的环境中进行，通过孵育时间和流速精确监控溶剂暴露，从而实现捕获分子在悬臂芯片上的自动化固定。相同的通道随后可用于实际结合实验，使所有悬臂同时暴露于同一种分析物溶液中。除了悬臂功能化流程外，悬臂的信号读出机制也需要改进。光束偏转法具有高灵敏度，已在原子力显微镜（AFM）技术中成功应用多年。然而，对于独立式悬臂传感器应用，光学读出存在若干缺点：例如无法在不透明液体（如血液）中进行测量，激光阵列的对准过程耗时且繁琐，当前配置无法区分倾斜与垂直方向的偏转。因此，未来悬臂技术的发展必须考虑通用传感器设计的各个方面例如 悬臂梁几何结构）以及悬臂梁读出装置，以实现在野外和实验室环境中可靠的测量方案。Manalis 及其同事22 已开发出新型中空悬臂传感器，这类悬臂梁内部嵌有微流体通道，使器件可在真空中以高品质因子运行。在此模式下，悬臂梁充当微天平22因此，无需再使两侧在功能化上存在不对称性，捕获分子可直接通过物理吸附或共价结合的方式固定在硅表面，通常使用自组装单分子层（SAMs）或硅烷化试剂实现。24悬臂梁还可修饰一层薄聚合物，随后将该聚合物与抗体偶联。25 用于生化传感。
问题排查
悬臂梁测量中常见的问题之一是在微流控流动池中引入气泡。安装芯片时必须小心，确保在将液体注入液池的过程中不引入任何气泡。信号漂移是另一个由样品温度差异引起的问题。在进行测量之前，必须使悬臂梁达到平衡状态以确保稳定。所有缓冲液、分析物和再生溶液都应与悬臂梁仪器存放在同一房间内，以保证所有溶液温度一致。尽管注射泵能够提供非常精确且极低的流速，但它通常会在悬臂梁测量中引入机械噪声。因此，设计一种简单而有效的降噪装置对于避免偏转信号中不必要的噪声至关重要。该降噪装置由一个位于注射泵与液池之间的微小液体储液器组成，可吸收来自泵的机械振动。由于光学探测器具有高度敏感性，理想情况下应在封闭环境中运行悬臂梁测量系统，以防止杂散光干扰光学读出系统。此外，如果在悬臂梁上进行过多的清洗步骤，传感层的质量可能会显著下降，从而限制传感器芯片的使用寿命。
掌握此技术后的其他或未来应用
末端带有氨基或羧基的自组装单分子膜（SAMs）涂层悬臂梁可用作pH传感器。这些功能化末端基团会根据溶液pH值的变化发生质子化或去质子化，从而产生表面电荷，导致悬臂梁发生弯曲24。由于悬臂梁传感器能够追踪与活菌细胞壁失稳相关的药物-靶标相互作用1,6,7，因此将有助于寻找并开发新一代抗生素，以应对耐药性感染问题。未来，悬臂梁还可作为微天平，用于测量单个细胞的质量和生长速率26。该技术将有利于研究细胞对不同生长因子或药物的响应，同时为多种生物标志物的快速检测提供一种新颖工具，在医学诊断和即时检测（point-of-care）应用中具有重要意义。鉴于悬臂梁传感器具有多功能性、体积小和稳定性强等优点，它们有望成为监测有害环境因素的高灵敏度装置。此类传感器已在检测从实验室和工业生产单元泄漏到环境中的有毒有害气体（如氢氟酸27或氰化氢28）方面展现出优异的灵敏度。

