Name: 膳食持续时间作为衡量啮齿动物的奥体非感知反应的指标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解如何通过测量进食时长来评估啮齿动物的颌面部疼痛。该方法利用计算机化喂食模块连续监测大鼠的进食行为，无需限制动物活动即可定量分析TMJ关节炎或牙髓暴露引起的疼痛反应。

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在此模型中，大鼠或小鼠可自由获取食物和水 随意德克萨斯州A&amp;#38;M大学贝勒牙科学院机构动物护理和使用委员会批准了所有实验方案。以下特定设置以斜体显示，专用于大鼠颞下颌关节炎模型。小鼠也可用于此模型，也可采用其他牙齿疼痛及肌源性口面部疼痛动物模型42,43.
1. 软件设置
<ol>
	<li>将饲喂单元的动物监测软件加载到计算机上。</li>
	<li>通过点击图标打开动物监测软件，在文件菜单中选择&#34;配置&#34;下拉选项。</li>
	<li>在&#34;动物监测配置&#34;窗口中，取消勾选名为&#34;饲料丸投放输入&#34;的复选框（图1A）。 
	注意：此选项默认情况下通常在出厂时已勾选。请取消选择该选项。一旦研究者取消此选项，系统将根据饲料丸从食槽中被移除的时刻记录结果，而非根据饲料丸被投放的时刻记录。 
	注意：当&#34;自动文件命名&#34;复选框被勾选时，软件将自动为文件命名（图&#160;1A）。该选项默认情况下通常在出厂时已勾选。</li>
	<li>设置定时灯光在06:00（早上6:00）开启，在20:00（晚上8:00）关闭。 
	注意：饲喂单元的硬件已进行改装，箱体内的灯光不再由软件控制，而是连接至一个独立的24小时&#160;定时器。因此，在这些示例中，配置软件上显示的&#34;环境灯&#34;功能无效。</li>
	<li>选择“编辑”下拉菜单并选择“实验”。此时将出现标题为&#34;Box 01 -&#34;的窗口（图&#160;1B）。</li>
	<li>在此窗口中输入用于保存数据的文件名。 
	注意：若未输入文件名，软件将自动为数据文件命名。可在该窗口中添加实验详细信息，并随数据文件一同保存。窗口中的信息也可保存下来，供后续实验使用。</li>
	<li>在名为&#34;实验时长（天）：&#34;的输入框中输入一个大于实验总时长的数值。 
	注意：这将确保软件持续保存数据直至实验结束。若该值设置过小，可能导致软件在动物仍处于饲喂模块中时提前停止数据记录。</li>
	<li>在名为&#34;每日小时数&#34;的输入框中输入24。 
	注意：该时长可根据实验者的具体需求进行调整。</li>
	<li>在名为&#34;进餐周期结束标准（分钟）：&#34;的框中输入10。 
	注意：对于大鼠，根据先前研究48，进餐定义为以10分钟无取食行为作为进餐结束的标准（即&#160;一次进餐前后均存在至少10分钟未取食饲料丸的间隔），且本软件包中设定的最小进餐量为每餐3粒饲料丸。</li>
	<li>在名为&#34;饲料丸大小（mg）&#34;的框中输入45。&#160;若使用者使用小鼠，则在此窗口中输入20。</li>
	<li>对于大鼠，向饲喂器分配仓中添加45 mg的啮齿类动物饲料丸。 
	注意：对于小鼠，向饲料仓中添加20 mg的啮齿类动物饲料丸。</li>
	<li>在实验窗口的&#34;阶段&#34;部分，在&#34;名称&#34;字段中输入“日”，在&#34;小时数&#34;字段中输入24（图1B）。 
	注意：在&#34;阶段&#34;部分下方有两个较大的空白区域。第一个大空白区域将填充此前在&#34;阶段&#34;和&#34;名称&#34;字段中输入的文本。</li>
	<li>下一个大空白区域将显示&#34;日周期阶段&#34;标题。在名为&#34;名称&#34;的字段中输入“光照”，在名为&#34;百分比&#34;的字段中输入60。 
	注意：所输入的文本将填充下方的大区域。</li>
	<li>接着在名为&#34;名称&#34;的字段中输入“黑暗”，在名为&#34;百分比&#34;的字段中输入40。&#160;注意：根据这些设置，一天中60%的时间将被划分为光照期，40%的时间将被划分为黑暗期。软件在计算进餐模式时将使用此信息。这些设置通常适用于维持在14:10明暗循环下的雌性动物。</li>
