Name: 种皮床品检测到基因探索体外如何控制胚乳种子萌发的拟南芥 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-09T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习种皮床品检测技术，探索胚乳如何调控拟南芥种子萌发。该方法通过体外实验揭示光信号等环境因子对休眠种子萌发的遗传调控机制，为植物发育生物学研究提供重要工具。

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本工作获得了瑞士国家科学基金会和日内瓦州的资助。

SCBA组装完成后，需在数天内持续监测胚胎的生长情况。因此，在进行种子解剖及SCBA组装之前，必须对种子进行灭菌处理，以避免后续污染，从而确保能够准确评估种皮材料对胚胎生长的影响。
1. 种子灭菌
<ol>
	<li>加入50–60 μl成熟且干燥的 拟南芥 将种子置于1.5 ml 微型离心管中，并配制70%乙醇溶液。</li>
	<li>向含有种子的微量离心管中加入1 ml 70%乙醇溶液，在涡旋振荡器中于室温下以1,200 rpm振荡10分钟。</li>
	<li>将微量离心管在4,000 × g条件下离心3秒，使种子沉降至管底。</li>
	<li>使用真空吸头吸除70%乙醇溶液&#160;小心地将种子留在微量离心管底部。</li>
	<li>向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。</li>
	<li>室温下以1,200 rpm振荡10分钟。</li>
	<li>将微量离心管在4,000 × g下离心3秒，使种子沉降至管底。使用真空吸头小心吸除上清液，保留管底的种子。</li>
	<li>向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。确保水流使种子在管内均匀悬浮。此步骤的目的是避免进一步振荡，以保持种子的完整性。</li>
	<li>让种子在试管底部静置30秒，通过重力自然沉降。使用真空吸头小心吸除上清液，避免扰动试管底部的种子。</li>
	<li>重复步骤 1.8 - 1.9 四次。整个灭菌过程约需 30 分钟。</li>
</ol>
2. 种子接种
所有后续步骤均在超净工作台内进行，以保持无菌条件。
<ol>
	<li>准备一个培养皿（直径100 mm，高20 mm），其中含有30 ml萌发培养基。萌发培养基的制备方法为：将含有4.3 g/L Murashige和Skoog培养基、2.5 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES-KOH；pH 5.7）和0.8 g/L琼脂的溶液进行高压灭菌，然后将溶液置于50 °C水浴中冷却，再倒入培养皿中。</li>
	<li>向含有种子的离心管中加入200 μl无菌蒸馏水。重悬种子，并使用带1 ml吸头的标准移液器将种子转移至萌发培养基表面。</li>
	<li>使用真空吸头除去种子周围萌发培养基表面的水分。</li>
	<li>将盛有种子的培养皿在超净工作台内打开盖子放置2小时，以进一步干燥。随后盖上培养皿盖子，继续在超净工作台内静置约90分钟，使自种子消毒程序开始（步骤1.2）以来总时间达到约4小时。</li>
</ol>
3. 种子解剖
以下步骤需在超净工作台内的体视显微镜下操作。使用5号Dumont镊子（尖端截平）即 钝头）尖端能极大地方便种子的操作（图1A).
<ol>
	<li>准备一个新的培养皿，内含30 ml萌发培养基。将两张相邻的矩形无菌Whatman 3MM滤纸（1.5 cm × 1.0 cm）放置在培养基表面。 图1B，步骤1）。Whatman 3MM 滤纸在高压灭菌器中灭菌。</li>
	<li>使用无菌镊子将种子转移到Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤 2）。</li>
	<li>用截短镊子的并置钝端轻轻按压种子，将单粒种子固定在Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤 3）。</li>
	<li>使用注射器针头切开种子的种皮（种皮和胚乳）例如 U100 胰岛素注射器 + 1 ml 注射器，0.33 mm（29 G）× 12.7 mm图1B，步骤4）。形状的 拟南芥 种子呈椭球形，建议沿种子最长半主轴方向切割种皮，切口应尽可能靠近子叶与胚根连接处即 远离根尖）。这有助于在解剖过程的下一步中安全地释放胚胎。</li>
	<li>用截短镊子的并置钝端将种子压在Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤5）。此步骤通过3.4步骤中产生的开口将胚胎从种皮中释放出来（图1B，步骤6）。建议在子叶尖端最靠近胚根尖端的部位对种子施加推力（即 远离开口处）。</li>
</ol>
4. 种皮培养基测定法（SCBA）的组装
有关种子外壳和胚胎数量的适当选择，请参见讨论部分。
<ol>
	<li>准备一个新的培养皿，内含30 ml萌发培养基。在培养基表面放置一片无菌的尼龙网矩形片（3.5 cm × 5.0 cm）。&#160;(图2，步骤1）。</li>
	<li>为避免损伤，可使用注射器针头轻轻推动，将胚胎和种皮移至镊子的金属边缘表面。图2，步骤2）。将胚胎和种皮转移到尼龙网膜上（图2，步骤 3）。</li>
	<li>使用钝头镊子和针将种皮组装成一个紧密排列的单层环形结构，确保种皮之间尽可能紧密接触（图2，步骤4）。尽量充分暴露针头向上刺出的种皮开口。此步骤尚未经过系统性测试，但可能提高SCBA的效率，因为抑制胚生长的可扩散物质预计将直接向胚外扩散，而非远离胚。</li>
	<li>将胚胎以单层环形排列，放置于第4.3步制备的种皮床中央。图2，步骤5）。确保胚胎尽可能彼此靠近。</li>
	<li>在持续光照（40 μmol/m²/s）条件下孵育SCBA2sec在20–21 °C条件下进行。若使用远红光脉冲（FR脉冲）抑制萌发，则在正常光照下组装SCBA，随后按所述方法施加远红光脉冲9 并将培养皿置于黑暗环境中。</li>
</ol>