分子识别范式是生物学和医学众多领域的基础。例如在药理学中，其目标是通过靶向生化过程中的关键参与者（如催化细菌细胞壁肽交联的转糖基化或转肽化反应），干扰致病通路。因此，药物设计可归结为寻找一种合适的分子，以靶向特定的细菌结合位点并实现精确匹配。万古霉素（Van）便是成功应用该策略的经典范例，它靶向肽聚糖细胞壁——这是细菌的一种保守结构特征。在新生的革兰氏阳性菌中，肽聚糖基质包含以赖氨酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸序列结尾的肽链，这些肽链通过一种C55脂质连接子锚定在膜上8-10，文中将此结构简称为D-Ala。这些暴露于肽聚糖前体上的肽链对于细菌细胞抵抗严苛环境力具有重要的机械保护作用；更重要的是，它们不存在于人类细胞中，因此是抗生素药物的理想靶点。Van特异性地结合细菌细胞壁肽的C末端，形成一个中等强度的Van-肽复合物，如图1所示。这种Van与暴露肽链之间的相互作用阻断了转肽酶和转糖基化酶的活性，而这些酶负责催化细胞壁的交联反应1，从而有效阻止细胞壁交联，导致细菌细胞在纳米力学层面变弱，最终因破裂而死亡1,6,7。
耐万古霉素的出现 肠球菌 耐万古霉素肠球菌（VRE）正日益成为医疗保健领域的一个突出问题11 并且由于细菌耐药性在 肠球菌 由于酰胺键向酯键的微小转变而产生8，这种细菌表面看似简单的结构变化，实际上使其失去一个氢键 Van与结合位点的对接，并随之对结合口袋进行后续修饰。重要的是，该过程会改变万古霉素敏感菌中存在的五肽末端丙氨酸 肠球菌 （VSE）至赖氨酸-丙氨酸-乳酸10,12，此处称为 D-乳酸，从而显著减少 范-D-Lac 结合亲和力降低三个数量级，导致 Van 对……治疗无效 肠球菌 感染1因此，耐药细菌的 alarming 增长正推动着新型策略的发展，以加速或恢复抗菌剂的抗菌活性，或促进针对多重耐药细菌感染的更高效药物的发现。
我们采用悬臂梁进行的实验受到细胞等系统的启发，这些系统能够将化学能转化为运动。悬臂梁传感器将化学能转化为机械运动的能力使其成为独特的探针，在实时监测细菌细胞壁靶标机械扰动方面具有显著优势。悬臂梁传感器无需报告“标签”，生物分子可在单步反应中被快速检测。它们可在生理环境（如缓冲溶液和全血清）中并行筛选多种药物。此外，悬臂梁技术采用原位（in&#160;situ）参比进行差分测量，从而能够特异性地检测药物-靶标相互作用；并且由于其通过标准半导体加工工艺制造，易于实现大规模生产和高通量并行筛选，每小时可检测数千种药物。特别是多悬臂梁传感器阵列是研究万古霉素（vancomycin）耐药性的有力工具——因为万古霉素耐药本质上是一个力学问题1,6,7。通过监测药物-靶标结合相互作用在临床上相关应力下的变化，可检测模型细菌细胞壁靶标与溶液中Van之间的反应。表面反应产生的应力表现为悬臂梁弯曲信号，通过激光束照射传感器进行光学分析。此外，通过在悬臂梁传感器表面定制修饰细菌表面靶分子的敏感涂层，可近乎无限地监测多种分析物（Van）存在下的特异性生化相互作用以及模型细菌细胞壁基质的生物力学行为。除分子识别事件外，还有多种因素可能导致悬臂梁传感器发生偏转，包括温度变化、非特异性结合或溶液折射率的改变。为消除非特异性信号的影响，需进行原位（in&#160;situ）差分测量，即持续监测检测悬臂梁和参比悬臂梁的弯曲情况，以分析特异性相互作用。此外，悬臂梁传感器的检测灵敏度依赖于表面化学性质和几何结构，可通过调节表面分子密度 p 来提高（其中 p 定义为捕获分子所占表面积与悬臂梁顶部总分子群体覆盖的整个表面积之比，该比值由X射线光电子能谱（XPS）测定1）。
本方案详细描述了如何利用无标记悬臂梁技术，在缓冲溶液和血清中检测万古霉素或其他抗生素与细菌细胞壁前体类似物&#160;（黏肽）在临床相关浓度下的结合。实验采用新鲜的金表面，因为自组装单分子层（SAMs）易于在洁净的金表面形成稳定的结构13,14。SAMs通常由短链分子构成，其一端为硫醇基团，可共价结合于金表面，而另一端则带有目标捕获单元，能够自由地与溶液中的分析物靶标相互作用。硫醇体系具有良好的灵活性，尤其因为市场上可获得多种带有不同化学末端基团的硫醇化合物，或可在实验室中方便地合成。然而，需注意确保含硫醇基团的分子具有正确的末端基团；例如，在蛋白质或肽偶联反应中，氨基应朝向内侧，以便与固定在表面的硫醇基团上的羧基发生反应。本研究中，硫醇分子直接与细菌细胞壁靶标——脂质II的三肽模拟物——通过固相合成法偶联，所用材料为市售预载的Wang-D-Ala 和 Wang-D-Lac 树脂，并采用标准的Fmoc保护基化学方法15。尽管本文描述主要针对万古霉素，但该方法显然可推广至其他抗生素，诚邀来自生物化学、药理学和材料科学等不同领域的研究人员广泛采用本方案开展各自的研究工作。

