Name: 在纯化造血干/祖细胞识别DNA突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解利用LacI转基因小鼠模型在纯化造血干/祖细胞中识别DNA突变的体内诱变检测方法。该技术可分析自发及基因毒物诱导的突变频率与类型，为遗传毒性研究提供可靠工具。

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我们感谢 David R. Rodriguez（文学硕士）在本文的平面设计和摄影方面提供的帮助。本研究得到了 GCCRI、美国国立卫生研究院衰老研究所（NIH/NIA，项目编号：5R21AG033339）以及癌症中心支持基金（P30CA054174）对德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校（UTHSCSA）流式细胞术核心设施和高级核酸核心设施的资助。

在C57BL/6遗传背景下，LacI转基因小鼠的白细胞不表达Sca-1（图1）。因此，如果使用Sca-1作为细胞纯化的标记物，则需要将这些小鼠与适当的品系杂交以获得Sca-1表达；在本方案中，采用普通C57BL/6（B6）小鼠与LacI（C57BL/6）转基因小鼠（LacI）杂交产生的F1代小鼠（图1）。在本方案所用的细胞群体中，LSK细胞和CMP细胞在骨髓中所占比例最小。为了每次分选至少纯化出2 × 105个细胞，若仅从后肢收集骨髓，则需合并约十只小鼠的骨髓；若同时使用髋部、前肢、脊柱和胸骨的骨骼，则至少需要四只小鼠。
将骨髓和脾脏制成单细胞悬液。少量骨髓直接使用，大部分用于分离纯化LSK细胞及分化中的髓系祖细胞。 即&#160;通过荧光激活细胞分选（FACS）分离CMPs和粒细胞/单核细胞前体细胞（GMPs）。骨髓细胞的分离及这些细胞群体的FACS纯化方法在其他文献中已有描述。30-32大约需要进行六次独立分选，才能识别出不同群体间突变频率的显著差异。
以下用于测量自发性的实验方案 体内 根据多个Stratagene说明书改编的纯化造血亚群中突变频率检测方法33-35，基于 Kohler 的原创工作 等18&#160;现有方案之间最关键的差异33-35 当使用相对少量细胞时，本方案在蛋白酶K孵育所用的试剂体积、时间及温度上有所差异。
1.&#160;样品保存
收集所需细胞群体后，将细胞分装至1 ml离心管中（每份细胞数量参见表1）。在4 °C条件下，以266 × g离心7分钟。小心吸除上清液。将离心管放入液氮中冷冻5分钟，然后转移至-80 °C冰箱中以备后续使用。样品可保存至少6个月。
2.&#160;基因组DNA的提取
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出样品。向样品管中加入 500 μl 冰冷的 DNA 裂解缓冲液（表 3）。在中等速度下涡旋振荡管子 3–5 秒，并将管子置于冰上 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 12 分钟。小心弃去约 450 μl 上清液。短暂离心 3–5 秒，使管壁残留液体沉降至管底。使用玻璃毛细管小心吸除剩余上清液。将管内壁空气干燥至无可见液滴（约 2 分钟）。</li>
	<li>向 100 μl DNA 消化缓冲液（表 3）中加入 2 μl RNace-It 核糖核酸酶混合液和 10 μl 1 M DTT。根据待处理样品数量按比例调整体积；每份样品需使用 20 μl 此 DNA 消化液。将 20 μl 该溶液加入细胞沉淀后，轻轻敲击管壁（可用手指或笔），尝试使沉淀从管底脱落。 
	注意：由于细胞数量较少，可能难以观察到沉淀。</li>
	<li>向每个样品中加入 20 μl 蛋白酶 K 溶液*（表 3），再次轻轻敲击管壁。 
	*注意：使用前应将蛋白酶 K 溶液在 50 °C 水浴中预热 2 分钟&#160;，以激活酶活性。</li>