	<li>选择&#34;将所有箱体设置为此模式&#34;按钮。保存此信息后点击“确定”。</li>
	<li>&#34;启动箱体&#34;界面出现后，选择要激活的饲喂器并点击“确定”（图&#160;1C）。</li>
	<li>随后将出现动物监测运行时窗口，显示进餐模式数据（图&#160;1D）。 
	注意：通过此窗口监测并记录&#34;投放饲料丸数量&#34;，以评估大鼠当前的健康状况。一只体重约300 g的健康雄性大鼠每天通常会摄入300–800粒&#160;45 mg的饲料丸。</li>
	<li>系统每天生成并自动保存扩展名为.CSV的文件。打开这些文件可获取进餐模式数据，如摄食量、进餐次数、进餐持续时间、进餐量或餐间间隔。这些进餐模式的统计间隔可按全天计算，也可按日内的某一阶段（如黑暗期或光照期）计算。如上所述，当前设置对应14:10的明暗循环。每粒饲料丸从食槽中被移除的具体时间点的原始数据也会被记录为原始.CSV&#160;文件。 
	注意：在软件的旧版本中，生成.CSV文件的计算过程未采用最小进餐量为3粒饲料丸的限制。&#160;此外，若使用旧版软件计算平均进餐持续时间，需从.CSV文件中“平均进餐持续时间”列的数值中减去10分钟。 
	软件运行期间，操作者可手动选择“文件”下拉菜单，并每日选择&#34;保存原始数据&#34;。这将保存24小时周期内的原始数据，而非整个实验期间的数据。用户可自行决定使用其他软件处理这些原始数据。 
	注意：在本研究展示的结果中，我们使用了其他软件，并纳入了每餐至少3粒饲料丸的最小进餐量标准。</li>
</ol>
2. 进食时长检测
<ol>
	<li>将单只大鼠放入配备有光束计算机激活颗粒饲料喂食器的隔音室内。 
	注意：这些喂食装置内配有刻度饮水瓶和接粪盘，接粪盘中放置一张厚吸水纸。在喂食器的料斗中，可为大鼠添加45 mg的啮齿类动物颗粒饲料，或为小鼠添加20 mg的颗粒饲料。饲料颗粒被送入一个V形喂食槽中，槽底部设有光束传感器。当颗粒落入槽内时会阻断光束而被检测到。一旦大鼠将颗粒从喂食槽中移走，光束即恢复，此信号会触发计算机投放下一颗饲料。光束恢复的同时也会触发计算机记录日期和时间，并持续累计已投放的饲料颗粒数量。该累计数据随后可通过Med Assoc. Inc.软件进行分析，以确定在一天中任意时段的摄食量、进餐次数、进餐持续时间、每餐食量或餐间间隔。此外，原始的.CSV&#160;数据文件也可由外部软件进行分析39,40,49-51。</li>
	<li>记录大鼠摄取的饲料颗粒总数、饮水量以及动物体重，以评估实验期间大鼠的整体健康状况。</li>
	<li>每日清洗饮水瓶并更换新鲜饮水，根据需要向喂食器料斗中补充饲料。</li>
	<li>每日倾倒接粪盘及其下方的厚吸水纸，并使用高压空气每日吹除喂食器活动部件上的灰尘。 
	注意：必须佩戴个人防护装备（例如&#160;防护服、手套、口罩和面罩）。</li>
	<li>实验结束后，取下笼底板、接粪盘和饮水瓶并进行清洗。同时，需手动或使用洗碗机清洗喂食电子元件，但应避免将其与其他笼具一同清洗。</li>
</ol>
3. 颞下颌关节炎的诱导
<ol>
	<li>实验前至少4天将动物放入饲喂器中。 
	注意：该数据将作为实验前天数记录，以获得基础摄食行为数据。随后将动物从饲喂器中移出进行处理。一种处理方式是诱导颞下颌关节炎。在此模型中，大鼠经异氟烷（5%流速）麻醉后，在08:00（即&#160;光照期开始时）向每侧颞下颌关节周围关节腔双侧注射完全弗氏佐剂（CFA）。</li>
	<li>将250 mg CFA溶于50 L，双侧对称注入每侧颞下颌关节周围关节腔。 
	注意：在示例（图&#160;2）中，每侧颞下颌关节注射250 mg CFA溶于50 L，但剂量低至10 mg、体积小至15 μl时，在较短时间内也有效52。</li>
	<li>对照组大鼠的颞下颌关节注射50 L的0.9%生理盐水。注意：所有动物在麻醉诱导后5分钟或更短时间内即可活动。若CFA剂量较小且注射体积较少，则对照组大鼠应接受相同体积的生理盐水。</li>
</ol>