<table><tbody><tr><td>感应器</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>已停产</td></tr><tr><td>六通阀</td><td></td><td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>可实现多浓度进样</td></tr><tr><td>电子束蒸发仪</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, UK</td><td>优选电子束蒸发，以避免热加热导致悬臂梁变形的问题</td></tr><tr><td>储存容器</td><td></td><td>Agar Scientific, UK</td><td>保持镀金薄膜的新鲜度</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td></td><td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td><td>用于悬臂梁阵列的毛细管功能化</td></tr><tr><td>泵</td><td></td><td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td><td>适用于微流控通道中液体样品的可控流速</td></tr><tr><td>0.2-4.5 &amp;mu;m 滤膜</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>用于样品过滤</td></tr><tr><td>悬臂梁芯片</td><td></td><td>伦敦纳米技术中心（LCN）</td><td>高灵敏度</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>用于配制缓冲溶液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>用于配制缓冲溶液</td></tr><tr><td>聚山梨酯80（PS80）或吐温80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>用于缓冲溶液中，防止玻璃器皿表面的非特异性相互作用</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td><td>用于溶液配制</td></tr><tr><td>全血清</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td><td>用于模拟生理条件的测量</td></tr><tr><td>万古霉素（Van）</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>所用药物</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>用于玻璃器皿的清洗程序</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>用于玻璃器皿的清洗程序</td></tr><tr><td>D-丙氨酸和D-乳酸</td><td></td><td>伦敦纳米技术中心（LCN）</td><td>涂覆在悬臂梁表面的受体，用于检测药物-靶标相互作用</td></tr><tr><td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td><td>用于仪器接口的软件，实现可控测量</td></tr></tbody></table>

药物靶点相互作用的纳米力学与抗菌耐药性检测

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

悬臂梁传感器作为一种换能器，可检测固定在其表面的模拟细菌细胞壁基质与溶液中抗生素药物之间的反应，在生化传感应用中展现出前所未有的高灵敏度和特异性1-5。药物与靶标之间的相互作用产生表面应力，导致悬臂梁发生弯曲，当激光照射时，该信号可通过光学方法进行分析。利用纳米级精度测量的表面应力变化，可实时追踪模拟细菌细胞壁靶标生物力学的破坏过程。尽管该技术具有显著优势，但多悬臂梁传感器阵列至今尚未被用于量化药物-靶标结合相互作用。
本文报道了使用涂覆有烷基硫醇自组装单分子层的硅基多悬臂梁阵列，该单分子层可模拟细菌细胞壁基质，用于定量研究抗生素结合相互作用，以阐明万古霉素对细菌细胞壁结构力学性能的影响1,6,7。&#160;我们建立了一个新模型1，该模型提出悬臂梁弯曲可由两个独立因素描述：i）化学因素，由经典的朗缪尔吸附等温线给出，据此可计算热力学平衡解离常数（Kd）；ii）几何因素，本质上是衡量细菌肽类受体在悬臂梁表面分布方式的参数。通过肽受体表面分布密度（p）来研究几何构型与配体负载量的依赖关系。结果表明，p ~10% 是一个关键阈值，低于该值则无法检测到弯曲信号，而高于此值时，弯曲信号几乎呈线性增加，&#160;揭示出应力是局部化学结合因子与几何因子的乘积，并通过反应区域的机械连通性耦合，为设计高效抗超级细菌感染药物提供了新的范式。