	<li>立即将管子放入 50 °C 水浴中。根据 表 1 中的指南进行样品消化。每隔 10 分钟轻轻敲击管子一次。 
	注意：由于细胞数量极少，水浴温度和消化时间对于成功获得高质量基因组 DNA 至关重要。</li>
	<li>在冷室中准备 DNA 透析系统（图 2）。将 600 ml TE 缓冲液（表 3）倒入一个 600&#160;ml 玻璃烧杯中，加入一个小磁力搅拌子，以便在透析过程中持续搅拌缓冲液，并让（孔径 0.025 mM）透析膜漂浮于缓冲液表面。每份样品使用一片透析膜；单个透析烧杯中可同时使用 1–4 片膜。用剪刀在膜边缘做标记，以区分不同样品。</li>
	<li>在完成适当时间的消化后，小心地将此时极为黏稠的基因组 DNA* 加入漂浮透析膜的中央（图 2）。立即用铝箔覆盖烧杯。在 4 °C 条件下透析约 16–20 小时，并持续轻柔搅拌缓冲液。 
	*注意：处理高黏性 DNA 溶液时，应使用带有宽口的移液器吸头。</li>
	<li>次日，将 600 ml 新鲜配制的 TE 缓冲液（表 3）倒入洁净的玻璃烧杯中，用勺子&#160;小心地将透析膜转移至新烧杯中，并用铝箔覆盖。继续透析 2 小时。</li>
	<li>用勺子从含 TE 缓冲液的烧杯中取出透析膜，仅将 DNA 溶液中最黏稠的&#34;团块&#34;转移至新的无菌 1&#160;ml 管中。将样品储存在 4 °C。可在次日或最长 1.5 个月内继续进行诱变分析。对于纯化后的细胞群体，至少需等待 1 周后再进行后续操作。</li>
</ol>
3.&#160;托盘的准备工作 E.&#160;coli/噬菌体培养（第1天）
每个培养皿将包含两层不同的凝胶：底部为琼脂层，顶部为含有X-gal的琼脂糖层。 E. coli将向后者加入噬菌体溶液。分离出的细胞数量和类型将决定所需培养皿的数量。请查阅 表1 用于计算本实验步骤所需的托盘数量以及相应溶液的用量。以下方案将制备约60个托盘，可由一名有经验的人员轻松处理。
<ol>
	<li>配制以下培养基：
	<ol>
		<li>对于底层，准备 6 x 2&#160;L 锥形瓶，每个含 1,600 ml&#160;ddH₂O2O. 加入NZY粉末（21 g/L）和琼脂（15 g/L），充分混匀。</li>
		<li>对于上层，准备 4 x 1&#160;L 型烧瓶，每个装有 800 ml&#160;ddH₂O2O. 加入NZY粉末（21 g/L）和琼脂糖（7.2 g/L），充分混匀。</li>
		<li>用于培养 大肠杆菌 将2.5 g NZY粉末加入2个250 mL的容器中&#160;毫升&#160;烧瓶并定容至100 ml&#160;使用 ddH₂O2O</li>
		<li>步骤8所用确认平板的制备：向1 L的NZY培养基中加入8.4 g NZY粉末和6 g琼脂&#160;L 锥形瓶，并加液体至 400 ml&#160;用ddH₂O2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用铝箔封住烧瓶口，充分混匀后于121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。</li>
	<li>从高压灭菌锅中取出烧瓶（非常烫！），小心旋转摇匀以混合琼脂和琼脂糖，然后将烧瓶置于50 °C水浴中。当水浴温度再次达到50 °C时，从2&#160;L型烧瓶（步骤3.1.1）每个培养皿中加入约150 ml NZY琼脂（底层）。</li>
	<li>在室温下静置琼脂至少 2 小时使其凝固，然后倒置并打开培养皿。将培养皿底部置于盖子上，偏心 45° 放置（图3）并室温干燥30分钟。盖上培养皿，于室温下闭封过夜。</li>
