一种利用种皮基质培养法进行遗传学研究的实验方法 体外 胚乳如何调控种子萌发 拟南芥

本实验的总体目标是建立一种种皮包被培养实验，以探究在不同环境条件下，内胚乳如何在遗传和体外水平上调控拟南芥种子的萌发。该实验首先使用注射器针头和截短的镊子，小心地将拟南芥种子的种皮和胚分离；第二步，将分离后的种皮轻轻转移至萌发培养基上。

接下来，将种皮组装成单层环形结构。最后一步，将胚胎排列在组装好的种皮层中央，同样形成单层环形结构。

胚乳在控制我们研究的ab堕胎种子萌发过程中起着至关重要的作用。种子萌发抑制检测法是一种体外遗传系统实验方法，用于鉴定在胚乳中发挥作用以调控种子萌发的信号通路中的分子遗传组分。通常，研究者在应用该方法时会遇到困难，因为快速分离胚且不对其造成损伤具有较大挑战性。

所用材料的保存时间也需加以考虑，因为随着材料老化，其调控细胞决定的能力会逐渐丧失。首先，将50至60微升成熟的干燥拟南芥种子倒入1.5毫升的微量离心管中。然后向管中加入1毫升70%乙醇，在室温下使用涡旋振荡器或设定为1200转/分钟的摇床振荡种子。10分钟后，在4,000 ×g条件下离心3秒，使种子沉降至管底。

然后使用真空吸头小心吸去乙醇，使种子留在离心管底部。向种子中加入 1 mL 无菌蒸馏水，再振荡 10 分钟。再次离心沉淀种子后，吸去上清液，并向离心管中加入另一毫升无菌蒸馏水，确保水流使种子在管内均匀悬浮。

然后将离心管放入试管架中，让种子沉降到管底。约30秒后，小心吸除水分以接种种子。首先，将30毫升新配制的50摄氏度萌发培养基倒入100毫米的培养皿中。用200微升无菌蒸馏水重悬种子，然后使用1毫升移液器吸头将种子转移至萌发培养基表面。

吸去种子周围的水分，然后将培养皿和种子在超净工作台中敞开放置，继续干燥。两小时后，盖上培养皿，继续在通风橱内放置90分钟。随后，将体视显微镜放入通风橱内。

将30毫升萌发培养基倒入另一个100毫米的培养皿中，然后将两张并排的矩形高压灭菌Watman 3毫米滤纸放置在培养基表面。该操作中最困难的步骤是A的解剖，因为A的种子非常薄，因此在使用无菌钝头Dumont #5镊子切割种子时必须格外小心，以避免损伤胚。

将种子转移到滤纸上，然后用镊子夹紧。轻轻将单粒种子压入纸中。接着使用29号胰岛素注射器针尖，沿种子最长半主轴方向切割种皮，切口应尽可能靠近种皮连接胚根的部位。

然后用镊子将种子紧贴纸面推动。再次在Cains的尖端靠近胚根尖端的位置施加压力，以将胚从种皮中释放出来，从而建立种皮包埋实验。首先，将一块3.5厘米×5厘米的无菌尼龙网置于另一新制备的100毫米培养皿的萌发培养基中。

然后使用注射器轻轻将胚胎和种皮推至镊子的金属边缘，并将植物组织转移到尼龙网上。用镊子和注射器将种皮排列成单层圆形，确保种皮尽可能紧密排列，且种皮的开口朝上。接着将胚胎放置在种皮层中央，形成单层圆形排列，确保胚胎之间也尽可能紧密接触。

最后，将海藻酸钙包埋的种子实验置于连续光照、20至21摄氏度条件下培养，这与先前的研究结果一致。无法合成赤霉素或赤霉素缺陷型的拟南芥突变体种子，在种子抑制处理后80小时无法萌发。相反，且进一步与先前结果一致的是，去除种皮可诱导赤霉素缺陷型突变体胚的生长，除非培养基中含有OB CIC酸或一种脱落酸（BA），这表明赤霉素缺陷型突变体的胚乳会向胚释放一种脱落酸以抑制其萌发。

在此图像中，种子抑制后 80 小时，展示了将赤霉素（GA）缺陷型突变体胚置于由 80 个 GA 缺陷型突变体种皮组成的基质上的种皮培养实验。与我们的假设一致，GA 缺陷型突变体种皮抑制了 GA 缺陷型突变体胚的生长。此处还展示了在种子抑制后 80 小时，将不能合成脱落酸（ABA）的 GA 缺陷型突变体胚培养于同样缺乏合成 ABA 能力的 GA 缺陷型突变体种皮基质上的种皮培养实验，结果正如预期，这些突变体种皮无法抑制 GA 缺陷型突变体胚的生长。

类似地，将赤霉素（GA）缺陷型突变体胚胎培养在缺乏 deli 因子 RGL2 的赤霉素缺陷型突变体种皮上，这些胚胎同样无法抑制赤霉素缺陷型突变体胚胎的生长。在完成该操作后，还可采用其他方法，例如对从种子中分离的种皮和胚胎进行基因表达分析，以利用种皮浸泡体系研究基因间的遗传相互作用。因此，一旦掌握此项技术，将有助于种子萌发领域的研究人员探索种皮如何调控胚胎生长以响应环境中各种信号的作用机制。