利用纳米级精度测量单个氢键缺失所引起的应力变化，以前所未有的灵敏度实时追踪模式细菌细胞壁生物力学的破坏过程图 2a-d）。药物检测灵敏度的下限为 范 通过逐步连续稀释其浓度进行研究 1,000 μM 降至≤10 nM，表明10 nM（约15 ng/ml）为可检测到的最低浓度，此时差分弯曲信号平均值约为-9±2 nm图 2c）。进一步在临床相关浓度范围（3-27 μM17注射后 7 μM 范 在血清（90% 胎牛血清加 10% 磷酸钠缓冲液，pH 7.4）中，在所有悬臂梁的相同条件下，差分信号为 DAla 在血清中 105±4 nm，而对于 DLac 涂覆悬臂梁，未观察到弯曲现象（图3）。观察到的显著弯曲信号对于 DAla 涂层（万古霉素敏感）悬臂梁的变化是由强烈的药物-靶点结合相互作用引起的。然而对于 DLac 包被（耐万古霉素）悬臂梁，万古霉素结合口袋中氧孤对电子与还原态NH键之间的基态排斥作用10,12 导致药物与靶标结合相互作用减弱，从而引起悬臂梁弯曲减少或无弯曲，尤其是在较低万古霉素浓度下（图3）。然而，对于高浓度万古霉素，我们观察到可测量的弯曲信号 DLac此外，我们的实验设计对于 原位 参考所有悬臂梁均涂覆有两者的位置 DAla 和 DLac 同时实时暴露于相同的分析物中。
为了理解化学和几何结构的精确作用，我们设计了一个模型1，用于描述溶剂相互作用与表面力学之间的关联。该模型可得到表面应力：
<img alt="用于配体结合亲和力分析的静态平衡方程 Δσ_eq，包含 Van [Van] 和 K_d 项。" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1">，当 p &gt; pc 时成立，否则为零（1）
公式（1）中的第一项为 Langmuir 吸附等温式，用于描述药物-靶标结合事件；第二项为幂律形式，用于描述受应力网络形成的大尺度力学效应。a 表示当所有可及结合位点均被占据时的最大表面应力，Kd 为悬臂梁上的表面平衡解离常数。如图4所示的分析结果为公式（1）的全局拟合结果，叠加于测得的差分应力信号之上，拟合得到：D-Ala 或 DLac 肽对应的 a 值分别为 ~29.7±1.0 或 14.1±3.0 mN/m，Kd 值分别为 ~1.0±0.3 或 800±310 μM，其中 a 表示所有可及结合位点均被占据时的表面应力度量。通过系统调节肽密度 p，并在抗生素浓度分别固定为 10、100 和 250 μM 的条件下监测应力数据随 p 的变化，从而调节悬臂梁的灵敏度增强效果（图5）。该过程在肽密度固定为 p ~100% 的条件下，重复进行应力随 Van 浓度变化的实验。
<img alt="静态平衡示意图；万古霉素在金表面与dAla/dLac黏肽作用以进行氢键分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 悬臂梁检测抗生素表面结合相互作用。a) 悬臂梁传感器阵列的示意图及其通过纳米力学方式检测药物-靶标相互作用的模式。b) 药物分子（Van）与细菌黏肽类似物（D-Ala 或 D-Lac）之间的化学结合相互作用。c) 万古霉素敏感菌（VSE）通过在结合口袋中缺失一个氢键而获得对万古霉素耐药的机制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="显示在缓冲液中使用 PEG、αLac、αAla 时万古霉素诱导偏转的图表；实验结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 实时追踪模式细菌细胞壁生物力学的破坏。a) 在磷酸盐缓冲液和 250 μM 万古霉素中，D-Ala、D-Lac 和 PEG 涂层悬臂梁的绝对弯曲信号。差分 PEG 参考信号以黑线表示。b) 在磷酸盐缓冲液和 250 μM 万古霉素中，D-Ala 和 D-Lac 涂层悬臂梁的差分弯曲信号。c) 在万古霉素浓度分别为 10 nM（黄线）、100 nM（红线）和 1,000 nM（深红线）时，作为时间函数的剂量依赖性差分悬臂梁偏转信号。d) 在 10 nM 万古霉素存在下，三个 D-Ala 涂层悬臂梁传感器的差分偏转信号随时间变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="差分偏转图：血清中的万古霉素；D-Lac、D-Ala 偏转分析，数据点。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 在7 μM万古霉素存在下，对涂覆有D-Ala和D-Lac的悬臂梁在胎牛血清中模型细菌细胞壁生物力学变化的实时监测。
<img alt="万古霉素浓度与差分应力关系图；药物相互作用效应的数据分析。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 药物-靶标相互作用的纳米力学研究。 该图显示了在溶液中万古霉素浓度 [Van] 不同时，包被D-Ala（黑色圆圈）和D-Lac（红色圆圈）的悬臂梁所测得的差分表面应力响应。数据由公式（1）描述（实线）。1
<img alt="差分应力与DAla表面覆盖率关系图；带误差棒的数据点；应力分析。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 通过研究受体负载量和几何构型对混合单分子层的依赖性，优化受体-配体相互作用的纳米力学检测灵敏度。 悬臂梁传感器测得的差分表面应力响应随D-Ala表面覆盖率p的变化关系，在溶液中万古霉素浓度固定为10 μM（黑线）、100 μM（红线）和250 μM（绿线）时的结果。