无任何披露内容。

伴有口面部疼痛的颞下颌关节紊乱（TMJ）患者在咀嚼时间延长时报告疼痛加剧，即个体咀嚼时间越长，咀嚼周期也随之延长45,53-56。我们的行为学检测方法可用于大鼠和小鼠进餐持续时间的类似评估39。一项近期未发表的研究提示，与进餐持续时间测量相比，von Frey纤维丝测试具有更高的敏感性，能够更长时间地显示显著变化；但von Frey纤维丝测试可能包含反射性反应成分，而进餐持续时间的测量则需要中枢神经系统区域的参与处理。因此，尽管von Frey纤维丝测试的敏感性可能更高，但其反应可能部分反映了一种反射机制。然而，使用具有中枢作用的药物进行治疗可改变纤维丝测试的结果，表明该检测方法也反映了中枢疼痛处理的某些方面57。
在摄食持续时间实验中，应每天监测所分配的颗粒总数。雄性大鼠通常会摄入400–800粒45 mg的颗粒，而雌性大鼠会摄入300–600粒。如果每日颗粒数量低于这些典型值，实验人员应检查喂食装置；若从食槽中取出一粒颗粒时，颗粒分配器掉落了5粒颗粒，则靠近颗粒料斗（不在食槽内）的颗粒传感器可能积尘，需要清洁。尽...

