Name: 顺行运输Alphaherpes病毒传播的活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 学习使用荧光蛋白融合技术对原代神经元培养物中的Alphaherpes病毒进行活细胞成像，实时追踪病毒颗粒的顺向运输和细胞间传播动态。该方法为神经病毒学研究提供了重要的可视化工具。

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L.W.E. 和 R.K. 的研究得到了美国国立卫生研究院基金 R37 NS033506-16 和 R01 NS060699-03 的资助。M.P.T. 受美国癌症协会博士后研究奖学金（PF-10-057-01-MPC）支持。Matthew Lyman 博士和 Oren Kobiler 博士在显微镜配置和活细胞成像方法设计方面提供的建议与专业知识起到了关键作用。我们还感谢尼康仪器公司的 Neal Barlow 和 Brian T. Kain 在显微镜的采购、安装及性能调试过程中提供的技术支持。

第1节 - 活细胞荧光显微镜的环境控制条件
<ol>
	<li>在进行任何成像实验前30分钟，连接并开始预热显微镜载物台顶部培养箱。
	<ol>
		<li>打开显微镜、透射光和落射荧光光源以及自动硬件控制系统。启动显微镜控制软件NIS Elements，连接显微镜并开始冷却EM-CCD相机。</li>
		<li>将镜头加温器安装至合适的物镜上（60倍或100倍油镜）。注意：根据实验类型选择物镜。100倍微分干涉差（DIC）物镜最适合追踪顺向运输的病毒颗粒组装体，而60倍相差物镜适用于观察顺向扩散。低倍率、非油镜物镜无需使用镜头加温器，因其不与样品直接接触。</li>
		<li>将载物台顶部培养箱安装到显微镜的电动载物台上。确保用于固定样品的适配插件已正确安装。将培养箱控制器的加湿空气管路连接至载物台顶部培养箱的进气口。</li>
		<li>开启培养箱和镜头加温器的控制器，并将温度设定为先前已验证的、针对所用物镜和样品的特定条件（参见讨论部分）。</li>
		<li>打开5% CO2/95%大气混合气瓶的控制阀，向载物台顶部培养箱供应含CO2的气体。气体流速应控制在每分钟60至80毫升。流速过快会导致样品严重脱水，即使使用了加湿腔室也无法避免。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在物镜上添加镜油后，立即将待成像的培养样品放入载物台顶部培养箱中。</li>
	<li>使培养样品在培养箱中至少平衡10分钟。建议平衡1小时，特别是对于第3节所述的过夜成像实验。</li>
</ol>
第2节 - 顺向病毒粒子运输事件的实时成像实验方案
<ol>
	<li>成像前6至8小时，用1 x 10感染一个35 mm玻底培养皿中的成熟离体SCG神经元6 目标病毒的蚀斑形成单位（见 表1 例如病毒）使用 Taylor 所述方法 等 2012a 11若需检测多种病毒，应将接种时间间隔30-60分钟，以便在感染后相近的时间点对相继的样本进行成像观察。</li>
	<li>将培养皿放入载物台培养箱中，至少孵育10分钟后再进行任何实验。在温度达到平衡之前，焦平面会发生漂移，从而对成像实验产生不利影响。</li>
	<li>使用透射光和显微镜目镜，寻找具有明显孤立轴突延伸的神经元胞体。或者，使用适当的荧光照明，寻找表达可检测量荧光蛋白的细胞。在此步骤及后续步骤中，应尽量减少样品暴露于荧光照明，以避免光诱导的细胞损伤以及荧光蛋白的漂白。</li>
