的代谢活性细菌在通才的肠道鉴定海灰翅夜蛾通过DNA的稳定同位素探测使用 ¹³ C-葡萄糖

以下实验的总体目标是详细说明一种用于系统遗传学表征昆虫肠道中代谢活跃细菌的有效方法。这是通过首先将 C 13 标记的葡萄糖喂给昆虫以同位素富集其肠道中代谢活跃细菌的 DNA 来实现的。下一步是提取肠道中存在的细菌群落的 DNA。

第三步是分离出代谢活性物质的 DNA，其中掺入了 C 13。然后通过热释测序对 DNA 进行系统发育鉴定和定量存在的物种。从而识别构成昆虫肠道中存在的群落的代谢活跃细菌种类。

因此，多细胞生物的肠道是一项巧妙的发明，它利用微生物的代谢能力来溶解或溶解复杂的有机物，使其最终可以作为昆虫宿主的营养物质。要了解这个系统，我们必须首先分析谁在那里，其次谁有哪些代谢活动。如果我们有这些数据，我们就可以重建降解微生物和昆虫宿主之间的代谢物和降解产物的通量。

这种方法可以帮助我们回答微生物生态学领域的关键问题，特别是这些微生物与宿主相互作用的方式。从这个意义上说，我们可以了解更多，并阐明和定义这些生物体为宿主服务的功能。虽然这种方法可以提供对一般活跃肠道细菌的了解。

通过跟踪 ucle 葡萄糖，还可以对其他碳源进行跟踪，例如标记 cellose 以识别参与 ocrant 营养物质消化过程的活性细菌。保持 op liters，鸡蛋和培养皿增加室温直到它们孵化。然后将新孵化的幼虫转移到一个干净的塑料盒中，在 23 至 25 摄氏度的人工饮食中饲养它们，长时间的白天，16 小时的光照和 8 小时的黑暗，几天后将 9 到 15 只健康的二龄幼虫从饲养箱转移到含有新鲜 C 13 葡萄糖的单个培养皿中。

加标人工饮食，每次处理至少需要 3 只幼虫的 3 个重复。使用提供与棉花等天然食物来源相同量的天然葡萄糖的人工饮食来喂养对照组。在接下来的 24 小时内。

经常更新人工饮食。首先用软镊子将幼虫转移到蒸馏水中，以去除大碎屑。然后转移到一个新的干净培养皿中，麻醉并杀死昆虫。

将它们放在冰上，然后在冷却器中将温度降至零下 5 摄氏度。然后用 70% 乙醇对死昆虫进行消毒，并将它们浸入 PBS 中进行解剖。工具还必须用 70% 乙醇清洁。

从沿右侧和左侧的角质层切口开始。从头部开始，到肛门结束。去除整个外骨骼、马里小管和脂肪体。

然后在打开肠道之前用与其他组织分离的肠道更换缓冲液。处理整个肠道或肠、中肠或后肠的切片。取决于科学问题。

将不含 PBS 的肠道组织转移到一个小的无菌管中，并将它们储存在冰箱中。提取 DNA 之前，根据组织的大小，在 45 摄氏度的真空浓缩装置中将样品干燥 30 至 90 分钟。接下来，使用无菌塑料 Pele 粉碎干燥的组织，以使用土壤 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。

然后使用分光光度计测定最终逃脱的 DNA 的浓度。通过使用细菌通用引物 27 F 和 1， 492 R.制备诊断 PCR 测定，验证从昆虫肠道中成功提取微生物宏基因组 DNA。在 1% agros 凝胶上以 300 伏特和 115 毫安的电压运行 5 微升每种 PCR 产物，持续约 20 分钟。

扩增子的正确大小为 1.5 kb。将与每个实验重复相对应的提取的 DNA 一起提取。将含 C 13 葡萄糖和不含 C 13 葡萄糖的蛋白分开。

对 DNA 浓度进行标准化，以确保每个样品对其混合液的贡献相等。终浓度为 500 至 5， 000 ng DNA 的 DNA 适用于超速离心过程。使用分光光度计在无菌 15 毫升螺口盖管中仔细检查预期浓度。

设置渐变介质。将定量的 DNA 与 4.8 mL 氯化铯溶液混合。然后用 6 mL 梯度缓冲液加满体积。

小心地将混合物转移到 5.1 ml 超速离心管中。使用注射器和针头将管子填充到他们的脖子底部，避免泵送或形成任何气泡。每次运行中至少包括一个不含 DNA 的空白梯度。

要用作参考梯度，请选择成对的试管并将其平衡到 10 毫克以内。为每根管子贴上管顶剂，并通过倒置管子并用手施加适度的压力来确保它们无泄漏。使用具有 8 个孔的近垂直转子。

小心密封转子孔，并按照制造商的说明将转子装入超速离心机中。在 20 摄氏度下以 50， 000 RPM 的速度在 20 摄氏度下离心 DNA 40 小时。选择最大加速度和不制动的减速度。

两天后，使用镊子小心地从离心机转子中取出试管。将它们放在架子上，不要干扰形成的梯度，并立即处理试管。首先，使用 850 μL/min 的流速平衡 HPLC。

然后将超速离心管连接到夹架上，并用连接到注射器的 23 号 1 英寸针头刺穿管底。因此，请用控制矿工小心地刺穿管子的顶部，以防止干扰形状、梯度和事先练习，以确保 PSA 运动成功。接下来，将连接到泵管的针头插入没有液体的管顶部，并将底部的液滴直接收集到无菌的 1.5 毫升微量离心管中，每 30 秒收集一次馏分，每次馏分 425 微升。

在此示例中，从每个梯度中收集 12 个馏分。接下来，在分析天平上测量每个分离馏分的密度。查阅文本方案 24 小时，继续进行 DNA 回收和焦磷酸测序。

在 ssop 升的饮食中补充 10 毫摩尔 C 13 葡萄糖。幼虫。将等量的正常葡萄糖添加到对照昆虫的食物中。接下来，从昆虫肠道的细菌群落中提取 DNA。

在电泳凝胶上，顶部的强基因组 DNA 条带证实了 DNA 提取成功，即诊断性 PCR。使用细菌通用引物显示细菌 DNA 的存在，直接在代表性 SIP 梯度上进行定量焦磷酸测序，以揭示物种谱系及其相对丰度。总共生成了 120， 045 个高质量读数，平均长度为 404 个 OT。

焦磷酸测序谱显示，与对照组相比，标记样品中某些物种（包括肠球菌属和 panto）的丰度增加。因此，这些细菌被认为具有代谢活性，值得进一步研究。因此，在尝试此过程时，请务必记住在 CYP 分析中加入适当的控制。

因此，这将减去背景的影响，头发闪光中的污染，并确保细菌的多样性和丰度的出现或消失不是质量本身的伪影。遵循此程序或荧光原位杂交等方法，可以使用和执行以回答其他问题。在这种情况下，将负责昆虫肠道内细菌的定位和排列。