<ol><li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy%2C+germination%2C+and+longevity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li>
<li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026(2002).</li>
<li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebeaujon%2C+I+%22Seed+development%2C+dormancy+and+germination%22">Seed development, dormancy and germination</a>. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).</li>
<li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+dormancy+and+the+control+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li>
<li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide%2C+gibberellin%2C+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li>
<li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li>
<li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li>
<li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li>
<li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li>
<li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+seed+germination+in+the+shade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li>
<li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li>
<li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li>
<li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

种子 coat 床培法（SCBA）方案在原理上适用于任何需要 拟南芥 种子萌发受阻（或延迟），且怀疑由胚乳介导了这种抑制作用。后者可通过去除种皮（种皮和胚乳）并观察到胚胎生长速度较其被种皮包裹时显著加快来证实。萌发可能因特定环境物理参数而受到抑制例如 水势或光质）或特定遗传背景中例如 赤霉素合成缺失，如 ga1 突变体，参见 图3).
关于SCBA实验中所需使用的种皮和胚的数量，目前尚无通用规则。这取决于种子批次（尤其是其新鲜程度）以及所要进行的实验类型。因此，关键在于通过每天观察胚在种皮层上的生长情况，针对每种具体情况调整所用解剖材料的用量。然而，通常在使用高度休眠的Arabidopsis生态型时，仅需少量种皮即可。以下展示的是在组装SCBA时成功使用过的种皮与胚的典型用量：
含休眠种子材料的SCBA6： 
* 新鲜收获（即休眠状态）的佛得角群岛生态型（...