	<li>减弱荧光照明，以降低细胞所受激发光的强度。在荧光照明光路中启用中性密度（ND）衰减滤光片。对于持续时间超过1分钟的成像，必须至少使用ND4滤光片，以防止荧光蛋白发生光漂白以及轴突遭受严重的光损伤。通常情况下，使用ND8滤光片即可清晰观察高荧光强度的结构。</li>
	<li>使用显微镜软件（图2 和 补充视频 1A），将光路切换至EM-CCD相机。</li>
	<li>确定每种荧光通道的最佳成像时间与条件。
	<ol>
		<li>使用“播放”按钮启动实时图像窗口。</li>
		<li>确定每种荧光蛋白的最佳相机曝光参数。每个通道的曝光时间不得超过300毫秒，否则将导致快速移动的病毒颗粒结构出现运动伪影。将相机的EM增益设置为300（制造商建议的最大增益值），以缩短曝光时间并增强对微弱信号的检测能力。正确的曝光时间应产生背景强度低而特异性信号强的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置曝光参数并找到轴突形态清晰的区域后，需配置软件以执行自动图像采集。停止实时成像以防止样品发生光漂白。
	<ol>
		<li>在 NIS Elements 软件中，从“Applications”选择 6D - Define/Run Experiment 应用程序" 下拉菜单</li>
		<li>在 ND 采集窗口中，点击“时间”选项卡，以确定图像采集的频率。将间隔设置为“无延迟”，持续时间设置为 5 min。软件将在 5 分钟内以尽可能高的频率采集图像帧。</li>
		<li>选择“Lambda”选项卡，该选项卡允许选择用于多荧光图像采集的预设硬件配置。点击第一个框，然后在随后的下拉菜单中选择合适的硬件配置。对所有待成像的荧光蛋白重复此操作。</li>
		<li>确保取消选中“XY Positions”、“Z-series”和“Large Image”选项卡。</li>
		<li>在选项卡上方，勾选标有“保存到文件”的复选框，以便在采集过程中自动将图像保存至硬盘。设置实验输出文件的存储位置和文件名。进行连续实验时，软件将在指定的文件名末尾自动添加序号。</li>
		<li>所有标签均被选中后，点击“Run-Now”按钮以启动实验。</li>
		<li>通过调整曝光设置和图像尺寸来优化图像采集速率。使用成像区域的一小部分通常可加快帧采集速度。在 NIS-Elements 中使用 ROI 工具定义感兴趣区域，选择占总图像面积 25% 至 50% 之间的区域。或者，缩短曝光时间也可提高帧采集速率，但会降低信号质量（见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3节 - 顺向传播事件的过夜延时成像
<ol>
	<li>成像前4小时，对构建在35 mm μ-Dish上的区室化神经元培养物进行感染。用1 × 106 目标病毒的蚀斑形成单位（参见 表1 例如病毒）使用 Taylor 所述方法 等 2012b 12.</li>
	<li>轻轻将培养皿放入载台式培养箱中。确保物镜位置位于培养皿侧边。缓慢调节物镜至聚焦状态，注意避免物镜向上顶压样品。确定聚焦区域后，缓慢将物镜移至培养皿中央，靠近标记轴突室内侧的内部屏障处。移动过程中需保持焦平面深度不变，避免物镜顶压样品。物镜若使塑料表面发生形变，将损伤轴突及塑料材质。</li>
	<li>在特氟龙环外的培养皿中加入约 2 ml 温热（约 37 °C）的磷酸盐缓冲液，使神经元培养物周围形成一圈 PBS，以减少样本脱水并提供热绝缘。</li>
	<li>在启动自动图像采集（3.8）前，需使温度平衡至少1小时。在此期间可设置步骤3.5至3.7。</li>
	<li>通过启用所有中性密度滤光片，将照明强度限制在尽可能低的水平。这可以在长时间内频繁采集图像，同时避免过度的光损伤。降低照明强度会导致信号减弱，需要延长曝光时间（见讨论部分）。</li>