	<li>同时，准备 SCS-8 大肠杆菌 培养过夜。从一个&#160;两个250&#160;毫升&#160;烧瓶*（步骤 3.1.3），取 5 ml&#160;NZY肉汤（表3）并转移至无菌的14&#160;毫升离心管。加入62.5 μl麦芽糖/MgSO₄4 溶液中加入10 μl的SCS-8 E. coli 甘油菌种保存液。37 °C 培养 3–4 小时&#160;在250–300 rpm振荡条件下培养。取15 μl该培养物接种至95 ml NZY肉汤中（置于250 ml&#160;毫升&#160;侧管&#160;烧瓶），过夜培养&#160;在37 °C摇床培养箱（250-300 rpm）中 
	*注意：另一个250 ml锥形瓶可在后续必要时用于调整菌液的OD（步骤4.1）</li>
	<li>取1&#160;L 锥形瓶中加入琼脂（步骤 3.1.4），并向每个 60 mm 培养皿中倒入约 6–7 ml NZY 琼脂&#160;mm 培养皿（此用量约为 50 个培养皿所需，用于步骤 8）。静置使琼脂凝固（约 10 分钟），然后倒置并用塑料膜包裹。这些培养皿可在 4 °C 保存最多一个月。</li>
</ol>
4.&#160;托盘的准备工作 E. coli噬菌体培养（第2天）
<ol>
	<li>使用分光光度计检测SCS-8 E. coli 培养物（步骤3.5）的光密度。用NZY培养基（表3）（步骤3.1.3）将OD600调整至0.6，并将锥形瓶置于冰上以停止生长，使用前一直保持在冰上。该培养物将用于步骤6.3和8.2。此培养物可在4 °C下保存5天。</li>
	<li>将所有测定板（前一天倒好）在空气中&#160;干燥约5小时&#160;（图3）。</li>
</ol>
5.&#160;基因组DNA的包装（第2天；继续）
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出所需数量的橙色 Transpack 管，置于干冰上直至使用；每个包装反应取一根橙色 Transpack 管。正确标记每根管子。将基因组 DNA 样品（步骤 2.9）提前置于冰上备用。</li>
	<li>本步骤应逐管进行，完成一管后再处理下一个 DNA 样品。快速解冻一根橙色管*注释1：用手握住直至大部分解冻，然后立即置于冰上。取对应的基因组 DNA 样品，立即转移 8–12 μl 样品*注释&#160;2,3 至橙色管中。通过轻柔吹打 3 次以及轻弹管壁混合内容物。混合时尽量避免产生气泡。将管子放入 30 °C 水浴中孵育 90 分钟。 
	*注释 1：可短暂离心以收集管壁和管盖内侧的液体。 
	*注释 2：加入样品的体积取决于用于制备该样品的细胞数量：由 2.0–5.0 × 105 个细胞制备的样品取 11–12 μl；由 1.0 × 106 个细胞制备的样品取 10 μl；由 1.5 × 106 个细胞制备的样品取 8 μl。 
	*注释 3：DNA 仍具有高黏性；吸取时应将移液枪头插至样品管底部，并沿管内壁小心旋转枪头以助吸取。</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出 1 或 2 根蓝色 Transpack 管*，置于干冰上暂存。快速解冻后，向每根橙色管中加入 12 μl。通过轻柔吹打 3 次混匀溶液。短暂离心 2–3 秒，再轻弹管壁以进一步混匀，立即放回 30 °C 水浴中继续孵育 90 分钟。 
	*注释：5–6 个反应使用 1 根蓝色管，10–12 个反应使用 2 根蓝色管。</li>
	<li>90 分钟后，每管反应液加入 970 μl SM 缓冲液*（表 3）以终止反应，中速涡旋 5 秒。将管子放回冰上备用。 
	*注释：若细胞数量 ≤ 5 × 105，则使用 500 μl SM 缓冲液（表 3）终止反应；之后可将 2&#160;管（同一来源样品）合并（步骤 6.4）。</li>
</ol>
6.&#160;基因组DNA涂布（第2天；继续）
<ol>
	<li>关闭早晨为干燥而打开的倒置培养皿。为每个样品的培养皿贴上标签。</li>