获得性抗生素耐药性是公共卫生领域的一个重大问题，目前已被世界卫生组织（WHO）列为对人类生命最大的威胁之一。本文介绍了利用悬臂梁技术定量检测抗菌耐药性的方法，这对于发现针对多重耐药细菌的新型高效抗菌药物至关重要。

悬臂传感器作为一种换能器，可检测其表面固定的模拟细菌细胞壁基质与抗生素药物之间的反应。

本实验的总体目标是测量由药物靶点结合相互作用引起的底层模型细菌细胞靶标力学性质的变化，并量化其抗菌耐药性。该目标首先通过在预先清洁的微悬臂传感器阵列一侧沉积20纳米厚的金膜来实现。第二步是在六个微悬臂传感器上自组装适当的表面靶标，以模拟对抗菌药物敏感和耐药的细菌表型；其余两个微悬臂传感器则组装无关的细菌模型靶标，作为测量对照。接下来，将悬臂梁传感器阵列装入液体流动室中。最后一步是配制具有临床相关浓度范围的药物溶液，并依次将每种药物浓度注入悬臂梁传感器阵列上方。最终，聚焦于悬臂梁传感器阵列自由端的激光束可用于显示由药物靶标结合相互作用引起的表面应力变化所导致的悬臂梁偏转。与现有方法（如表面等离子体共振和石英晶体微天平）相比，该技术的主要优势在于能够直接检测药物与靶点结合相互作用所产生的表面应力，通过测量每种药物与表面靶点结合时引起的具体力-机械力变化来实现。该方法有助于回答药理学领域中的关键问题，例如给药的速度、效率和准确性。通常，初学者会因繁琐的样品校准过程而遇到困难。然而，我们最近创新了一种新的读出机制，该机制无需初始样品对准，未来该方法的使用将更加简便和用户友好。首先，使用一对聚四氟乙烯镊子将悬臂芯片浸入新配制的parama溶液中20分钟。本实验所用的悬臂长度为500 µm，宽度为100 µm，厚度为0.9 µm。20分钟后，取下悬臂，并用去离子水彻底冲洗。使用光学显微镜检查清洗后的芯片是否存在杂质。将仍有灰尘或污物残留的芯片重新放入新鲜的piranha溶液中，继续处理20分钟。在去离子水中彻底清洗后，用纯乙醇冲洗芯片，并在75摄氏度的加热板上干燥约30秒，以去除任何残留的水分。然后使用光学显微镜再次检查，确认其清洁度。将清洗后的悬臂芯片转移至装有钛和金源的蒸发腔室中。抽真空至达到1×10⁻⁷毫巴的真空压力。当达到所需真空度后，用一层2纳米厚的钛对每个悬臂阵列的一侧进行编码。然后设置系统，在钛层上沉积一层20纳米厚的金层，该金层以钛层作为粘附层。使用放置在靶源正上方的石英晶体监控器确认每一层的厚度。达到正确厚度后，将镀金的悬臂梁芯片留在腔室内，在真空条件下冷却一至两个小时，然后再打开腔室。接着，将悬臂梁传感器芯片转移至充满氩气的真空储存容器中，以防止任何形式的污染。悬臂梁芯片可在此处长期储存。然而，若无可用的储存容器，则必须在实验开始前立即使用该芯片。根据250微米的悬臂梁间距，将微毛细管排列至功能化平台的通道中。然后使用玻璃载片对它们进行对齐，并用夹具固定，以防止在实验过程中发生移动。接下来，使用纯乙醇制备由药物敏感型和耐药型细菌细胞壁靶标制成的叶酸化表面受体的2毫摩尔溶液。随后，将独立的悬臂分别放入每个微毛细管中。确保表面捕获分子溶液局限于每个独立的悬臂传感器内，以避免交叉污染。随后，将这些表面捕获分子的混合物随机分配至各微毛细管中，然后向指定的毛细管中注入八微升（8 µL）的表面目标溶液。让悬臂传感器在溶液中孵育20分钟。在此期间，新制备的镀金悬臂梁将通过细菌黏附肽靶标在其镀金表面自组装形成单分子层，从而成为化学活性传感器。首先，将0.1摩尔的单碱和双碱磷酸钠盐溶解于超纯水中，混合以获得pH值为7.4的溶液，并使用0.2微米滤膜过滤该溶液。然后向缓冲溶液中加入0.002%的聚山梨酯80。这将最大限度地减少药物分子与玻璃器皿非特异性相互作用所导致的聚集效应。接下来，使用新鲜配制的缓冲溶液将万古霉素和奥宁稀释至所需的浓度范围（100 皮摩尔至 250 微摩尔），以便计算 KD。涡旋并超声处理样品，以确保药物在缓冲液和血清中完全溶解，从而判断药物作用是否受到血清蛋白的影响。使用相同的药物浓度重复此步骤，但此次将其加入全血清中。同时在混合过程中涡旋震荡血清样品，总时长为20分钟，以确保药物完全溶解。最后，用氩气吹扫溶液，以开始检测悬臂梁表面的应力变化。首先将芯片上八个经过功能化的悬臂梁传感器装入液体流动池腔室中。接下来，将激光光斑对准每个传感器的自由端。通过将液体室加热1°C来确认对准效果。由于硅和金的膨胀系数不同，所有八个镀金悬臂梁传感器阵列都会因双金属效应而发生向下的压缩弯曲。