在拟南芥（Arabidopsis）成熟种子中，种皮由外层的种皮（testa）和内层的胚乳（endosperm）组成。种皮是一层来自母体的死组织，而胚乳是直接包围胚胎的一层活细胞组织1。胚乳和胚胎来源于不同的受精事件：胚乳为三倍体组织，包含两份母本基因组和一份父本基因组，而胚胎为二倍体组织，包含一份母本基因组和一份父本基因组2。
传统上认为胚乳的主要功能是作为营养组织。然而，越来越多的证据表明，胚乳在调控种子萌发过程中也发挥着核心作用。这一观点最初在种子休眠现象中得以显现，休眠是新形成种子表现出的一种特性。休眠种子即使处于适宜的萌发条件下也无法萌发。种子在经过一段后熟期后会失去休眠特性，转变为非休眠状态，即在适宜的萌发条件下能够萌发。在包括模式植物Arabidopsis在内的许多植物物种中，种皮对于阻止休眠种子萌发至关重要，因为去除种皮会触发胚的生长和转绿3,4。在Arabidopsis中，Bethke et al. 观察到，即使去除了外种皮（testa）但仍保留包围胚的胚乳时，萌发仍受到抑制5。这些结果强烈表明，胚乳是种皮内部对胚起抑制作用的组织。然而，去除种皮的实验并不一定有助于阐明种皮所提供的萌发抑制作用的本质，也无法明确执行该功能的基因。
我们近期引入了一种种皮铺垫实验法（seed coat bedding assay, SCBA），该方法将种皮与胚体进行物理分离，但保持二者紧密相邻，从而维持由胚乳提供的抑制萌发活性6。SCBA 可组合使用休眠、非休眠以及遗传修饰的种皮和胚体材料，进而解析控制种子萌发、并在胚乳和胚体中特异性发挥作用的遗传通路。在休眠研究中，SCBA 被用于证明胚乳向胚体释放植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA），以抑制胚的生长6。此外，我们还可利用 SCBA 鉴定在胚乳和胚体组织中促进休眠的信号转导通路。
通过考察非休眠种子暴露于远红光（FR）脉冲的情况，进一步证实了胚乳在调控萌发中的作用。种子吸胀早期，远红光脉冲已知可抑制种子萌发7,8。当去除种子的种皮后，远红光脉冲无法抑制萌发，这强烈表明胚乳同样能够抑制非休眠种子的萌发9。值得注意的是，分离的胚培养法（SCBA）也可用于重现远红光依赖性的萌发抑制效应。这使得研究者得以证明，远红光依赖性的种子萌发抑制过程同样涉及胚乳中脱落酸（ABA）的释放9。此外，利用SCBA还能够鉴定出在胚乳和胚胎中分别发挥作用、响应光信号以调控非休眠种子萌发的不同光信号通路9,10。
因此，SCBA 似乎是研究胚乳在种子萌发调控中功能的一种可靠技术，也是一种评估 体外 验证被怀疑控制萌发的基因是在胚乳、胚胎还是两种组织中发挥作用。本文详细介绍了组装SCBA所需的各个步骤。

<table><tbody><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf AG</td><td>5355 000.011</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td></tr><tr><td>Vacusafe Comfort</td><td>INTEGRA Biosciences AG</td><td>158 310</td><td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm × 20 mm）</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>664 102</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>琼脂（植物琼脂）</td><td>Duchefa Biochemie B.V.</td><td>P1001</td><td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11251-10</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>BD Micro-Fine</td><td>324827</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td></tr><tr><td>尼龙筛网（SEFAR NYTEX）</td><td>SEFAR AG</td><td>03-50/31</td><td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>CLF Plant Climatics</td><td>Percival I-30BLLX</td><td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td></tr><tr><td>多效唑（Paclobutrazol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46046</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr></tbody></table>

一种利用种皮基质培养法进行遗传学研究的实验方法 体外 胚乳如何调控种子萌发 拟南芥

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

的 拟南芥 胚乳由单层细胞构成，包裹在成熟胚胎的外围，在抑制休眠种子或远红光脉冲照射后的非休眠种子萌发过程中发挥关键作用。为了进一步深入了解胚乳所介导的萌发抑制作用背后的分子遗传机制，一项 &#34;种皮基质&#34; 已设计出一种种子包被分析法（SCBA）。SCBA 是一种解剖操作，通过物理方式将种皮与胚从种子中分离，从而可监测胚在下层种皮上的生长情况。值得注意的是，SCBA 能够在种子休眠以及远红光依赖性调控种子萌发的背景下，重建种皮对萌发的抑制活性。由于 SCBA 允许组合使用休眠、非休眠以及遗传修饰的种皮和胚组织，因此可解析控制萌发的遗传通路，特别是胚乳和胚中特异性发挥作用的通路。本文详细描述了构建 SCBA 的实验步骤。

先前的研究表明，无法合成赤霉素（GA）的突变体种子由于种子中脱落酸（ABA）大量积累而不能萌发11,12。然而，这种萌发障碍依赖于种皮的存在，因为去除种皮可触发胚的生长13。这强烈表明，无法合成GA的种子的胚乳会释放ABA以抑制胚的生长。因此，我们预期在种子包被活性测定（SCBA）中，无法合成GA的种皮会抑制胚的生长，而无法同时合成GA和ABA的种皮则不会表现出这种抑制作用。本研究中使用的是携带T-DNA插入、破坏了编码ent-贝壳杉烯二磷酸合酶的GA1基因（登录号AT4G02780）的ga1-21（Salk插入系Salk_109115）突变体种子，该酶是GA生物合成所必需的14。GA1基因（Col生态型）中的SALK_109115插入系信息可在SALK SIGnAL数据库中查到15（<a href="http://signal.salk.edu/" target="_blank">http://signal.salk.edu/</a>）。
<p class="jove_...