	<li>使用历史曝光设置，或在实验设置之前，制备一皿表达目标荧光蛋白的感染上皮细胞作为平行样本，以建立曝光设置，具体方法如第2.5节所述。</li>
	<li>在为必要通道设置曝光参数后，即可配置软件以进行自动图像采集。停止实时成像以减少样品的光漂白。
	<ol>
		<li>在 Elements 软件中（图2 以及补充视频2），从“应用程序”中选择6D - 定义/运行实验应用" 下拉菜单以打开 ND 采集窗口。</li>
		<li>在 ND 采集窗口中，单击“时间”选项卡。将时间间隔设置为“5 min”，持续时间设置为 20 hr。程序将自动计算循环次数字段，以确定执行的重复次数。</li>
		<li>选择“Lambda”选项卡。点击第一个方框，在随后出现的下拉菜单中为相差模式选择合适的lambda配置。对后续各通道依次重复此操作，为每种待成像的荧光蛋白选择相应的配置。</li>
		<li>选择“大图像”选项卡，该选项卡用于确定将多幅图像组合成单个更大视野的参数。建议选择 5 × 2 图像的区域，并设置 7% 的拼接重叠。这样可在不影响图像采集频率的前提下，使每个位置成像的细胞数量最大化。同时，取消勾选“移动载物台时关闭激活的快门”复选框。此选项通过在图像采集之间不关闭快门，从而提高采集速度。</li>
		<li>选择“XY位置”选项卡，以确定在过夜成像过程中将被依次并行采集的多个成像位置。选择能够定义每个大图像区域中心点的位置。在样品中选择6-8个成像位置。理想的成像区域应包含小簇状细胞，且细胞紧密邻近形态清晰的轴突。细胞不应重叠堆积，轴突束应尽可能减少。对焦的焦点应为细胞核。调整物镜位置，使大多数细胞的核膜清晰可见。</li>
		<li>确保取消选中“Z系列”选项卡。</li>
		<li>按照第 2.6.5 节所述配置自动保存功能。</li>
		<li>通过点击“1 次循环”来测试曝光和位置设置"评估所得图像的透射光照明、焦距和构图。若焦距发生偏移，在X-Y选项卡下为每个位置重新调整焦距。等待10分钟，重复此步骤，直至焦距稳定。</li>
		<li>在确认并测试所有设置后，点击“立即运行”按钮以启动自动化实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第4节 - 图像处理与导出
数据导出
<ol>
	<li>在活细胞成像过程中获取的关于运输或扩散事件的数据集，应从 NIS Elements 软件导出为常用文件格式，以便后续用于展示和发表（见补充视频 3）。要导出视频，请在 NIS Elements 中打开相应的原始 .nd2 文件，并选择“分通道”视图以显示所需的荧光通道。以合适的速率播放文件；每秒 5 帧是观察快速运输过程的一个良好起点。</li>
	<li>添加时间戳以在视频播放期间表示实时时间。右键单击图像并选择“添加 ND 信息”。一个数字计时器将出现在图像左上角。
	<ol>
		<li>编辑时间戳以显示所需信息。右键单击计时器并选择“编辑 ND 信息”。在弹出的窗口中，编辑文本以反映重要的成像参数。可调整字体、颜色和大小以确保清晰可读。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进入“编辑”菜单，找到“创建视图快照”选项，或按键盘上的“x”键。该命令将打开“视图快照”窗口。选择“应用于所有帧”，以生成一个包含整段视频中所有荧光通道信息的 8 位 RGB 格式、可直接导出的文件。</li>
	<li>保存为 .avi 格式以确保跨平台兼容性。设置每帧播放时间为 200 毫秒。由 NIS Elements 生成的 .avi 文件可进一步使用其他转换软件压缩为所需的文件格式。</li>
</ol>