	<li>将4.8 g X-gal溶解于16.8 ml N,N-二甲基甲酰胺中（步骤6.5所需）。立即搅拌并置于摇床平台上。避光保存。溶液应在20–30分钟内变为澄清。</li>
	<li>分装 SCS-8 E. coli 细胞。对于每组托盘*，使用一个50&#160;毫升锥形管。用包装好的DNA样品名称标记该管。加入2毫升 大肠杆菌 每个托盘的悬浮液。 
	* 注意：例如 3 x 105 GMP要求一套8个托盘（参见 表1因此，两个等分试样需要 8 × 2 = 16 个托盘。将等分试样分开存放，分别准备两个 50&#160;毫升离心管，每管8 × 2 = 16毫升 E. coli 悬浮液</li>
	<li>将1 ml*包装好的DNA样品（来自步骤5.4）加入相应的50&#160;含SCS-8的ml离心管 E. coli 分装并充分混匀。孵育此混合物 E. coli在37 °C、250-300 rpm的摇床培养箱中孵育/噬菌体混合物&#160;23 分钟 
	*注意：如果从 ≤ 5 x 10 的细胞中提取了 DNA5 细胞，使用500 μl SM缓冲液终止反应（步骤5.4）。在此步骤中，可将各离心管中的样品合并，并加入一个50&#160;毫升锥形管</li>
	<li>当 E. coli/噬菌体混合物正在孵育时，开始准备顶层琼脂糖层。向每管800 μL中加入5 mL X-gal/N,N-二甲基甲酰胺溶液（步骤6.2）。&#160;将 X-gal 加入 50 °C 保温的顶层琼脂糖溶液（来自步骤 3.1.2）中，终浓度为 1.5 mg/ml。加入琼脂糖后，X-gal 可能会轻微沉淀，轻轻摇动使其溶解，并将瓶放回 50 °C 水浴中。</li>
	<li>取 E. coli从培养箱中取出噬菌体混合物（步骤6.4）。每个样品需要多个培养皿；每个培养皿需要50 ml X-gal/琼脂糖溶液（步骤6.5）。为每个样品倒入所需体积的X-gal/琼脂糖溶液即 50 ml × 培养皿数量）置于较大的无菌塑料瓶中，并加入适量的 E. coli/噬菌体混合物。轻轻旋转瓶子以混匀。将混合物分装为每份45-50 ml，分装至50个&#160;毫升锥形管。所需管子的数量应与该样品所需的托盘数量相同。 
	注意：剩余的X-gal/琼脂糖溶液将用于步骤8.3。该溶液可保存在50 °C水浴中，待后续使用。</li>
	<li>将50 ml顶层琼脂糖混合液倒入检测培养皿的下半部分。通过轻微倾斜培养皿，迅速铺匀琼脂糖。 
	注意：琼脂糖会迅速冷却，导致无法在托盘上铺展。因此，此步骤需迅速操作，并使用保持在 50 °C 的琼脂糖。</li>
	<li>让顶层琼脂糖凝固至少15分钟。然后倒置并打开检测板，使其风干30分钟&#160;(图3).</li>
	<li>关闭培养皿，将检测培养皿倒置（底层琼脂面朝上），于37 °C孵育15–16小时。培养皿堆叠数量不得超过5个。</li>
</ol>
7.&#160;假定突变频率的测定（第3天）
<ol>
	<li>从37 °C培养箱中取出培养皿，使其冷却。计数每个培养皿上的半透明噬斑形成单位（PFU）；在培养皿上随机选择两个位点，绘制一个2.5 x 2.5 cm2或5 x 5 cm2的方格*，并使用细胞计数器对每个方格内的所有PFU进行计数（图4A, B）。 
	*注：绘制方格时可使用如图5所示的工具。若计数的PFU数量≥40，则使用较小的方格；否则使用较大的方格。</li>
	<li>取所计方格的平均PFU数，若使用小方格则乘以96；若使用大方格则乘以24。将同一样本所有培养皿的PFU计数结果相加，得到该样本产生的PFU总数。</li>
	<li>接下来，计数每个培养皿中的突变噬斑。此时培养皿已冷却，有助于识别突变噬斑。为进一步便于观察蓝色噬斑，可将培养皿移至红色和/或白色背景上；红色和白色纸张效果良好。用记号笔圈出所有蓝色噬斑。记录每个突变体蓝色染色的形态和强度（例如&#160;完整、圆形、扇形；图4C）36,37。</li>
	<li>通过将突变PFU数量（步骤7.3）除以总PFU数量（步骤7.2），计算每个样本的推测突变频率。</li>