加热约10分钟后，计算各个悬臂梁传感器在最大弯曲信号处的弯曲变化量。若信号的相对标准偏差小于或等于5%，则认为对准结果理想，予以接受；否则，需在重新对准后重复该过程。让悬臂梁在室温下冷却10分钟，以确保达到平衡状态。接着，测量全部八个悬臂梁的共振频率，并计算其弹簧常数。如果各悬臂梁传感器之间的弹簧常数差异小于或等于1%，则接受该标定结果。否则，通过六通阀将悬臂梁芯片传感器连接的流体系统（如图所示的注射泵）连接至已接受的芯片。将系统的流速设定为在30至180微升/分钟之间恒定运行，并将整个系统置于25摄氏度的温控柜中。随后开始单独注入缓冲液或血清（不含药物），以获取持续5至30分钟的对照基线测量值。启动自动化实验室视图软件，以同时采集每个悬臂梁的偏转数据。使用单个位置敏感探测器，通过串行时间复用光束法监测所有八个悬臂梁的绝对弯曲信号。在获得基线数据后，按照测试样品的流程注入药物溶液，持续30至60分钟。注入10毫摩尔盐酸洗涤液10分钟至1小时，以解离任何结合的药物复合物。利用该系统，可实现纳米级精度，并首次达到对单个氢键缺失的超高灵敏度。当肽链末端由D-丙氨酸变为D-乳酸时，万古霉素的结合能力显著降低，导致具有D-乳酸（DLAC）序列的细菌对该疗法产生耐药性。当在不同浓度下测试万古霉素对以D-丙氨酸为末端的肽链的作用时，结果显示万古霉素具有剂量依赖性效应，最低可检测浓度约为10纳摩尔。在具有临床相关浓度（7 微摩尔）的血清中，进一步研究了该系统在生理环境中检测抗生素的能力。在这些条件下，D-丙氨酸包被的悬臂梁仍表现出明显的弯曲，而 DLAC 包被的悬臂梁则没有。利用来自多种药物浓度的数据点，可以建立描述药物靶标结合事件的模型。此处所示的拟合曲线结合了长臂猿的吸收特性、等温线以及描述受力网络形成的大尺度力学效应的参数。一旦掌握，该技术可在数分钟内完成，以确认药物给药的效率和准确性，以及在操作得当的情况下是否存在细菌耐药性的任何迹象。

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科研

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免疫学与感染

纳米力学的药物靶标相互作用及耐药性检测

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裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。...

用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。...

芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

协同药物组合通过实验方法鉴定往往困难且耗时。本文中，我们描述了一种用于鉴定和验证协同作用小分子的方法。...

高通量鉴定协同药物组合的Overlap2方法

在本方案中，我们描述了如何基于Loewe可加性进行成对及三联药物组合的药物相互作用测定。...

测定任意数量药物间协同作用的对角线法

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

本方案描述了如何在一个单一实验中研究四种药物之间所有可能的组合。该方法基于标准的96孔板微量稀释法，并通过计算部分抑制浓度（FICs）来评估结果。...

四重棋盘法：一种用于药物组合研究的三维棋盘法改良技术

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D2O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。...

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

学习使用悬臂传感器技术定量检测细菌耐药性，通过测量药物与细菌靶标结合时的机械变化来评估抗菌效果。该方法为药理学研究提供直接测量纳米力学力的新工具，有助于加速新型抗菌药物的开发进程。

药物靶点相互作用的纳米力学与抗菌耐药性检测

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