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

活细胞成像的目标是在不显著干扰生物学过程本身的前提下，实时观察其动态变化。这一目标通过优化三个变量来实现：环境控制、成像速度和荧光照明。这些相互关联的变量必须取得平衡，才能获得可行的成像条件。本文所介绍的实验方案采用特定条件以获得代表性结果。在详细阐述具体方法之前，我们将简要讨论环境控制和观测造成的损伤。
在显微镜上建立并维持相关的生物学条件，对于成功监测细胞事件至关重要。实现目标条件依赖于显微镜与培养箱配置中多个特定变量。所有培养箱的设置都应通过在培养箱内对模拟样品进行独立的温度测量来验证，测量需在多个位置进行，包括：物镜接触点、培养皿中心以及培养皿边缘。应优化设置，以尽量减少超过37 °C达1 °C以上的区域，同时确保物镜接触点的温度尽可能接近37 °C。用于成像的每一种培养皿与物镜组合都必须在实验前经过测试和验证。理想情况下，应在成像过程中持续监测所有样品的温度，但对于许多系统而言这并不现实，尤其在使用生物危害性试剂时情况更为复杂。孵育条件的验证非常重要，因为样品在过高或过低的温度下孵育可能导致人为假象或细胞快速退化。
...

α-疱疹病毒（如单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病病毒）感染周围神经系统（PNS）的过程涉及病毒生命周期中多个复杂且高度调控的步骤。在初次病毒感染以及后续的宿主间传播过程中，病毒在PNS神经元内的运输至关重要。调控病毒生命周期中两个关键组分的分子机制——病毒组装体沿轴突从细胞体向外定向运输（顺向运输）以及随后病毒颗粒向易感细胞的传播（顺向扩散）——对于理解疱疹病毒的致病机制具有重要意义。
病毒颗粒在神经元中的运输与释放依赖于成熟感染性病毒体的组装1,2。以往的研究采用固定样本的检测方法，包括免疫荧光（IF）和电子显微镜（EM），用于分析病毒颗粒的组装状态以及与病毒体运输和传播相关的蛋白质相互作用3-6。然而，病毒体运输过程的动态特性以及化学固定所引入的实验假象，使得对固定样本图像的解读变得复杂7,8。近年来，已报道多种对HSV和PRV病毒影响极小的病毒-荧光蛋白融合蛋白。绿色荧光蛋白（GFP）与红色荧光蛋白（mCherry或mRFP）常被配对使用，以实现对成熟病毒体三个结构组分中任意两个的成像：即衣壳、被膜和糖蛋白9-11。利用双标记病毒进行活细胞成像，可直观显示病毒颗粒在运输过程中的组装状态。类似的表达荧光蛋白的病毒株也被用于观察病毒传播后病毒基因组的数量与多样性12,13。荧光蛋白的特性（综述见14,15）显著影响对病毒或细胞结构的可视化能力。在设计和测试新型蛋白融合体以保留野生型功能时，必须考虑荧光蛋白的内在特性，包括其自身相互作用和稳定性。
结合荧光蛋白融合技术，两种特征明确的 体外 细胞培养系统被用于单纯疱疹病毒感染的活细胞成像：分离的 16 并区室化 17 (图1A大鼠颈上神经节（SCG）神经元。在这两种系统中，均需分离胚胎期SCG，将其解离为单个细胞体，并进行接种培养。 体外 培养 18SCG神经元属于自主神经系统，可通过神经生长因子（NGF）进行培养并诱导分化，从而发育为成熟的极化状态。 离体分离的颈上神经节神经元形成广泛的轴突网络，便于观察病毒颗粒在顺向运输过程中的动态变化 6分隔式SCG培养可实现神经元胞体（S区室）与远端轴突末端（N区室）之间的流体隔离。 19多种使用原始方法构建和使用区室化神经元的详细方案 20 或改良的 Campenot 室 17 此前已有发表。流体隔离技术可实现神经元胞体的选择性感染，并在病毒子代经运输到达隔离的轴突末端后进行检测。在感染前于轴突末端上接种上皮细胞，可为病毒感染的扩散提供靶细胞。
活细胞成像实验包含多个关键要素，其中与本实验方案最相关的包括：自动图像采集、荧光照明、成像速度以及环境控制。在所有成像实验中，我们均使用倒置式全自动落射荧光显微镜（图1B）。该显微镜以 Nikon Eclipse Ti 为基础平台，并配备多个由计算机控制的电动系统，可在自动图像采集过程中快速重构显微镜配置。荧光照明采用宽谱汞灯，可通过照明光路中的中性密度滤光片调节光强。激发滤光片用于限定荧光照明的光谱范围，配合多通带二向色镜和荧光发射滤光片，可实现特定荧光化合物的可视化。激发和发射滤光片分别安装在独立的快速切换滤光轮中，以实现不同荧光通道的快速顺序采集。图像采集速度进一步通过高灵敏度、快速的EM-CCD相机得以提升，该相机适用于弱信号检测和短时间图像读取。显微镜的环境控制通过载物台顶部加热培养箱和物镜加热器实现，以维持样本在较高温度；同时向培养箱内通入加湿且富含CO2的气体环境。显微镜置于暗室中，室温维持在约25 °C，所有窗户均加装遮光帘以最大限度减少外界光线干扰。以下实验方案将描述该系统在顺向运输与扩散实验中的应用。
存在多种可选方案用于控制活细胞成像中的变量。显微镜参数的控制可通过手动方式完成，也可借助依赖专有软件的自动化系统实现。荧光照明可采用卤素灯、LED 或激光光源。成像速度受滤光片切换速度以及与检测系统配合使用时信号成像所需时间的影响。环境控制可通过显微镜载物台上配备的专用硬件、将显微镜全部或部分置于加热且加湿的密闭箱体内，或提高显微镜所在房间的温度来实现。上述每种方案在成本和性能方面均各有优缺点。
在后续的实验方案中，我们详细描述了利用活细胞成像技术，结合重组病毒株，研究α疱疹病毒的快速顺向运输及其顺向扩散的方法。11 实时活细胞成像可观察到衣壳、被膜蛋白和/或糖蛋白在轴突内运输过程中的动态结构上的共定位。对区室化神经元培养物进行过夜延时成像，可观察到轴突中病毒粒子的释放以及对易感细胞的感染过程12。本文所展示的实验方案已针对我们特定的成像系统进行了优化，但在表述上围绕活细胞成像的四个基本要素以通用方式呈现。在讨论部分，我们将进一步详述实验成功所必需的一些优化步骤。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &amp;mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Verona, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>显微镜主机</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>电动显微镜X-Y载物台</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>电动滤光轮</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 10 position filter wheel</td><td></td></tr><tr><td>荧光照明光源</td><td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>多波段荧光滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD相机</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide台面式活细胞培养箱</td><td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