动物模型已被用于研究与口面部损伤或炎症相关的疼痛和伤害感受1,2，但合适的动物模型的缺乏导致对相关机制的理解尚不完整。尽管现有的模型有助于我们理解急性与慢性口面部疼痛中的多种机制，但这些动物模型仍存在各自的优点与局限性。
许多模型仅在短时间内测量行为性伤害感受反应。面部理毛是面部神经受压后已知的行为反应3。其他研究测量了在向颞下颌关节（TMJ）或嘴唇注射福尔马林后，动物使用同侧前肢或后肢摩擦面部以及头部抽搐的行为4-7。头部回缩潜伏期是另一种测量伤害感受行为的模型，该模型使用改良的尾部甩动镇痛仪，在对大鼠剃毛后的须垫施加热刺激后，定量评估其伤害感受反应（即&#160;头部回缩）8。在向TMJ注射谷氨酸后，二腹肌和咬肌的活动也已被记录作为疼痛的相关指标9。另一项研究通过测量睡眠参数的变化来评估患有TMJ炎症的雄性和雌性大鼠的伤害感受反应，这些参数包括入睡潜伏期、快速眼动（REM）睡眠时间、非REM睡眠所占百分比以及REM睡眠所占百分比10。大多数用于测量行为性伤害感受反应的动物模型仅在较短的时间范围内进行，即&#160;每天数分钟至数小时11-14。此外，大多数动物实验在光照期进行，而对于大鼠等夜行性动物而言，这可能引起应激反应，从而干扰伤害感受的检测结果15-18。上述检测方法可在不同的口面部条件下测量伤害感受反应，但持续时间较短，因此仅适用于研究急性疾病。另一种检测方法采用面部表情作为中等持续时间伤害感受的评估指标，但该方法可能具有主观性19。
为了评估持续性或慢性的口面部伤害性感受，一些研究者采用 von Frey 纤维丝作用于皮肤表面，以检测接受神经压迫或颞下颌关节（TMJ）炎症处理的动物的机械敏感性3,20。Liverman et al. 2009 年通过向大鼠咬肌注射 CFA 后，使用分级单丝纤维测量其回缩反应21,22。Yamazaki et al.&#160;2008 年将 CFA 注射至颞下颌关节内，随后在14天内定量分析了针对颞下颌关节区域施加的机械、热或冷刺激所引发的伤害性行为。然而，这些伤害性行为检测方法需要对动物进行固定，可能引发应激激素释放、学习效应或其他替代行为，从而干扰测量结果。
用于测量牙齿伤害性感受的模型通常利用下颌张开反射，但该方法可能不可靠23或不精确24。已有研究采用肌电图活动来测量牙齿伤害性感受25，但该方法通常要求动物处于无意识状态，尽管有研究在自由活动的大鼠中开展了牙齿伤害性感受的检测26。2008年，Khan利用一种高灵敏度的应变仪研究了牙科伤害性感受与咀嚼功能之间的关系27，但这种咬合持续时间模型需要限制动物的正常活动28。咬合力是衡量人类牙齿疼痛的可靠指标，但由于大鼠在测量咬合力时需要训练和/或固定，会引入应激源，从而可能导致生理学意义存疑的研究结果29-31
通过使用操作性设计来评估伤害性感受行为，可以克服某些限制性和应激性实验的局限性。其中一种操作性模型利用动物对不适温度的回避行为来评价和表征口面部伤害性感受32-35。该奖励冲突模型基于甜味牛奶作为奖励，促使啮齿类动物主动将面部接触加热或冷却的热探头34,36。然而，该测试需要对动物进行训练，但其优势在于数据可通过自动化方式采集。&#160;
另一种动物模型则以伤害性刺激引起的啃咬功能障碍作为口面部伤害性感受的指标37。然而，在该模型中，啮齿类动物被限制在一根管内，其唯一的逃脱方式是啃咬穿透过一根木棒以离开。该模型的一个优点是能够测量小鼠在急性或慢性下颌损伤后下颌功能的变化。然而，由于动物被限制在管内，会产生干扰性的竞争行为，i.e.&#160;即逃避行为，这种行为会带来应激，从而可能影响伤害性感受检测的结果。
进餐持续时间已被用于测量颞下颌关节炎38-41、牙髓暴露42以及肌肉损伤43动物模型中的伤害性感受。经历口面部伤害性感受的大鼠在开始进餐后进食速度会变慢。患有颞下颌关节疼痛的患者咀嚼食物所需时间也更长，而当颞下颌关节疼痛减轻时，咀嚼周期会缩短44-46。当存在颞下颌关节疼痛时，进餐时间延长被认为是&#34;保护性行为&#34;，在操作上将其定义为伤害性感受行为47。
进食时长通过一种非侵入性方法测量颞下颌关节伤害性感受，在雄性和雌性大鼠中可连续监测长达19天，在雄性小鼠中可达6天（已测试的最长时间），可被描述为伤害性感受的一种生物学标志物38-41支持摄食时间可衡量伤害性反应的观点，药理学干预可减轻伤害感受，从而使动物的摄食时间恢复至正常水平38,40,41这一点在使用辣椒素破坏伤害性感觉神经元后也得到了证实；神经破坏后，向颞下颌关节内注射CFA不会延长动物的进食时间40。
以下是获取和统计分析进餐持续时间数据的实验方案。