我们介绍了组装种子 coat 床位测定法（SCBA）的步骤 拟南芥 种子。SCBA被证明是探索遗传学的有力工具 体外 胚乳如何在休眠种子中以及响应光信号时控制种子萌发。原则上，当怀疑胚乳影响胚胎生长时，均可应用SCBA。

拟南芥的胚乳由单层细胞构成，包裹着成熟胚胎，在防止种子萌发过程中发挥着至关重要的作用。

本实验的总体目标是建立一种种皮包被培养实验，以探究在不同环境条件下，内胚乳如何在遗传和体外水平上调控拟南芥种子的萌发。该实验首先使用注射器针头和截短的镊子，小心地将拟南芥种子的种皮和胚分离；第二步，将分离后的种皮轻轻转移至萌发培养基上。接下来，将种皮组装成单层环形结构。最后一步，将胚胎排列在组装好的种皮层中央，同样形成单层环形结构。胚乳在控制我们研究的ab堕胎种子萌发过程中起着至关重要的作用。种子萌发抑制检测法是一种体外遗传系统实验方法，用于鉴定在胚乳中发挥作用以调控种子萌发的信号通路中的分子遗传组分。通常，研究者在应用该方法时会遇到困难，因为快速分离胚且不对其造成损伤具有较大挑战性。所用材料的保存时间也需加以考虑，因为随着材料老化，其调控细胞决定的能力会逐渐丧失。首先，将50至60微升成熟的干燥拟南芥种子倒入1.5毫升的微量离心管中。然后向管中加入1毫升70%乙醇，在室温下使用涡旋振荡器或设定为1200转/分钟的摇床振荡种子。10分钟后，在4,000 ×g条件下离心3秒，使种子沉降至管底。然后使用真空吸头小心吸去乙醇，使种子留在离心管底部。向种子中加入 1 mL 无菌蒸馏水，再振荡 10 分钟。再次离心沉淀种子后，吸去上清液，并向离心管中加入另一毫升无菌蒸馏水，确保水流使种子在管内均匀悬浮。然后将离心管放入试管架中，让种子沉降到管底。约30秒后，小心吸除水分以接种种子。首先，将30毫升新配制的50摄氏度萌发培养基倒入100毫米的培养皿中。用200微升无菌蒸馏水重悬种子，然后使用1毫升移液器吸头将种子转移至萌发培养基表面。吸去种子周围的水分，然后将培养皿和种子在超净工作台中敞开放置，继续干燥。两小时后，盖上培养皿，继续在通风橱内放置90分钟。随后，将体视显微镜放入通风橱内。将30毫升萌发培养基倒入另一个100毫米的培养皿中，然后将两张并排的矩形高压灭菌Watman 3毫米滤纸放置在培养基表面。该操作中最困难的步骤是A的解剖，因为A的种子非常薄，因此在使用无菌钝头Dumont #5镊子切割种子时必须格外小心，以避免损伤胚。将种子转移到滤纸上，然后用镊子夹紧。轻轻将单粒种子压入纸中。接着使用29号胰岛素注射器针尖，沿种子最长半主轴方向切割种皮，切口应尽可能靠近种皮连接胚根的部位。然后用镊子将种子紧贴纸面推动。再次在Cains的尖端靠近胚根尖端的位置施加压力，以将胚从种皮中释放出来，从而建立种皮包埋实验。首先，将一块3.5厘米×5厘米的无菌尼龙网置于另一新制备的100毫米培养皿的萌发培养基中。然后使用注射器轻轻将胚胎和种皮推至镊子的金属边缘，并将植物组织转移到尼龙网上。用镊子和注射器将种皮排列成单层圆形，确保种皮尽可能紧密排列，且种皮的开口朝上。接着将胚胎放置在种皮层中央，形成单层圆形排列，确保胚胎之间也尽可能紧密接触。最后，将海藻酸钙包埋的种子实验置于连续光照、20至21摄氏度条件下培养，这与先前的研究结果一致。无法合成赤霉素或赤霉素缺陷型的拟南芥突变体种子，在种子抑制处理后80小时无法萌发。相反，且进一步与先前结果一致的是，去除种皮可诱导赤霉素缺陷型突变体胚的生长，除非培养基中含有OB CIC酸或一种脱落酸（BA），这表明赤霉素缺陷型突变体的胚乳会向胚释放一种脱落酸以抑制其萌发。在此图像中，种子抑制后 80 小时，展示了将赤霉素（GA）缺陷型突变体胚置于由 80 个 GA 缺陷型突变体种皮组成的基质上的种皮培养实验。与我们的假设一致，GA 缺陷型突变体种皮抑制了 GA 缺陷型突变体胚的生长。此处还展示了在种子抑制后 80 小时，将不能合成脱落酸（ABA）的 GA 缺陷型突变体胚培养于同样缺乏合成 ABA 能力的 GA 缺陷型突变体种皮基质上的种皮培养实验，结果正如预期，这些突变体种皮无法抑制 GA 缺陷型突变体胚的生长。类似地，将赤霉素（GA）缺陷型突变体胚胎培养在缺乏 deli 因子 RGL2 的赤霉素缺陷型突变体种皮上，这些胚胎同样无法抑制赤霉素缺陷型突变体胚胎的生长。在完成该操作后，还可采用其他方法，例如对从种子中分离的种皮和胚胎进行基因表达分析，以利用种皮浸泡体系研究基因间的遗传相互作用。因此，一旦掌握此项技术，将有助于种子萌发领域的研究人员探索种皮如何调控胚胎生长以响应环境中各种信号的作用机制。