</ol>
8.&#160;假定突变噬斑的验证（第3-5天）
<ol>
	<li>使用巴斯德移液管，挑取每个突变体（蓝色）噬菌斑，并将凝胶块转移至250 μl无菌SM缓冲液中表3。加入 25 μl 氯仿，涡旋振荡 5 秒&#160;并在 4 °C 下保存，以在第二天继续实验，或放置 2 小时&#160;在室温下静置，待确认突变PFU确为突变体后，再进行下一步操作。样品可在4 °C保存至少1年。</li>
	<li>标记一&#160;1&#160;毫升和一&#160;4&#160;每个被封口的突变株对应一个无菌离心管。在新的1&#160;1 ml 离心管中，用无菌 SM 缓冲液将从琼脂块中释放的重悬噬菌体按 1:50 稀释（取 2 μl 样品加入 100 μl SM 缓冲液中）表3)), 轻微涡旋，暂置一旁。向 4&#160;在无菌离心管中加入 200 μl SCS-8 E. coli 培养物（来自步骤 4.1）和 2 μl 对应稀释后的噬菌体&#160;1.5 mL 离心管，37 °C 孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>向每个4中加入2.5 ml含X-gal的顶层琼脂糖（步骤6.6剩余）&#160;1 mL离心管，轻轻涡旋混匀，然后倒入预先制备的60 mm NZY琼脂平板（步骤3.6）。静置10分钟&#160;（使顶层琼脂糖凝固），倒置培养皿并过夜培养&#160;在 37 °C。</li>
	<li>次日早晨，取出培养皿&#160;从培养箱中取出，并确定每皿中蓝色噬斑形成单位（PFUs）的比例&#160;(图6当70%或更多的噬斑形成单位呈蓝色时，即可确认该突变为已确认突变38,39从培养皿中挑取突变噬菌斑&#160;并放入1.5&#160;毫升带螺口盖的离心管，内含 250 μl SM 缓冲液（表3）和 25 μl 氯仿；现可进行测序。</li>
	<li>当蓝色噬斑形成单位（PFU）的比例为50%或更低时，不被视为真正的突变体38,39当蓝色蚀斑形成单位（PFU）的频率在60-70%之间时，需回查记录中关于蚀斑形态的描述；若PFU的形态为 &#34;完整&#34;，继续进行测序。</li>
</ol>
9.&#160;对 LacI G基因进行突变测序
<ol>
	<li>在25 μl反应体系中设置PCR反应，包含1.5 μl斑块上清液（模板，步骤8.4）、正向引物SF1（5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3'）和反向引物SR2（5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'）。按照生产商说明书使用PCR扩增Taq DNA聚合酶试剂盒。循环条件如下：94 °C预变性2 min，随后进行35个循环，每个循环为94 °C变性20 sec、60 °C退火20 sec、72 °C延伸2 min，最后72 °C终延伸5 min。</li>
	<li>取每份反应产物5 μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增结果。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用Augencourt纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。</li>
	<li>定量模板DNA。</li>
	<li>以约100 ng的PCR产物作为测序用模板DNA。使用相同的PCR引物作为测序引物，对扩增子进行双向测序（见上文）。</li>
	<li>拼接测序结果，并与LacI参考序列40进行比对，以检测突变。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明&#160;不存在相互竞争的经济利益。