<table><tbody><tr><td>动物监测软件</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SOF-710</td><td>East Fairfield, VT</td></tr><tr><td>无尘精密颗粒饲料，啮齿类动物用，谷物基&amp;nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>45 mg 颗粒，每盒 50,000 粒</td></tr><tr><td>无尘精密颗粒饲料，啮齿类动物用，谷物基&amp;nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>FO163</td><td>20 mg 颗粒</td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂</td><td>Chondrex, Inc.</td><td>7001</td><td>不再提供 5 mg/mL 浓度。&amp;nbsp; 可使用其他来源的完全弗氏佐剂，前提是研究者始终使用同一来源</td></tr></tbody></table>

以摄食持续时间作为啮齿类动物口面部伤害性反应的测量指标

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

进餐时间延长可用于测量与人类口面部疼痛时保护性行为相似的口面部机械性痛觉过敏。为测量进餐时间，将未受束缚的大鼠持续饲养在隔音的、配备计算机化喂食模块的环境中数天至数周，以记录其摄食行为。这些隔音箱配备有饲料颗粒分配器。分配器具有一个颗粒槽，槽底部设有光束传感器；当啮齿类动物从喂食槽中取走颗粒时，光束不再被遮挡，从而向计算机发出信号，触发投放下一颗颗粒。计算机记录颗粒被取走的日期和时间，研究者可据此数据计算进餐参数。在计算进餐参数时，进餐的定义基于先前研究，设定为10分钟（即当动物连续10分钟未进食，则视为本次进餐结束），同时设定最小进餐量为3颗颗粒。随后，软件可根据操作者指定的任意时间段自动计算进餐持续时间、进餐次数、食物摄入量、进餐量及餐间间隔。在可计算的摄食参数中，进餐持续时间已被证实是雄性大鼠、小鼠以及雌性大鼠口面部伤害感受的一种连续、无创的生物学标志物。进餐持续时间的测量具有定量性，无需训练或对动物进行干预，需要皮层参与，且不会与其他实验诱导的行为产生竞争。这些特点使该检测方法区别于其他用于记录口面部伤害感受的操作性或反射性方法。

进食持续时间是口面部疼痛的行为相关指标，该指标已应用于颞下颌关节炎（图2）和龋齿（图3）动物模型的研究。在一项实验中，大鼠经注射高剂量（250 mg）完全弗氏佐剂（CFA）后诱发颞下颌关节炎，该处理导致进食持续时间显著延长，持续达19天（图2）。向每侧颞下颌关节注射较低剂量CFA（10 mg）仅引起进食持续时间轻微增加，且持续时间仅为2-3天52，表明在此进食持续时间检测中，CFA的作用具有剂量依赖性。进食持续时间可反映口面部区域的伤害性感受反应，但无法检测膝关节内关节炎所引发的反应（图2）。
在另一项实验中，进餐持续时间也被用于检测牙髓暴露大鼠的伤害性反应（图 3）。牙髓暴露会导致牙齿腐烂，是人类牙痛的模型42。其他摄食模式，如食物摄入量、进餐次数和每餐食量，其变化程度较小且持续时间较短，表明这些摄食模式作为伤害性反应的检测指标不如进餐持续时间敏感39</su...

进食时间延长代表了啮齿类动物类似于人类口面部疼痛时保护行为的口面部伤害性行为。进食是一种无需训练或动物操作的行为，需要大脑皮层的参与，并且不会与其他实验诱导的行为产生竞争，这使得该检测方法区别于其他反射性或操作性测量方法。