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科研

JoVE Journal

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生物学

种皮床品检测到基因探索<em&gt;体外</em&gt;如何控制胚乳种子萌发的<em&gt;拟南芥</em

基因组印记是植物和哺乳动物繁殖过程中的一种现象。DNA甲基化在印记机制中起着重要作用。在拟南芥（Arabidopsis）中分离胚乳并确定印记基因的甲基化状态可能较为困难。本实验方案中，我们描述了如何分离胚乳，并通过亚硫酸氢盐测序法测定甲基化状态。...

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我们介绍一种利用培养皿和培养基固定植物子叶的方法，以便在数天的发育过程中对表皮进行共聚焦成像，记录气孔分化过程。通过荧光蛋白标记，可动态追踪蛋白的表达及其亚细胞定位，从而加深对其在细胞分裂和细胞类型分化过程中可能作用的理解。...

长期、高分辨率共聚焦延时成像 拟南芥子叶 萌发期间的表皮

我们报道一种高效且简便的方法，用于分离发育早期阶段的胚胎 拟南芥 种子。根据下游应用的不同，可在1至4小时内分离出多达40个胚胎。该方法适用于转录组、DNA甲基化、报告基因表达、免疫染色和荧光检测。 原位...

高效快速分离早期胚胎 拟南芥 种子

本文介绍了一种利用埋藏的标记种子条带和氯化三苯基四氮唑（TZ）活力检测法，在野外条件下评估种子存活率、萌发率和休眠状态的实验方案。...

评估田间条件下种子萌发、休眠与死亡率的可靠方法

本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥...

一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

提供了一种对拟南芥（Arabidopsis...

高通量、稳健且高度时间灵活的拟南芥种子表面灭菌方法

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。...

通过表皮表型评分鉴定参与气孔发育的基因 via

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

本文介绍了一种先进的工具，用于监测拟南芥（Arabidopsis）幼苗去黄化早期阶段的叶绿素生物合成过程。该新方法可实现高空间和时间分辨率的非侵入式实时叶绿素荧光成像。...

早期阶段叶绿素生物合成动力学的无创检测方法 拟南芥 去黄化

本实验方案描述了拟南芥（Arabidopsis...

发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

学习种皮床品检测技术，探索胚乳如何调控拟南芥种子萌发。该方法通过体外实验揭示光信号等环境因子对休眠种子萌发的遗传调控机制，为植物发育生物学研究提供重要工具。

一种利用种皮基质培养法进行遗传学研究的实验方法体外胚乳如何调控种子萌发拟南芥

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一种利用种皮基质培养法进行遗传学研究的实验方法 体外 胚乳如何调控种子萌发 拟南芥

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