本文所述的体内诱变检测方法基于Kohler et al.18最初构建的LacI转基因小鼠模型。该模型利用携带lacI报告基因的λ噬菌体载体。cos位点位于载体两侧，可实现载体的简便回收，并随后包装成具有感染性的噬菌体颗粒，用于感染E. coli。若被噬菌体感染的E. coli中含有发生突变的LacI基因，则会形成蓝色噬菌斑。蓝色噬菌斑出现在无色背景之上，从而极大简化了突变体的计数工作。通过DNA测序技术可确定所发生突变的位置和类型，这有助于进一步研究诱变的潜在机制。
我们对该诱变检测方案所做的改进使其可用于经FACS纯化的造血细胞群体。然而，我们发现，要获得足量的高质量DNA，可重复的分析仍需要至少2 × 105个造血细胞。由于长期重建造血干细胞（HSCs）的频率极低29，目前尚无法对这些HSCs进行诱变分析。本方案中使用的干细胞富集群体——LSK细胞，除包含Flk-2<su...

在大多数组织中，已分化的细胞寿命有限。为了维持组织的功能完整性，长寿的、组织特异性的干细胞会持续产生祖细胞，这些祖细胞进一步分化为执行该特定组织功能所必需的完全分化细胞。干细胞还通过一种称为自我更新的过程来补充自身群体。因此，干细胞负责维持其所处组织的功能完整性。正因如此，干细胞必须具备强大的机制来感知并可能修复受损的DNA。否则，它们可能会积累多种基因组（潜在有害的）异常改变，这些改变可遗传给其子代细胞。了解干细胞在整个生物体生命周期中如何保护其基因组的完整性是一个重要的科学问题，也有助于我们理解为何基因组不稳定性与癌症及其他一些年龄相关疾病相关（详见文献1,2的综述）。
在干细胞或早期祖细胞群体水平上维持组织的基因组完整性，可通过细胞死亡、衰老或分化来清除有缺陷的干细胞（或祖细胞），和/或通过高效修复受损DNA来实现。最近的研究表明，有可能直接在这些稀有细胞群体中检测某些类型的DNA修复过程3-6。研究发现，例如在造血系统中，DNA双链断裂可通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）进行修复，其中后者是一种保真度较低的修复方式，因而出错风险更高。这两种机制在造血干细胞（HSCs）中均存在4,5，但在小鼠中，HSCs主要依赖NHEJ，而早期祖细胞则使用HR4。在皮肤干细胞中也观察到了类似现象6。有趣的是，在人类HSCs中，双链断裂的首选修复机制似乎是HR而非NHEJ3。这种跨物种的功能差异究竟是真实的生物学差异，还是仅仅反映了技术或实验条件的不同，仍有待进一步验证。
干细胞修复受损DNA的能力可能还包括其他DNA修复机制，例如碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）。BER和NER负责修复单链DNA中的单个或多个碱基对损伤，而MMR则修复碱基-碱基错配以及插入/缺失环；这类DNA损伤无法通过NHEJ或HR机制进行修复。支持这一观点的多项研究来自造血系统，表明这些通路中任一通路的改变与造血干细胞（HSC）区室的异常之间存在关联7-9，并且会增加患骨髓增生异常综合征的风险10-16，该疾病起源于HSC，并随着疾病进展表现出基因组不稳定性逐渐增加的特点17。迄今为止，尚未见在HSC中直接检测BER、NER和MMR活性的报道。
除了在机制层面上阐明调控组织完整性的各种过程外，还必须能够测量突变DNA的程度，以便检验这些过程中某一过程发生异常所导致的后果，例如在正常干细胞与基因工程改造的干细胞之间，或在老年与年轻个体之间。然而，由于组织特异性干细胞数量稀少，且缺乏能够维持其&#34;干性&#34;的培养条件，开发相关检测方法十分困难。此外，此类检测方法还应适用于环境和遗传因素的操控。解决这些局限性和要求的一个可行方案是使用经过特殊基因工程改造、可用于检测DNA突变的小鼠模型。
已开发出多种用于突变检测的转基因小鼠模型。例如， LacI 转基因小鼠18 携带一种可回收的λ噬菌体载体，该载体编码 LacI 报告系统，其中的 LacI 基因编码一种抑制因子，可抑制 Lac 操作子，并作为突变报告基因。当发生突变时 LacI 基因，该 Lac 操纵子被激活，从而产生β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶可切割生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷），使其变为蓝色。 cos 侧翼位点 LacI 载体可通过λ噬菌体蛋白实现简便回收，并进一步用于感染 E. coli孵育感染后 E. coli 在含有X-gal底物的琼脂糖上，可对噬菌斑进行计数。蓝色噬菌斑含有假定突变体 Lac-I 携带噬菌体的为蓝色噬菌斑，而清晰的噬菌斑则含有非突变体。蓝色噬菌斑在清晰噬菌斑中的频率反映了原始细胞群体中突变体的频率，该DNA即提取自这一群体。此外，宿主为λ噬菌体的 LacI 靶标可通过PCR技术进行测序，适用于相对高通量的分析。对多个突变体进行测序 LacI 基因将揭示突变谱的重要信息，进而可能提示特定DNA修复通路的潜在缺陷或特定的基因毒性事件。 LacI 转基因系统已在多个实验室中实现标准化19 且试剂可商业获取。该方法的一个主要缺点是 LacI 系统的局限性在于检测大片段缺失或重排的能力有限；因此，需要采用其他方法 例如 为弥补这一不足，需要在中期染色体铺展上使用多色荧光原位杂交（multi-color FISH）。
