使用 1D 和 2D ¹H NMR 测定肽-金属配合物的结构和配位

该程序的总体目标是确定与铜复合的 Metallo 伴侣蛋白模拟肽的结构。这是通过首先在无氧环境中制备样品来实现的。第二步是获取显示氢原子之间相互作用的核磁共振或 NMR 波谱数据。

接下来，将空间相互作用映射到线性肽模板上。最后一步是找到适合数据的代表性低能量结构。最终，NMR 衍生结构用于确定结合模式并对铜结合复合物进行结构分析。

与 X 射线晶体学等现有技术相比，该技术的主要优点是，您可以使用它来观察每周的结合复合物，也可以观察未结晶的分子和复合物。尽管这种方法可以提供对铜结合蛋白的见解。它还可以应用于其他系统，例如其他金属 CHAP，以研究蛋白质如何在细胞系环境中安全递送必需但可能有毒的金属离子。

首先，在无氧环境中制备样品以防止铜氧化以制备 APO 样品，将大约 1 至 2 毫克肽溶解在 450 至 500 微升氘代 NMR 级溶剂中，对于铜反应样品，溶解与 APO 肽相同量的 APO 肽，在 450 至 500 中溶解 EQU 摩尔量的金属盐。微升 NMR 溶剂使用中心玻璃过滤纸或任何其他适合所研究化合物且不会吸收它们的技术过滤每种溶液。这对于去除任何金属颗粒至关重要，因为金属颗粒会影响均匀性。

将溶液转移到 NMR 管中并关闭管中的样品。在离开手套箱之前，从手套箱中取出样品并密封。在 NMR 机器中记录 APO 和铜反应样品的一维质子谱并进行比较。

APO 肽具有柔韧性，并显示平均确认数，但在与铜反应时，结合的肽酰胺具有更坚硬的结构。因此，含铜肽谱应显示酰胺区化学位移的显著变化，并且峰可能会分辨。在文本方案中描述的相同条件下设置优化的、舒适的毒理、多管闲事或玫瑰色的 NMR 实验，并按顺序运行。

在每次实验之间运行一维实验，以确保样品组成在整个数据采集过程中保持不变。按照文本协议中讨论的数据处理后，准备一组叠加在 noea 和 rosy 光谱上的 cozy 和 to 光谱。分配谱图中的所有 NOE 峰。

首先分配与指纹区域中的 toxis 信号重叠的峰。由于这将有助于使用 Sparky 程序记录后续的峰分配条目，因此分配的峰将 H α 到 酰胺蛋白偶联值转换为达合角。此外，通过集成程序中的峰值并使用已知距离的交互来转换它们，将峰值转换为距离约束。

如果峰重叠或无法使用自动积分方法，则可以通过目测估计将峰标记为强、中、弱或非常弱，并且这些名称可以分别转换为高达 2.5、3.5、4.5 和 5.5 埃的距离。导入距离约束和解压角度，并采用正确的格式进行探索。Explore 将搜索确认空间以查找符合规范化学几何的结构。

除了实验发现的距离约束外，还可以生成一个不违反这些参数的系综。这将构成起始集合。在不对金属使用任何约束的情况下执行第一次结构测定运行，以找出哪些残基参与金属结合而没有任何偏差。

逐步引入约束，以便于识别分配中的错误以及文本协议中描述的 NOE 能量和模拟跪姿参数，然后使用共轭梯度能量最小化结构进行 4， 000 次迭代，创建一个通常由 50 名成员组成的最终集合，以迭代方式在整个集合上执行约束引入，报告找到的每种类型的 NOE 交互的数量。最后，创建一个符合规范化学几何和经验 NMR 衍生约束报告的结构集合。确认总数，违反 NM Rived 约束和整个系综的 RMSD 的确认数，包括主干和所有重原子 RMSD 值。

分析低能量系综并确定哪些残基侧链彼此正确接近，以便能够结合金属离子。确定这些后，重复分析，包括铜结合数据。除了 NMR 导出的距离约束外，现在还为确定的残基添加了金属结合约束。