延长进食时间可用于测量与保护性行为相似的口面部机械性痛觉过敏程度的增加……

本实验的总体目标是确定进食持续时间的测量结果可作为下颌和牙齿疼痛的定量相关指标。首先将大鼠放入饲食笼中，以获取其进食持续时间的基础值。在获得基础值后，向颞下颌关节或膝关节注射致痛剂，后者作为对照。注射后，将动物放回饲喂笼中，观察其摄食行为，直至恢复至基线水平。最终，通过收集和分析数据表明，下颌疼痛的动物进餐时间更长。利用进餐持续时间和进餐模式来分析啮齿类动物模型中的疼痛具有诸多优势，但我们认为该模型相较于其他类型模型的两个主要优势在于：无需束缚动物，也无需对动物进行训练。几年前，我们注意到在动物模型中尚无良好的方法来测量口面部疼痛。这促使我们探索利用进食模式分析来评估口面部疼痛的可能性。由此发展出了我们目前所采用的用于测量口面部疼痛的模型。进食时长研究在配备有计算机控制的颗粒喂食器的隔音室内进行，该喂食器可将45毫克的啮齿类动物饲料颗粒添加至食斗中。这些颗粒被分配到下方装有光束的槽中，光束开口处覆盖有玻璃盖片，以防止颗粒物阻挡其路径。当大鼠从食槽中取走食丸后，光电束恢复，计算机接收到信号并释放另一颗食丸。通过这种方式，食丸始终可供获取，动物无需额外努力。装满水瓶后，将吸水纸放置在下方的废液盘中。首先，启动动物监测软件，从下拉菜单中选择“配置”以设置饲喂单元。取消勾选“饲料丸发放”输入框，以记录饲料丸从料槽中被移除的时间，而非发放时间。接下来，勾选“自动文件命名”框，以自动命名文件。从编辑下拉菜单中选择实验选项后，在新窗口中输入文件名，以确保数据被正确采集。在实验时长（天）输入框中输入一个超过实验总时间的数值。接下来，将每天小时数设置为24，以用于进餐时段和判定标准。输入 10 分钟的值。在名为“沉淀物大小毫克”的框中输入 45。在实验窗口的阶段部分，将“天”一词填入名称字段，并在小时数字段中输入相应数值。以24为例。在“天相”标题下，将“light”输入名称字段，并在百分比字段中输入60。接着重复此操作，将“dark”输入名称字段，百分比值设为40。接下来，选择“全部选中”此类按钮。保存此信息，然后点击“确定”。当“开始运行”界面出现时，选择需要激活的进样器，然后点击“确定”。随后将出现动物监测运行窗口，显示摄食模式数据。在观察完基础摄食行为后，将动物从饲食器中取出，以诱导颞下颌关节炎疼痛。麻醉后，定位颞下颌关节，并将完全弗氏佐剂注射到关节腔内。在另一侧重复此操作。对照组大鼠注射 50 µL 的 0.9% 生理盐水。另一组动物在膝关节注射 CFA。注射后，动物一旦从麻醉中恢复，立即将其放回饲喂装置。在进食时长检测期间，持续监测关节炎大鼠的摄食行为，直至其进食时长恢复至基线水平。恢复时间可能为1至19天，具体取决于CFA的剂量。此前配置的软件设置将记录在检测期间特定时间段内分配的颗粒数量。每天清洗并更换水瓶，并向饲料斗中添加饲料。必要时，为获得最佳效果，应每天更换吸水纸。每天使用高压空气吹去槽体和进料器活动部件上的灰尘，并擦拭盖玻片使其清洁。若发现光束路径受阻，应及时清洁。研究结束后，取下并清洗所有笼具组件。系统每天生成文件，并自动打开这些文件以获取进食模式数据，例如食物摄入量、进餐次数或进餐持续时间。或者，可根据本实验研究者的需求，使用专有软件计算进食模式。与注射生理盐水的动物或在膝关节注射CFA的动物相比，CFA诱导的颞下颌关节炎疼痛大鼠在19天内表现出进餐持续时间显著增加。该方法也可应用于其他形式的口腔疼痛，如本实验所示。在经历牙髓暴露后疼痛的大鼠中，进食持续时间也有所延长。在使用该方法时，有两点可能需要每天进行排查和优化。当使用体重约为300克的Sprague Dawley大鼠时，它们每天应摄食约300至600粒饲料颗粒。如果摄食量少于300粒，则可能是饲喂器单元顶部的传感器存在问题，通常只需清洁即可。如果摄食量超过600粒，则可能是饲料槽内的传感器需要清洁。因此，在进行该检测时，您只需记住这两点即可。在研究口面部疼痛时，进食模式分析模型相较于其他模型具有多项优势。该模型涉及皮层通路，因而并非仅仅测量反射机制。该模型可全天候使用，且不会引发其他行为变化。因此，该模型在研究口面部疼痛方面成为一种非常强大的工具。

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