通过使用 ¹³C-葡萄糖的DNA稳定同位素示踪法鉴定广食性昆虫Spodoptera littoralis肠道中具有代谢活性的细菌

以下实验的总体目标是详细阐述一种高效的方法，用于在系统发育上表征昆虫肠道中具有代谢活性的细菌。该方法首先向昆虫饲喂 C 13 标记的葡萄糖，以使肠道内代谢活跃细菌的 DNA 发生同位素富集。下一步是提取肠道中细菌群落的 DNA。

第三步是分离出代谢活跃物种所掺入的碳13标记的DNA。随后通过焦磷酸测序对其中存在的物种进行系统发育鉴定和定量，从而确定昆虫肠道中构成该群落的代谢活跃细菌种类。

因此，多细胞生物的肠道是一种巧妙的进化产物，旨在利用微生物的代谢能力来分解或溶解复杂的有机物，使其最终可作为昆虫宿主的营养物质。为了理解这一系统，我们首先需要分析其中存在哪些微生物，其次需要明确这些微生物各自具有哪些代谢功能。在获得这些数据之后，我们便能够重建降解微生物与昆虫宿主之间代谢物及降解产物的流动过程。

该方法有助于我们解答微生物生态学领域的关键问题，特别是这些微生物与其宿主之间的相互作用方式。通过这一方法，我们可以更深入地了解、阐明并确定这些微生物为其宿主所发挥的功能。尽管该方法能够揭示肠道细菌总体的活性状态。

通过追踪葡萄糖中的碳标记，该方法也可应用于其他碳源，例如标记纤维素以鉴定参与海洋营养物质消化过程的活性细菌。将卵保持在室温下的烧杯、鸡蛋和培养皿中，直至其孵化。随后将新孵化的幼虫转移至洁净的塑料盒中，在23至25摄氏度条件下，采用长日照周期（16小时光照和8小时黑暗）的人工饲料饲养。数天后，从饲养盒中选取9至15条健康的二龄幼虫，分别转移至含有新鲜C13葡萄糖的独立培养皿中。

每种处理需准备至少三个重复，每个重复包含三头幼虫，并在人工饲料中添加目标物质。对照组幼虫应饲喂含有与天然食物（如棉花）相同含量的天然葡萄糖的人工饲料。在接下来的24小时内。

频繁更换人工饲料。首先用软头镊子将幼虫转移至蒸馏水中，以去除较大的碎屑。然后将其转移至新的洁净培养皿中，以麻醉并杀死昆虫。

将它们放在冰上，然后在冷藏箱中将温度降至零下五摄氏度。接着用70%乙醇对死亡的昆虫进行消毒，并将其浸入PBS中以备解剖。工具也必须用70%乙醇清洁。

从左右两侧的外骨骼开始进行切口。从头部开始，至肛门结束。移除整个外骨骼、马氏管和脂肪体。

然后用从其他组织中分离出的肠道替换缓冲液，再打开肠道。根据科学问题的不同，对整个肠道或中肠、后肠等区段进行处理。

将肠道组织不带 PBS 转移至一个小的无菌管中，并存放在冷冻器中。在进行 DNA 提取前，根据组织大小，使用真空浓缩仪在 45 摄氏度下干燥样本 30 至 90 分钟。接着，使用无菌塑料研杵研磨干燥的组织，以利用土壤 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。

然后使用分光光度计测定最终洗脱DNA的浓度。通过使用细菌通用引物27F和1,492R进行诊断性PCR扩增，验证是否成功从昆虫肠道中提取到微生物宏基因组DNA。取5微升每种PCR产物，在300伏、115毫安条件下于1%琼脂糖凝胶中电泳约20分钟进行检测。

扩增片段的正确大小为1.5千碱基。将每个实验重复对应的提取DNA合并，分别保存含有和不含C13葡萄糖的样品。

调整DNA浓度，确保每个样本在其文库中贡献相等。用于超速离心的DNA终浓度应为500至5,000纳克。在无菌的15毫升螺旋盖离心管中，使用分光光度计重新确认预期浓度。

制备梯度介质。将定量的 DNA 与 4.8 毫升氯化铯溶液混合，然后加入 6 毫升梯度缓冲液补足体积。

小心将混合物转移至5.1毫升超速离心管中。使用注射器和针头将液体加至管颈底部，避免产生气泡或引入空气。每次运行至少包含一个不含DNA的空白梯度管。

作为参考梯度，选择成对的离心管，并将其平衡至相差不超过10毫克。为每根离心管加盖管盖，并通过倒置离心管并用手施加适度压力，确保其无泄漏。使用具有八个孔位的近垂直转子。

根据制造商的说明，仔细密封转子孔并将其装入超速离心机中。在真空条件下，以 50,000 RPM 的转速、20 摄氏度离心 40 小时，以沉淀 DNA。选择最大加速度，且减速过程不使用刹车。

两天后，使用镊子小心地从离心机转子中取出试管。将试管放入试管架中，避免扰动已形成的梯度，并立即进行后续处理。首先使用850微升/分钟的流速平衡高效液相色谱仪。

然后将超速离心管固定在夹具架上，用连接注射器的23号一英寸针头刺穿离心管底部。小心地用控液针头刺穿管顶，以防止扰动样品形态、密度梯度，建议事先进行练习，以确保成功完成PSA操作。接下来，将连接泵管路的针头插入离心管顶部无液体的区域，并直接从底部收集液滴至无菌的1.5毫升微量离心管中，每30秒收集一管，每管收集425微升。

在此示例中，从每个梯度中收集12个组分。接下来，使用分析天平测定每个分离组分的密度。随后参照文本方案进行24小时的DNA回收和焦磷酸测序。

在ssop幼虫的饮食中添加了10毫摩尔的C13葡萄糖。在对照昆虫的食物中加入了等量的普通葡萄糖。随后从昆虫肠道菌群中提取了DNA。

在电泳凝胶上，基因组DNA在顶部形成一条明显的条带，表明DNA提取成功，并通过诊断性PCR确认。使用细菌通用引物显示存在细菌DNA，随后对具有代表性的SIP梯度样品直接进行定量焦磷酸测序，以揭示物种的系统发育谱系及其相对丰度。共获得120,045条高质量序列读长，平均长度为404个OTU。

焦磷酸测序谱显示，与对照组相比，标记样本中某些物种的丰度增加，包括肠球菌属（enterococcus）和泛菌属（panto）。因此，这些细菌被认为具有代谢活性，值得进一步研究。因此，在进行该实验操作时，重要的是要记住在CYP分析中设置适当的对照。

因此，这将消除背景和毛发闪光中污染的影响，确保观察到的细菌多样性与丰度的变化并非样品自身造成的假象。通过采用本实验步骤或类似荧光原位杂交等方法，可进一步回答其他科学问题。在该情况下，将重点关注细菌在昆虫肠道内的定位及其空间分布情况。