在 LacI 小鼠模型的 λ 噬菌体载体中，存在一个更小的基因 CII，可用于突变分析。由于其基因较小，且突变体可被筛选，因此该检测方法比 LacI 基因分析更省力且成本更低20。然而，LacI 基因在诱变研究方面更为深入21，且该基因对突变的敏感性已得到充分表征，因此对于哪些氨基酸残基能在显色底物上产生表型反应已有明确的认识22-25。
用于突变检测的其他小鼠模型包括使用ΦX174或LacZ转基因。ΦX174转基因小鼠模型通过最初的A:T→G:C回复突变检测方法26，或可检测一系列碱基对替换的正向突变检测方法27，其成本低于LacI模型。然而，正向突变检测中的突变筛选并不简单，且ΦX174转基因的突变谱不如LacI模型那样被充分表征。在携带LacZ转基因的小鼠模型中，LacZ突变报告基因的回收依赖于对半乳糖敏感并在含半乳糖培养基中生长的E. coli宿主细胞28。该系统的一个缺点是，LacZ靶标的回收还需经过限制性内切酶消化、连接以及E. coli宿主的电穿孔等步骤，因此难以适用于少量细胞的分析。尽管在处理干细胞/祖细胞群体时这并非绝对限制（可通过增加小鼠数量来弥补），但如果需要大量细胞（例如数百万个或更多），该方法将迅速变得不切实际且成本过高。此外，LacZ基因相对较大的尺寸虽然提供了高灵敏度的突变报告功能，但在DNA测序分析和突变谱确定方面却更为繁琐且成本更高。然而，该模型的一个主要优势在于其能够检测大片段缺失、插入以及染色体重排。
由于 LacI、ΦX174 和 LacZ 转基因小鼠模型的所有细胞均携带报告系统，因此只要能够可靠地分离并获得足够数量，这些小鼠模型中的任何一种均可用于检测任何目标细胞类型（包括干细胞和前体细胞）中的诱变作用。由于我们对 LacI 小鼠模型及 LacI 突变检测技术具有丰富的研究经验，因此决定进一步采用该系统对造血干细胞和前体细胞群体中的诱变作用进行分析。
造血组织在其各个组分的细胞表面表型方面已有充分表征，包括可长期重建造血的干细胞，这类干细胞可被识别为极为稀有的 Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK)/ Flk2-CD150+CD48- 细胞群体29。Mohrin et al.4 证明，LSK/Flk2- 细胞这一略大的群体在研究DNA修复时，仍可作为造血干细胞（HSC）的良好代表，并且与最原始的定向髓系祖细胞（CMP）群体存在显著差异。此外，当将富集HSC的LSK（Flk-2+ 和 Flk-2-）细胞与 Lin-IL7R-Sca-1-cKit++（LS-K 祖细胞）进行比较时，富集程度较低的干细胞富集型LSK群体与祖细胞之间在非同源末端连接（NHEJ）能力上仍存在显著差异5。在本研究中，我们采用富集HSC的LSK（Flk-2+ 和 Flk-2-）细胞，因为我们发现，在该诱变检测中要获得稳定可靠的结果，至少需要 2 × 105 个细胞；而若分选 LSK/Flk2-CD150+CD48 细胞群体，甚至仅分选 LSK/Flk2- 群体，在小鼠数量、成本和实际操作性方面都极难达到这一细胞数量。本方案基于Kohler et al.18 最初建立的方法，详细描述了如何测定LSK细胞、特定分化的髓系细胞群体，以及未经分离的骨髓和脾脏细胞中的自发性DNA突变频率。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;LacI &lt;/em&gt;转基因小鼠&amp;nbsp;</td><td>BioReliance 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RecoverEase DNA 提取试剂盒（包含 RNace-It 核糖核酸酶混合液）</td><td>安捷伦科技（Stratagene）</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Transpack 包装提取物，包括橙色和蓝色 Transpack 管以及 SCS-8 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>安捷伦科技（Stratagene）</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>DNA 分子量标准 &amp;ndash; λ DNA 阶梯</td><td>伯乐</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0.025 mM 孔径膜&amp;nbsp;</td><td>Fisher（Millipore）</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 生物测定培养皿（托盘）&amp;nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>NZY肉汤（粉末）</td><td>Fisher（Teknova）</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>罗氏</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增 Taq 聚合酶试剂盒</td><td>5 端</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 纯化试剂盒</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定dna突变