活细胞荧光显微镜技术的进步，以及表达荧光融合蛋白的重组病毒株的构建，使得实时观察α疱疹病毒感染神经元过程中的运输与扩散成为可能。新型荧光融合蛋白在病毒膜、被膜和衣壳中的应用，结合活细胞成像技术，已识别出在轴突内进行运输的病毒颗粒组装体。类似工具已成功用于分析病毒颗粒在细胞间的传播，以定量评估在细胞间传递的病毒粒子数量与多样性。尤为重要的是，活细胞成像技术用于顺向运输与传播的研究可产生大量信息，包括病毒颗粒的运输速度、颗粒分布以及蛋白质定位的时间动态分析。结合经典的病毒遗传学技术，这些方法为理解重要的机制性问题提供了关键见解。本文详细描述了为解答α疱疹病毒运输与传播基本科学问题而发展出的成像方法。

顺行运输
将本方案应用于离体SCG培养物感染表达GFP-Us9和gM-mCherry膜融合蛋白的重组PRV 348株，有助于可视化病毒粒子的顺向运输过程（图3 和 补充影片4）。这些融合蛋白被整合到病毒颗粒中，可在运输斑点上被检测到，而上述成像条件在滤光片切换过程中最大限度地减少了移动颗粒上各荧光团之间的偏移。在三分钟的成像窗口内，通常可观察到大量运输斑点，并能快速生成用于共定位分析的大样本量数据。我们此前已利用该方法定量分析了α疱疹病毒轴突靶向蛋白GFP-Us9与其他结构蛋白的共定位情况11。对其他双重组PRV株的类似分析也已有报道11，近期研究进一步扩展了本方案，记录了PRV蛋白与荧光标记的宿主马达蛋白的共运输过程21。通过使用快速切换滤光轮和配对的多通带二向色镜，可实现两个或多个荧光通道的快速连续采集。目前我们可实现每秒高达0.8帧的双通道连续成像速度。对于仅受荧光曝光时间和相机读出时间限制的单通道视频显微镜，成像速率可超过每秒6帧。
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活细胞成像技术可对α疱疹病毒感染过程中的定向运输和细胞间扩散等动态事件进行分析。本文介绍了利用表达荧光融合蛋白的重组病毒株，在原代神经元感染过程中实现病毒组装体可视化的方法。