添加适当的参数来描述金属离子及其拓扑。在参数文件中输入适当的物理信息，例如与其他原子的质量键长、角度和非键合排斥参数。将绑定信息添加到拓扑文件中。

此信息包括形成和断开的键，以及由于绑定而更改的正式费用。最后，像以前一样获得一个结构集合，解出的集合代表肽采用的确认空间。在 NMR 测量期间，将结构的所有确认导入 Mal Mall 程序，以创建一个起始集成。

检查系差以确定分子的局部稳定性。通过选择序列上的后续四个残基区域并让程序将 RMSD 计算到最低能量结构或平均值来确定主链和侧链 RMSD 值，通过将局部 RMSD 绘制为序列的函数来确定分子的哪些区域显示出局部稳定性，沿分子的这个区域覆盖集成并使用该集成进行进一步分析。选择符合 NMR 衍生约束条件的低能量确认。

这些将形成低能耗集成记录，并报告集成中的确认数量、选择确认的标准和 RMSD 值。如果尚未确定金属结合模式，请分析低能量系综并确定哪些残基侧链不正确。彼此接近才能结合金属离子。

使用 KYMERA 确定怀疑金属结合的原子之间的分子内距离。确定这些距离后，计算融合中的平均距离。重复分析，包括铜结合数据。

使用 MAL mall 程序的默认搜索参数检查系集成并确定分子内的局部二级结构。接下来，将 ensemble 导入 kymera。二级结构由氢键保持，并指示分子的稳定区域。

使用 kymera 工具确定氢结合。按照文本协议中的详细说明继续结构分析。然后总结所有结构发现，揭示它们如何相互加强 为了研究铜结合蛋白模型，通过溶液态 NMR 确定衍生线性肽中蛋白质的保守结合序列的结构，肽的酰胺区从 6.7 到 8.5。

PP M 在与铜反应后膨胀至 6.6 至 9.0 PP M.由于轻微的铜氧化，谱线展宽在基线中很明显。这里显示的是 Roy Toxi 的指纹区域和铜结合肽的舒适光谱的叠加图。样品随时间稳定，谱图分辨良好，并给出了 81 次 NOE 相互作用，这些相互作用是通过玫瑰实验获得的。

由于分子在 NO C 实验中产生的 NOE 相互作用几乎为零，因此为反应样品衍生的肽系综，但对金属没有限制，在 50 个非结构中给出了 47 个，主链和重原子的 RMSD 值分别为 1.44 和 2.07 埃。从这 13 个低能量构象异构体中选出进行进一步分析，主链原子和重原子的 RMSD 值分别为 0.25 和 0.61 埃。局部 RMSD 图显示了残基 3 和 7 之间的稳定区域除了刚性 C 末端区域（包括 prolene 残基）外，在所有确认中，该区域还存在于残基 4 和 7 之间的弯曲确认中。

通过骨架供体和受体甘氨酸 5 和 3 anine 2 以及半胱氨酸 6 和半胱氨酸 3 之间的氢键来稳定弯曲确认。这种弯曲在胱氨酸 3 和正弦 7 中也很明显，因为该区域的偶联值降低。将确认叠加在该区域，并在将胱氨酸 3、胱氨酸 6 和蛋氨酸 1 视为潜在结合残基时分析可能的结合残基。

最短的硫与硫原子的距离是在半胱氨酸 3 和半胱氨酸 6 的叶酸基团之间，引入铜结合并重复计算以得到用于分析的集合。铜结合肽的低能量系综表明末端胺靠近结合的铜。这里显示的是静电电位分布等值面，正电位以蓝色显示，负电位以红色显示。

精氨酸残基从肽的主链延伸出来，形成静电电位的正叶，而主链碳产量排列成一条线，形成不太突出的负静电电位。一旦掌握，就可以在大约一周的 NMR 时间和另外几天的检查中完成结构测定，以获得可用于结构分析的一组确认。按照此程序，可以分析其他肽变聚体和不同的条件，以回答解决铜离子不同程度结合和释放所需条件的其他问题。