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

近年来，人们逐渐认识到基因组不稳定性与许多发育障碍、癌症及衰老过程密切相关。鉴于干细胞在维持组织稳态和终身修复中发挥关键作用，可以合理推测干细胞群体对于保持组织基因组完整性至关重要。因此，人们日益关注内源性和环境因素对干细胞及其子代细胞基因组完整性的影响，旨在阐明干细胞相关疾病的病因学机制。
LacI 转基因小鼠携带一种可回收的λ噬菌体载体，该载体编码LacI报告系统，其中LacI基因作为突变报告基因。当LacI基因发生突变时，会表达产生β-半乳糖苷酶，该酶可切割一种显色底物并使其变为蓝色。该LacI报告系统存在于所有细胞中，包括干细胞/前体细胞，并可被轻松回收后用于感染E. coli。将感染后的E. coli在含有合适底物的琼脂糖培养基上孵育后，可对噬菌斑进行计数：蓝色噬菌斑表示含有突变型LacI基因，而无色噬菌斑则含有野生型基因。蓝色噬菌斑（相对于无色噬菌斑）的频率反映了提取DNA的原始细胞群体中的突变频率。对突变的LacI基因进行测序可确定突变在基因中的位置及突变类型。
转 LacI 转基因小鼠模型已被广泛确立为一种 体内 诱变检测方法。此外，该检测所用的小鼠和试剂均可商业获得。本文详细描述了如何利用该模型检测造血系统中干细胞富集的 Lin-IL7R-Sca-1+cKit++（LSK）细胞及其他亚群中自发产生 DNA 突变的频率。

该 体内 突变检测实验是在大量事件（所有PFU）中测量罕见事件（突变PFU）。当使用少量细胞进行该实验时，结果可能受到假阳性与假阴性结果的显著影响。为解决此问题，我们采用来自三只不同动物的未分选骨髓细胞进行了系列稀释实验。利用1.4 × 106，7.0 × 105，3.5 × 105，以及 1.75 x 105 细胞。结果（图7) 显示输入细胞数量与产生的噬斑形成单位（PFU）数量之间存在线性关系。重要的是，无论使用较少或较多数量的细胞进行测量，突变频率均保持一致。尽管由于细胞数量有限而未直接验证，但没有理由认为这一情况不适用于LSK细胞和GMP细胞。
该诱变检测实验中最重要的步骤是基因组DNA的提取（步骤2）。虽然DNA浓度理想情况下应≥500 ng/μl，但本方案在40–150 ng/μl范围内同样效果良好。更为关键的是260/280比值（应为&gt;1.8–2.0）和分子量（应在300–500 kb左右）。对于不熟悉该检测的操作者，建议检...

本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。&#160;可通过分离 LacI 基因，确定自发产生或经基因毒素暴露后产生的DNA突变的频率、位置和类型。&#160;

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

近年来，基因组不稳定性与多种发育障碍、癌症及衰老之间的密切关联已逐渐明确。鉴于干细胞……

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在纯化造血干/祖细胞识别DNA突变

集落形成细胞（CFC）实验是一种体外实验，其中造血祖细胞在半固体培养基中形成集落。通过集落形态、细胞形态以及流式细胞术相结合的方法，评估祖细胞在不同造血谱系中增殖和分化的能力。...

人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。...

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

细胞中的体细胞突变模式反映了既往的致突变暴露，并可揭示发育谱系关系。本文介绍了一种对单个造血干细胞和祖细胞中的体细胞突变进行编目和分析的方法。...

表征人类血液的突变负荷与克隆组成

造血干细胞祖细胞（HSPCs）在血液形成过程中由于其代谢可塑性，会从静息状态转变为分化状态。本文介绍了一种优化的检测HSPCs线粒体呼吸和糖酵解的方法。...

造血干祖细胞代谢分析

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

了解利用LacI转基因小鼠模型在纯化造血干/祖细胞中识别DNA突变的体内诱变检测方法。该技术可分析自发及基因毒物诱导的突变频率与类型，为遗传毒性研究提供可靠工具。

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

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