活细胞荧光显微镜技术的进步，以及表达荧光融合蛋白的重组病毒株的构建……

本实验的总体目标是利用原代神经元培养物中的荧光蛋白融合技术，可视化观察疱疹病毒的运输与扩散过程。首先，在具备快速切换荧光照明功能的显微镜上，将样品置于生理相关温度下进行孵育，以实现该目标。第二步，设置荧光成像参数，在获取合理数据的同时，最大限度减少对细胞的光损伤。接下来，可选择对荧光通道进行逐次采集或多点采集。最后一步是获取多图像拼接的帧。数据随后被分析并重新格式化，以用于展示和发表。最终，这种活细胞成像方法可用于追踪荧光病毒颗粒在神经元内的运动，并观察感染在细胞间扩散的过程。该方法有助于深入了解疱疹病毒在神经元中的运输与传播机制，也可应用于细胞生物学和微生物学中的其他动态事件研究，例如颗粒的内吞作用或细胞迁移。在进行任何成像实验之前，连接并开始预热显微镜载物台顶部培养箱。30分钟后，打开显微镜、透射光和落射荧光光源以及自动硬件控制系统。然后启动NIS Elements显微镜控制软件，以连接显微镜。此处显示的是 NIS 元素中标准用户界面的截图。播放和停止按钮用于控制实时图像窗口，该窗口显示当前成像的硬件配置以及正在成像的内容。顶部面板上有一系列光学配置，可应用预设的硬件设置，将显微镜配置为透射光照明或荧光检测模式。相机控制和曝光设置可用于配置相机检测，以优化图像质量和采集速度。所有实验均通过 ND 采集控制进行协调。接下来，将镜头加热器连接到相应的油浸物镜上，然后将台顶式培养箱连接到显微镜的电动载物台上。确保已安装用于固定样品的合适插入件，然后将培养箱控制器的加湿气管连接到载台培养箱的进气口。打开培养箱和物镜加温控制器，随后将温度设置调整为先前已验证的、针对成像所用物镜和样品的特定条件。最后，打开5%二氧化碳与95%大气混合气体钢瓶上的控制阀，为载台培养箱提供含二氧化碳的气体环境。为了实时观察进入神经元的病毒颗粒运输过程，首先将含有感染神经元的细胞培养皿放入载物台顶部培养箱中，至少孵育10分钟后再开始实验。然后使用透射光和显微镜目镜，寻找具有清晰孤立轴突延伸的神经元胞体。在神经元培养物中找到可成像区域是该实验流程中最困难的部分。为确保成功，应同时培养多个样本，以应对细胞生长不良、污染或成像过程中对培养物造成物理损伤等情况。现在，请使用显微镜软件将光路切换至EM CCD相机，然后点击播放按钮以启动实时成像窗口。在确定每组荧光蛋白的最佳相机曝光设置后，将相机的电子倍增增益设为300，以缩短曝光时间并增强对微弱信号的检测。停止实时成像以防止样品漂白。接下来，在设置曝光时间并在 NIS 元件中找到轴突的清晰区域后，配置软件以进行连续图像采集。打开应用程序下拉菜单，选择“六 D 定义运行实验”应用程序。在 ND 采集窗口中，点击时间选项卡以确定图像采集的频率。将间隔设置为无延迟，持续时间为五分钟。现在点击“Lambda”选项卡，以选择用于多荧光图像采集的预设硬件配置。勾选第一个框，然后在随后的下拉菜单中选择合适的硬件配置。选择“保存到文件”选项，并配置实验输出文件的保存位置和文件名。完成所有参数设置后，单击“立即运行”按钮以启动实验。通过调整曝光设置和所获取图像的尺寸，可优化图像采集速率。使用 NIS 元素中的感兴趣区域工具定义感兴趣区域。选择占总图像面积 25% 至 50% 之间的区域，以对肠上皮细胞扩散事件进行过夜延时成像。首先，将培养皿轻柔地放入载物台顶部培养箱中。在确保物镜位置已移至培养皿侧边后，缓慢调节物镜至成像清晰，注意避免物镜向上顶入样品。一旦确定成像区域，缓慢将物镜移至培养皿中央，靠近内部屏障处，即轴突室的内侧边界，注意保持焦平面深度，避免顶入样品。接下来，在聚四氟乙烯环外的培养皿中加入约两毫升37摄氏度的PBS，以包围培养皿中的神经元，从而最大限度减少样品脱水，并提供热绝缘。然后启用所有中性密度滤光片，将照明强度降至尽可能低的水平，以便在较长时间内频繁采集图像，同时避免过度的光损伤。在ND采集窗口中，点击大图像标签，然后选择一个由五列两行图像组成的区域。使用7%的拼接重叠率，平行地依次对多个位置进行成像。在过夜拍摄电影的过程中，选择“XY位置”选项卡。然后定义各个大图像区域中心点的位置。对焦的焦点应为细胞的细胞核，调整物镜位置，使大多数细胞的核膜清晰可见。然后单击一次循环以测试曝光和位置设置，并评估透射光、照明、聚焦和构图所得到的图像。在确认并测试所有设置后，单击“立即运行”按钮，启动自动化实验，导出活细胞成像过程中获得的视频。首先，在 NIS-Elements 中打开相应的原始 ND2 文件，并选择“拆分组分视图”。为了可视化所需的荧光通道，请以合适的速度回放文件。每秒五帧是可视化快速运输过程的一个良好起点，同时可包含时间戳以在视频回放期间表示实时时间。右键点击图像，然后选择添加 ND 信息。左上角将出现一个数字计数器，要编辑时间戳，请右键单击计数器并选择编辑 ND 信息。在随后弹出的窗口中，编辑文本以反映相关的成像参数。为提高可读性，请调整文本的字体颜色和大小。然后转到编辑菜单，选择“创建视图快照”，打开视图快照窗口，生成一个包含整个视频中荧光通道信息的8位RGB导出就绪文件，并选择“应用于所有帧”。最后，将文件保存为AVI格式以确保跨平台兼容性，并将播放速率设置为每帧200毫秒。在此相差图像中，展示了一个用于逆向病毒颗粒运输成像的典型成熟离体颈上神经节（SCG）培养物；伪狂犬病毒（PRV 348）感染的神经元表达了GFP-S9和mCherry膜融合蛋白。本图展示了感染PRV 348后8小时SCG轴突的代表性活细胞成像结果，远端轴突中顺向运输的结构通过GFP和mCherry两个荧光通道进行可视化。如白色箭头所示，一个顺向运输的结构在轴突内移动。由于荧光通道的顺序采集以及病毒结构的快速运动，两种荧光蛋白在空间上存在偏移。将本方案应用于PRV 3 48感染离体SCG培养物，有助于可视化病毒颗粒的顺向运输过程。这些融合蛋白被整合到病毒颗粒中，可在运输点状结构上通过移动的荧光点进行检测。上述成像条件可最大限度地减少滤光片切换过程中移动颗粒上各荧光信号的位置偏移。利用快速切换滤光轮和成对的多通带二向色镜，可在三分钟成像窗口内以高达每秒0.8帧的速度快速连续采集两个或多个荧光通道。实验中通常可观察到大量运输中的Punta，并能快速获得用于共定位分析的大样本量。此处展示了该图像中分区培养系统的示意图，其中SCG神经元接种于左侧区室，其轴突投射穿过内部屏障延伸至最右侧区室。以下图像选自一段大型图像拼接的活细胞成像视频，该视频记录了伪狂犬病毒（PRV 4 27）感染的轴突将病毒粒子传递至受体上皮细胞的过程。在第一组图像中，展示了感染后某一时间点传递的YFP和RFP荧光信号。此时，受体细胞开始表达膜结合型YFP，同时可见VP26-MRFP融合蛋白的表达。白色方框标示出含有感染性衣壳组装体的受体上皮细胞区域。此处显示的是仅通过RFP通道观察的前一张图像相同区域。实心白线表示细胞轮廓的示意图。白色虚线表示细胞核，蓝色线条勾勒出轴突。在第二个图中，仅同时显示YFP和RFP通道。请注意，轴突束上存在大量MRFP荧光点。这些细胞为近期被感染，尚未表达任何融合蛋白。可通过逆向追踪被感染细胞，以观察启动病毒感染的荧光衣壳。这些单个细胞可从大视野中分离出来进行追踪，且不会显著丢失细节信息。在进行该实验操作时，必须牢记活细胞显微成像会影响所观察的生物学过程。然而，通过仔细优化这些实验方案，可以在不干扰生物学过程的前提下实现可视化观察。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

顺行运输Alphaherpes病毒传播的活细胞成像

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。...

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。...

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。...

一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。...

逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0...

通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

蛋白质从质膜到反式高尔基网络的内吞和逆向运输对于维持膜稳态和调控信号传导至关重要。本文介绍一种利用衍生化抗GFP纳米抗体，通过活细胞显微镜在HeLa细胞中对跨膜货物蛋白的内吞运输进行成像和定量分析的方法。...

利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

学习使用荧光蛋白融合技术对原代神经元培养物中的Alphaherpes病毒进行活细胞成像，实时追踪病毒颗粒的顺向运输和细胞间传播动态。该方法为神经病毒学研究提供了重要的可视化工具。

活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

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